PLoS ONE: Anthrachinon G503 induziert Apoptose in Magenkrebszellen durch die mitochondriale Weg

Abstrakt

G503 ist eine Anthrachinonverbindung von den sekundären Metaboliten einer Mangrove endophytischen Pilzes aus dem Südchinesischen Meer isoliert. Die vorliegende Studie beleuchtet die Anti-Tumor-Aktivität und den zugrunde liegenden Mechanismus der G503. Die Lebensfähigkeit der Zellen-Assay in neun Krebszelllinien und zwei normale Zelllinien durchgeführt, zeigten, dass die Magenkrebs-Zelllinie SGC7901 die meisten G503 empfindlichen Krebszellen ist. G503 SGC7901 Zelltod durch Apoptose induziert. G503 Belichtung aktiviert Caspasen-3, -8 und -9. Die Vorbehandlung mit dem Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK und Caspase-9-Inhibitor Z-LEHD-FMK, aber nicht Caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, schwächte die Wirkung von G503. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die intrinsische mitochondrialen Apoptoseweg, anstatt den extrinsischen Weg wurde in G503-induzierte Apoptose beteiligt. Darüber hinaus erhöhte G503, das Verhältnis von Bax zu Bcl-2 in den Mitochondrien und verringert das Verhältnis im Cytosol. G503 Behandlung führte zu einer mitochondrialen Depolarisation, Cytochrom c-Freisetzung und die anschließende Spaltung von Caspase -9 und -3. Darüber hinaus wird berichtet, dass das endoplasmatische Retikulum Apoptoseweg auch durch G503 durch Induzieren Caspase-4 Spaltung aktiviert werden kann. Unter Berücksichtigung der unteren 50% inhibitorische Konzentration für Magenkrebszellen, kann G503 als aussichtsreicher Kandidat für Magen-Krebs-Chemotherapie dienen

Citation:. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Anthrachinon G503 induziert Apoptose in Magenkrebszellen durch die mitochondriale Weg. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10.1371 /journal.pone.0108286

Editor: Javier S. Castresana, Universität von Navarra, Spanien

Empfangen: 19. April 2014; Akzeptiert: 19. August 2014; Veröffentlicht am: 30. September 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung: Diese Studie wurde von National Nature Science Foundation of China, Grant Nummer unterstützt wurde. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech-Sonderprojekt von China, Grant-Nummer: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Programm für Promotion-Station in der Universität, Grant-Nummer: 20120171110053, 20130171110053; Key Project of Nature Science Foundation der Provinz Guangdong, China, Grant-Nummer: 10251008901000009; Key Sci-Tech-Forschungsprojekt der Provinz Guangdong, China, Grant-Nummer: 2011B031200006; Guandong Natural Science Fund, Grant-Nummer: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-Tech-Forschungsprojekt von Guangzhou Gemeinde, China, Grant-Nummer: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programm für junge Lehrer in der Universität, Grant-Nummer: 10YKPY28; Changjiang Wissenschaftler und innovative Forschungsteam in der Universität, Anzahl:. 985 Projekt PCSIRT 0947. Die Geldgebern keine Rolle bei Studiendesign hatte, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Einführung

Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie sind die primären klinischen Tumorbehandlungen. Allerdings sind Operation und Strahlentherapie bei metastasierendem Krebs unwirksam; wenn Chemotherapie richtig verwendet wird, kann die Metastasierung gehemmt werden [1]. Im Hinblick auf die Anti-Krebs-Medikament Entwicklung sind Anthrazykline die effektivste Anti-Krebs-Medikamente [2]. Natürliche Produkte aus den Ozeanen sind wichtige Quellen für neuartige Anti-Krebs-Medikamente [3]. Marine Mikroorganismen Metaboliten mit einzigartigen Strukturen und pharmakologischen Wirkungen sind in der Regel als führende Anti-Tumor-Verbindungen eingesetzt [4]. Anthrachinonverbindungen, wie Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin und Mitoxantron, sind die wirksamsten klinischen Antikrebsmittel [2]. Die marine Anthrachinon SZ-685C unterdrückt die Proliferation von menschlichen Brustkrebs [5] - [6] und der menschlichen Nasen-Rachen-Karzinom (NPC) Zellen [7]. Huang et al. gezeigt, daß Anthrachinone aus Rhabarber, wie Emodin, Aloeemodin und Rhein, das Wachstum und die Vermehrung von verschiedenen Krebszellen, wie Lungenadenokarzinom, myeloischer Leukämie, Neuroblastom, Leberzellkarzinom, Blasenkrebs und andere [8] zu hemmen.

der Mechanismus der Antitumor-Aktivität von Anthrachinonen ist in den folgenden Aspekten in erster Linie beteiligt [9] - [10]: DNA-Wechselwirkungen durch Bindung, Einlagern und die Trennung des DNA-Doppelstrang zu stören; direkte Membraneffekte; DNA-Schäden in Reaktion II Inhibierung oder die Erzeugung von freien Radikalen, wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS), und die Induktion von Apoptose über Topoisomerase II Hemmung funktionelle p53 oder ROS Generation zu Topoisomerase. Zusätzlich Anthrachinone auch Apoptose durch die JNK auslösen (c-Jun N-terminal kinase) [11], Akt /PKB (Proteinkinase B) [5], [12] und mitochondriale Wege [13] - [14].

G503 ist eine Anthrachinonverbindung von den sekundären Metaboliten des Mangroven endophytischen Pilzes No. 1403 aus dem Südchinesischen Meer isoliert [15] .Allerdings, ob G503 Anti-Krebs-Potenzial als Anthrachinonverbindung besitzt wurde nicht untersucht. Daher wurde die vorliegende Studie, welche die Anti-Tumor-Aktivität von G503 und der zugrunde liegende Mechanismus beteiligt aufzuklären.

Materialien und Methoden

Chemikalien und Reagenzien

3- (4 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium Bromid (MTT) und ROS-Scavenger N-Acetyl-Cystein (NAC) von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erworben wurden. Hochest 33342, Carboxy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit und MitoProbe transition pore Assay Kit (M34153) wurden von Invitrogen (USA) erhalten. Annexin V-FITC (Fluoresceinisothiocyanat) /PI (Propidiumiodid) Apoptosis Detection Kit wurde von Keygen (Nanjing, Jiangsu, China) erworben. RPMI1640-Medium und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Hyclon (Logan, UT, USA ).
Caspase-8-Inhibitors Z-IETD-FMK, die Caspase-9-Inhibitor Z-LEHD-FMK und Caspase-Inhibitor-Familie Z-VAD-FMK waren von Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) und Beyotime (CHINA). Antikörper gegen Caspase-3, Caspase-4, Caspase-8, Caspase-9 und COXIV Antikörper wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antikörper gegen Cytochrom c
, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 und Anti-Ziege-LGG-HRP wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Maus anti-β-Actin und anti-GAPDH primären antibodywere von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase und Anti-Maus-IgG-Peroxidase wurden von Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria Isolation Kit von Pierce (Pierce, IL, USA) erworben wurde, Protein-Assay-Kit von Bio-Rad (Hercules erworben wurden , CA, USA) und die ECL-Nachweis-Kit wurden von Applygen Technologies Inc (Beijing, China).

Fermentation, Extraktion und Isolierung von G503 von Nigrospora
sp. Nr 1403

NO.1403 wurde von Totholz von Kandeliacandel
(L.) Druce und reidentified als Nigrospora
sp. (Genbank-Zugangsnummer: HQ891110), gesammelt von Mai Po, Hong Kong, und ein Salzsee in den Bahamas. G503 wurde isoliert und gereinigt aus den Sekundärmetaboliten von NO. 1403 [15]. Starterkulturen wurden auf cornmeal Meerwasser-Agar. Pfropfen aus Agar Mycelwachstum Stütz wurden geschnitten und aseptisch in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml flüssiges Medium (Glucose 10 g /l, Pepton 2 g /l, Hefeextrakt 1 g /l, NaCl _{2 g /L, pH D 7.0). Der Kolben wurde bei 28 ° C inkubiert. Nach 3-5 Tagen auf einem Rotationsschüttler Schütteln wurde das Mycel aseptisch in einen 500 ml Erlenmeyerkolben übertragen, um die Kulturflüssigkeit (200 ml) enthält. Der Kolben wurde dann für 25 Tage bei 28 ° C inkubiert.}

Die Kulturen (150 L) wurden durch ein Seihtuch filtriert. Das Filtrat wurde unterhalb von 50 ° C auf 5 l konzentriert und extrahiert dreimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Extrakte wurden auf einer Kieselgelsäule unterzogen und mit einem Gradienten aus Petrolether zu Ethylacetat eluiert, um die Verbindung zu ergeben.

Die Verbindung wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Stammkonzentration von 50 gelöst mmol /L und verdünnt auf bestimmte Konzentrationen vor der Verwendung

Zellkultur

HUVECs von den menschlichen Nabelschnurvenen-Schnüre der normalen Geburten und kultiviert nach einem Protokoll isoliert wurden zuvor beschrieben [16] -. [ ,,,0],17]. Chang-Leberzellen und Tumorzelllinien Schleifstein-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 und SGC7901 wurden AGS gepflegt von unserem Labor und in RPMI1640-Medium, supplementiert mit 10% FBS, 100 U /ml Streptomycin und 100 U /ml Penicillin (Gibco) bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2. Diese Studie entspricht den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki dargelegt, von der Medical Ethics Committee von Sun Yat-Sen-Universität genehmigt, und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von dem Spender erhalten.}

Zelllebensfähigkeitstest

Zellen in einer Dichte von 2 × 10 ^{4 Zellen /ml in 24-Well-Platten (HUVECs in mit Gelatine beschichteten 24-well Platten ausgesät wurden) ausgesät. Wenn die Zellen eine Dichte von 60% -70% erreicht, wurden sie für 48 h in RPMI 1640-Medium mit verschiedenen Konzentrationen von G503 behandelt (1 ml /Vertiefung) ohne FBS; Die negativen Kontrollgruppen wurden mit PBS behandelt. Anschließend wurden 100 &mgr; l MTT (5 mg /ml) wurde für weitere 4 h in jede Vertiefung und inkubiert in PBS gelöst zugegeben zur Bildung von formazancrystals zu ermöglichen. Die Kristalle wurden in 1 ml DMSO in jede Vertiefung solubilisiert. Die optische Dichte (OD) -Werte der purpurfarbene Lösung, die die Lebensfähigkeit der Zellen dargestellt wurden bei 570 nm gemessen, [18] - [19]. Nach drei unabhängigen Experimenten wurde das Überleben der Zellen unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Überleben (%) = (Mittelwert experimentellen OD-Wert /Kontrolle OD Mittelwert) × 100%. Die Werte wurden als 50% ige Hemmkonzentration (IC _{50) ausgedrückt, die durch die Regressionsmethode im linearen Bereich berechnet wurde.}}

Hoechst 33342 Färbetest

SGC7901 Zellen wurden ausplattiert in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 10 ^{5 Zellen pro Napf und mit G503-Konzentrationen von 0 &mgr; mol /L bis 40 umol /L für 24 h im Bereich behandelt. Die Zellen wurden mit 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] für 10 min bei 37 ° C markiert und beobachteten Fluoreszenzmikroskopie (Olympus X71-A12FL /PH).}

Annexin V-FITC /PI-Färbung Assay

SGC7901 Zellen wurden in einer Dichte von 5 x 10 ^{5 bis 5 × 10 gesammelte 6 /ml nach G503-Behandlung bei Konzentrationen im Bereich von 0 &mgr; mol /L bis 40 umol /L für 24 h in 6-Well-Platten; Zellen, behandelt mit 25 &mgr; mol /L Colchicin wurden als positive Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann gewaschen und gefärbt gemß den Anweisungen des Herstellers (Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit). Kurz gesagt wurden die Zellen in 500 &mgr; l 1 × Bindungspuffer resuspendiert. Als nächstes wurden 5 ul AnnexinV-FITC und 5 &mgr; l 20 &mgr; g /ml PI wurde 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur zu der Probe zugesetzt und inkubiert. Die gefärbten Proben wurden dann mittels Durchflusszytometrie (Becton Dickinson, NJ, USA) untersucht, um apoptotische Zellen identifizieren.}

Bestimmung der mitochondrialen Membranpotentials

SGC7901 Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Bei einer Dichte von 60% zu erzielen, wurden die Zellen für 18 h mit 20 &mgr; mol /L G503 behandelt und dann gesammelt, um das mitochondriale Membranpotential gemäß den Empfehlungen des Herstellers (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit) zu bewerten. Kurz gesagt, wurden 1 × 10 ^{6 /ml Zellen in 37 ° C PBS resuspendiert. Die positive Kontrollgruppen wurden für 5 min bei 37 ° C mit 1 &mgr; l 50 mmol /L CCCP vorbehandelt. Alle Gruppen wurden dann mit 5 &mgr; l von 10 &mgr; mol /L DiOC _{2 (3) für 30 min bei 37 ° C und bewertet durch Durchflusszytometrie behandelt. Das mitochondriale Membranpotential wurde auf der Grundlage der folgenden Gleichung berechnet:. Mitochondriale Membranpotential = (rote Fluoreszenzintensität) /(grüne Fluoreszenz-Intensität)}}

Erkennung die Öffnung der Mitochondrien permeability transition pore (mPTP)

SGC7901 Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Bei einer Dichte von 60% zu erzielen, wurden die Zellen mit 20μmol /L G503 für 18 h behandelt und gesammelt mPTP Öffnung mittels Durchflusszytometrie (Becton Dickinson, NJ, USA) nach dem Protokoll des Herstellers (MitoProbe Transition Pore Assay Kit) zu beurteilen. Kurz gesagt, wurde jede Probe in 3 Aliquots aufgeteilt und wie folgt behandelt: Aliquot 1 mit 5 &mgr; l 2 &mgr; mol /l Calcein AM im Dunkeln behandelt wurde; aliquoten 2 wurde mit 5 &mgr; l Calcein AM und 5 ul 80 mmol /l CoCl _{2 im Dunkeln behandelt; und aliquoten 3 wurde behandelt mit 5 &mgr; l Calcein AM, 5 &mgr; l CoCl 2 und 5 &mgr; l von 100 &mgr; mol /L Ionomycin. Die Aliquots wurden dann 15 min im Dunkeln bei 37 ° C inkubiert. Nachdem sie mit HBSS /Ca gewaschen ^{2+ und resuspendiert in 400 &mgr; l HBSS /Ca 2+ wurden die Zellen mittels Durchflußzytometrie innerhalb 1 h beurteilt. MPTP Öffnungszustand wird wie folgt berechnet: (Fluoreszenz Aliquot 2- die Fluoreszenz von aliquoten 3) /(die Fluoreszenz von aliquoten 1- die Fluoreszenz von aliquoten 3). Calcein AM dringt in das Zytoplasma und Organellen, einschließlich der Mitochondrien. CoCl 2 quencht Calcein AM Fluoreszenz im Zytoplasma, aber nicht in den Mitochondrien. Calcein AM in das Zytoplasma aus den Mitochondrien transloziert, wenn MPTP geöffnet wird, und die Fluoreszenz wird gedämpft durch CoCl 2.}}

Isolation von Zell Mitochondrien und Zytoplasma

SGC7901 Zellen wurden plattiert in 100-mm-Platten; Jede Gruppe wurde in zwei Platten plattiert. 60% -70% Konfluenz nach Erreichen wurden die Zellen für 18 Stunden mit oder ohne 20 &mgr; mol /L G503 behandelt. Nach der Behandlung wurden die mitochondrialen und zytoplasmatischen Fraktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers erhalten (Mitochondria Isolations kit).

Western-Blotting-Analyse

Wie zuvor beschrieben, wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert [21] . Die Proteinkonzentrationen der Mitochondrien, Zytoplasma und whole-cell wurden durch das BCA-Verfahren unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Assay-Kits nachgewiesen. Insgesamt 60 &mgr; g Proteine ​​aus jeder Gruppe wurden um 12% bzw. 15% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt. Die Proteine ​​aus SDS-PAGE wurden auf eine PVDF-Membran übertragen. Nachdem die unspezifischen Bindungsstellen der Membranen für 1-2 h bei Raumtemperatur mit TBST-Puffer mit 10% fettfreier Milch blockiert waren, wurden die Membranen über Nacht bei 4 ° C mit dem primären Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Die Sekundärantikörper mit oder ohne Fluoreszenz auf die entsprechenden primären Antikörper konjugiert wurden für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen mit fluoreszierenden Sekundärantikörper wurden mit dem Odyssey-System (Li-COR, Nebraska, USA) untersuchten die fluoreszierenden Bänder zu scannen [22], und die Membranen mit normalen sekundären Antikörper wurden unter Verwendung des ECL-Nachweis-Kit für Immunoblots sichtbar gemacht. Die Membranen wurden gestrippt und erneut sondiert mit β-Aktin oder COXIV Antikörper. β-Actin wurde als interner Standard für die gesamte Zell-Lysat und zytoplasmatische Extraktionen verwendet, während COXIV als Kontrolle für die mitochondriale Extraktionen verwendet. Densitometrische Analyse der Banden wurde mit Menge durchgeführt One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Die statistische Analyse

Alle präsentierten Daten wurden als ± SD mindestens drei Bestimmungen bedeutet . SPSS 13.0 Software wurde für Student-t-Test und eine Einwegvarianzanalyse (ANOVA) in allen statistischen Analysen verwendet. A P
Wert 0,05 wurde als statistisch signifikant in allen Fällen.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Expression von XPG Protein in der Entwicklung, Progression und Prognose von Magenkrebs
• PLoS ONE. Chirurgische Ergebnisse und prognostische Faktoren der T4 Magenkrebs-Patienten ohne Distant Metastasis