PLoS ONE: Antrachinon G503 apoptose bij maagkanker cellen door de mitochondriale Pathway

Abstract

G503 is een anthrachinon verbinding geïsoleerd van de secundaire metabolieten van een mangrove endofytische schimmel uit de Zuid-Chinese Zee. Deze studie belicht de antitumoractiviteit en het onderliggende mechanisme van G503. Cellevensvatbaarheid assay uitgevoerd in negen kankercellijnen en twee normale cellijnen toonden aan dat de maagkanker cellijn SGC7901 is de G503-gevoelige kankercellen. G503 geïnduceerde SGC7901 celdood via apoptose. blootstelling G503 geactiveerd caspases-3, -8 en -9. Voorbehandeling met de pan-caspaseremmer Z-VAD-fmk en caspase-9-inhibitor Z LEHD-FMK, maar niet caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, verzwakt het effect van G503. Deze resultaten suggereerden dat de intrinsieke mitochondriale apoptose route, in plaats van de extrinsieke route was betrokken bij G503 geïnduceerde apoptose. Bovendien G503 verhoogde de verhouding van Bax Bcl-2 in de mitochondriën en verlaagde de verhouding in het cytosol. G503 behandeling resulteerde in mitochondriale depolarisatie, cytochroom c vrijlating en de daaropvolgende splitsing van caspase -9 en -3. Bovendien is gemeld dat het endoplasmatisch reticulum apoptose pathway kan ook worden geactiveerd door G503 door het induceren capase 4-splitsing. Met het oog op de onderste 50% remmende concentratie voor maagkanker cellen kunnen G503 dienen als een veelbelovende kandidaat voor maagkanker chemotherapie

Visum:. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Antrachinon G503 apoptose induceert in cellen MaagKanker door het mitochondriaal Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10.1371 /journal.pone.0108286

Editor: Javier S. Castresana, Universiteit van Navarra, Spanje

Ontvangen: 19 april 2014; Aanvaard: 19 augustus 2014; Gepubliceerd: 30 september 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering: Deze studie werd ondersteund door de National Nature Science Foundation of China, Grant Nummer:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech Special Project van China, Grant Number: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Programma voor Doctoral Station in University, Grant Number: 20120171110053, 20130171110053; Key Project van Nature Science Foundation van de provincie Guangdong, China, Grant Number: 10251008901000009; Key Sci-tech Research Project van de provincie Guangdong, China, Grant Number: 2011B031200006; Guandong Natuurwetenschappen Fonds, Grant Number: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-tech Research Project van Guangzhou gemeente, China, Grant Number: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programma voor de jonge leraar in University, Grant Number: 10YKPY28; Changjiang Geleerden en Innovatief Onderzoek Team in University, aantal:. 985 project PCSIRT 0947. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Concurrerende belangen: The auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

chirurgie, radiotherapie en chemotherapie zijn de primaire tumor klinische behandelingen. Echter, chirurgie en radiotherapie zijn niet effectief bij uitgezaaide kanker; of chemo correct gebruik kunnen metastase worden geremd [1]. Wat betreft anti-kanker medicijnen, anthracyclines zijn de meest effectieve geneesmiddelen tegen kanker [2]. Natuurlijke producten uit oceanen zijn belangrijke bronnen van nieuwe anti-kanker medicijnen [3]. Marien organisme metabolieten met unieke structuren en farmacologische activiteiten worden doorgaans gebruikt als leidende antitumorverbindingen [4]. Antrachinon verbindingen, zoals daunorubicine, doxorubicine, epirubicine en mitoxantron, zijn de meest effectieve klinische anti-kanker drugs [2]. De marine antrachinon SZ-685C onderdrukt de proliferatie van menselijke borstkanker [5] - [6] en humane nasofaryngeale carcinoom (NPC) cellen [7]. Huang et al. aangetoond dat anthrachinonen van rabarber, zoals emodin, aloë-emodine en rijn, remmen de groei en proliferatie van verschillende kankercellen, zoals long- adenocarcinoom, myelogene leukemie, neuroblastoom, leverkanker, blaaskanker en anderen [8].

het mechanisme van de anti-tumor activiteit van anthrachinonen is vooral betrokken bij de volgende aspecten [9] - [10]: DNA interacties door middel van binding, intercalerende en storende scheiding van de DNA dubbele streng; directe membraan effecten; DNA schade in respons op II remming of de vorming van vrije radicalen, zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de inductie van apoptose via topoisomerase II remming, of functionele p53 ROS generatie topoisomerase. Daarnaast anthrachinonen ook leiden tot apoptose door de JNK (c-Jun-N-terminaal kinase) [11], Akt /PKB (Proteïne Kinase B) [5], [12] en mitochondriale pathways [13] -. [14]

G503 is een anthrachinon verbinding geïsoleerd van de secundaire metabolieten van de mangrove endofytische schimmel No. 1403 van de Zuid-Chinese Zee [15] .Echter, of G503 bezit antikanker potentieel als een anthrachinon verbinding is niet onderzocht. Daarom werd deze studie opgezet om de antitumoractiviteit van G503 helderen en het onderliggende mechanisme betrokken.

Materialen en Werkwijzen

Chemicaliën en reagentia

3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium bromide (MTT) en ROS scavenger N-acetyl-cysteïne (NAC) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33.342, carboxy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit en MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) werden verkregen van Invitrogen (USA). Annexine V-FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) /PI (propidiumjodide) Apoptosis Detection Kit werd gekocht van Keygen (Nanjing, Jiangsu, China). RPMI1640 medium en foetaal runderserum (FBS) waren afkomstig Hyclon (Logan, UT, de VS ).
Caspase-8-remmer Z-IETD-FMK, caspase-9-remmer Z-LEHD-FMK en caspase-familie inhibitor Z-VAD-fmk werden bij Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) en Beyotime (China). Antilichamen tegen caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 en COXIV -antilichamen van Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antilichamen tegen cytochroom c
, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 en anti-geit IgG-HRP waren van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Muis anti-β-actine en anti-GAPDH primaire antibodywere van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-konijn IgG-peroxidase en anti-muis IgG-peroxidase waren van Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria isolatiekit werd aangekocht van Pierce (Pierce, IL, USA), eiwitbepalingskit werden gekocht bij Bio-Rad (Hercules , CA, USA), en de ECL-detectie kit waren van Applygen Technologies Inc (Beijing, China).

fermentatie, extractie en isolatie van G503 uit Nigrospora
sp. Nee 1.403

NO.1403 werd geïsoleerd uit vermolmd hout van de Kandeliacandel
(L.) Druce en ontstegen als Nigrospora
sp. (Genebank toegangsnummer: HQ891110), verzameld van Mai Po, Hong Kong, en een zout meer in de Bahama's. G503 werd geïsoleerd en gezuiverd van de secundaire metabolieten van NO. 1403 [15]. Starter culturen werden gehandhaafd op maïsmeel zeewater agar. Stekkers van agar ondersteunen myceliumgroei werden gesneden en aseptisch overgebracht naar een 250 ml Erlenmeyer kolf die 100 ml vloeibaar medium (glucose 10 g /l, pepton 2 g /l, gistextract 1 g /l, NaCl _{2 g /L, pH 7,0 D). De kolf werd geïncubeerd bij 28 ° C. Na schudden op een rondschudapparaat gedurende 3-5 dagen werd het mycelium aseptisch overgebracht in een Erlenmeyer kolf van 500 ml met de kweekvloeistof (200 ml). De kolf werd vervolgens gedurende 25 dagen geïncubeerd bij 28 ° C.}

De cultures (150 L) werd gefiltreerd door kaasdoek. Het filtraat werd driemaal geconcentreerd tot 5 L beneden 50 ° C en geëxtraheerd door schudden met een gelijk volume ethylacetaat. De gecombineerde organische extracten werden onderworpen aan een silicagelkolom en geëlueerd met een gradiënt van petroleum ether tot ethylacetaat om de verbinding te leveren.

De verbinding werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) bij een voorraad concentratie van 50 mmol /L en verdund tot specifieke concentraties voor gebruik

Cell cultuur

HUVEC's werden geïsoleerd uit de humane navelstreng koorden van de normale parturitions en gekweekt volgens een protocol eerder beschreven [16] -. [ ,,,0],17]. Chang levercellen en tumorcellijnen SLIJPSTEEN-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 en SGC7901, AGS werden gehandhaafd door laboratoriumwaarden gekweekt in RPMI1640-medium aangevuld met 10% FBS, 100 U /mL streptomycine en 100 U /ml penicilline (Gibco) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2. Deze studie voldoet aan de in de Verklaring van Helsinki, door de Medisch Ethische Commissie van Sun Yat-Sen University erkende principes, en schriftelijke toestemming is verkregen van de donor.}

Cell levensvatbaarheid assay

cellen werden gezaaid bij een dichtheid van 2 x 10 ^{4 cellen /ml in 24-well platen (HUVEC's werden gezaaid in met gelatine beklede platen met 24 putjes). Wanneer de cellen een dichtheid van 60% -70% bereikt, werden ze behandeld met verschillende concentraties van G503 gedurende 48 h in RPMI1640 medium (1 ml /putje) zonder FBS; de negatieve controlegroepen werden behandeld met PBS. Vervolgens werd 100 ul MTT (5 mg /ml) opgelost in PBS aan elk putje toegevoegd en gedurende nog eens 4 uur, teneinde de vorming van formazancrystals. De kristallen werden opgelost in 1 ml DMSO in elk putje. De optische dichtheid (OD) waarden van de paarse oplossing cellevensvatbaarheid vertegenwoordigd werden gemeten bij 570 nm [18] - [19]. Na drie onafhankelijke experimenten werd de celoverleving bepaald met de volgende formule: overleving (%) = (gemiddelde waarde experimentele OD /controle OD gemiddelde waarde) x 100%. De waarden werden uitgedrukt als de 50% remmende concentratie (IC _{50), die werd berekend door de regressie werkwijze het lineaire bereik.}}

33.342 Hoechst kleuring assay

SGC7901 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen met een dichtheid van 10 ^{5 cellen per putje en behandeld met G503 concentraties variërend van 0 umol /l tot 40 umol /L 24 uur. De cellen werden gelabeld met 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] gedurende 10 minuten bij 37 ° C en waargenomen onder toepassing van fluorescentiemicroscopie (Olympus X71-A12FL /PH).}

Annexine V-FITC /PI kleuring assay

SGC7901 cellen werden verzameld bij een dichtheid van 5 x 10 ^{5 tot 5 x 10 6 /mL na G503 behandeling bij concentraties variërend van 0 umol /l tot 40 umol /L 24 h 6-well platen; cellen behandeld met 25 umol /L colchicine werden gebruikt als positieve controle. De cellen werden vervolgens gewassen en gekleurd volgens de instructies van de fabrikant (Annexine V-FITC /PI Apoptose Detectie Kit). In het kort werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 500 pL 1 x bindingsbuffer. Vervolgens werd 5 ul AnnexinV-FITC en 5 pl 20 ug /ml PI aan het monster toegevoegd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker. De gekleurde monsters werden vervolgens beoordeeld door flow cytometrie (Becton Dickinson, NJ, USA) om apoptotische cellen te identificeren.}

Bepaling van mitochondriale membraanpotentiaal

SGC7901 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen. Bij het bereiken van een dichtheid van 60%, werden de cellen behandeld met 20 umol /L G503 gedurende 18 uur en vervolgens verzameld om de mitochondriale membraanpotentiaal volgens de aanbevelingen van de fabrikant te beoordelen (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). In het kort werden 1 x 10 ^{6 /mL cellen geresuspendeerd in 37 ° C PBS. De positieve controlegroepen werden voorbehandeld met 1 pl 50 mmol /L CCCP bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Alle groepen werden vervolgens behandeld met 5 pi van 10 umol /L Dioc _{2 (3) gedurende 30 minuten bij 37 ° C en beoordeeld door flowcytometrie. De mitochondriale membraanpotentiaal werd berekend met de volgende vergelijking:. Mitochondriale membraanpotentiaal = (rode fluorescentie-intensiteit) /(groene fluorescentie intensiteit)}}

Detectie de opening van mitochondria permeabiliteittransitieporie (MPTP)

SGC7901 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen. Bij het bereiken van een dichtheid van 60%, werden de cellen behandeld met 20μmol /l G503 18 uur en verzameld MPTP opening door doorstroomcytometrie (Becton Dickinson, NJ, USA) beoordeelt volgens het protocol van de fabrikant (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). In het kort werd elk monster verdeeld in 3 porties en behandeld als volgt: monster 1 werd behandeld met 5 pl 2 umol /L Calcein AM in het donker; monster 2 werd behandeld met 5 pi calceïne AM en 5 gl 80 mmol /L CoCl _{2 in het donker; en monster 3 werd behandeld met 5 pi calceïne AM, 5 pl CoCl 2 en 5 pi van 100 umol /L ionomycine. De monsters werden daarna geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 15 minuten in het donker. Na te zijn gewassen met HBSS /Ca ^{2+ en geresuspendeerd in 400 ul HBSS /Ca 2+ werden de cellen onderzocht met flowcytometrie binnen 1 uur. (Fluorescentie van de fluorescentie aliquot 2- hoeveelheid van 3) /(de hoeveelheid fluorescentie van de fluorescentie van 1- monster 3): MPTP openingstoestand wordt als volgt berekend. Calceïne AM dringt het cytoplasma en organellen zoals mitochondriën. CoCl 2 dooft calceïne AM fluorescentie in het cytoplasma, maar niet in de mitochondriën. Calceïne AM zich naar het cytoplasma van de mitochondriën als de MPTP wordt geopend en de fluorescentie wordt verzwakt door CoCl 2.}}

Isolatie van mitochondriën en cytoplasma

SGC7901 cellen werden uitgeplaat in 100-mm platen; elke groep werd uitgeplaat in twee platen. Na het bereiken van 60% -70% confluentie werden de cellen behandeld met of zonder 20 umol /l G503 gedurende 18 uur. Na behandeling werden de mitochondriale en cytoplasmatische fracties verkregen volgens de instructies van de fabrikant (Mitochondria isolatiekit).

Western vlekanalyse

Zoals eerder beschreven, werden de cellen gelyseerd in RIPA-buffer [21] . De eiwitconcentraties van de mitochondria, cytoplasma en gehele cellen werden gedetecteerd door de BCA methode met behulp van de Bio-Rad eiwit assay kit. In totaal 60 ug eiwit uit elke groep werden gescheiden met 12% of 15% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). De eiwitten van SDS-PAGE werden overgebracht naar een PVDF membraan. Na de niet-specifieke bindingsplaatsen van de membranen werden geblokkeerd gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur met TBST buffer bevattende 10% magere melk werden de membranen gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met primair antilichaam volgens de instructies van de fabrikant. De secundaire antilichamen met of zonder fluorescentie geconjugeerd aan de desbetreffende primaire antilichamen werden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. De membranen met fluorescerende secundaire antilichamen werden beoordeeld met het Odyssey systeem (Li-COR, Nebraska, USA) aan de fluorescerende banden [22] scannen en de membranen met normale secundaire antilichamen werden gevisualiseerd met het ECL detectiekit voor immunoblots. De membranen werden gestript en opnieuw gesondeerd met β-actine of COXIV antilichamen. β-actine werd gebruikt als interne standaard voor de totale cellysaat en cytoplasmatische extracties, terwijl COXIV werd gebruikt als controle voor de mitochondriale extracties. Densitometrische analyse van banden werd uitgevoerd met Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Statistische analyse

De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± SD van ten minste drievoudige bepalingen . SPSS 13.0 software werd gebruikt voor t-toets en één-factor variantieanalyse (ANOVA) in alle statistische analyses. A P
waarde 0,05 werd als statistisch significant in alle gevallen.

Resultaten

G503-gemedieerde remming op de proliferatie, qua SGC7901 in cellen van de 11 onderzochte cellijnen

We gebruikten de MTT assay om te bepalen of de verbinding antrachinon G503 cytotoxisch in de volgende cellijnen: twee normale cellijnen (Menselijke navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) en Chang levercellen en negen tumorcellijnen (HONE -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 en SGC7901). Alle cellen werden geïncubeerd met 0, 2,5, 5, 10, 20 of 40 umol /L G503 gedurende 48 uur. Cel levensvatbaarheid werden gemeten met behulp van de MTT-bepaling zoals gezegd, en de IC _{50 value for SGC7901 cellen was de laagste, terwijl de IC 50-waarden voor de normale cellijnen HUVEC en Chang levercellen, waren significant groter dan SGC7901 ( tabel 1).}

G503 induceert apoptose in SGC7901 en AGS maagkanker cellen

Aangezien de SGC7901 cellijn was het meest gevoelig voor G503 van de elf onderzochte cellijnen (tabel 1), we verder onderzocht deze cellijn apart. SGC7901 cellen gekleurd met Hoechst 33342 te bepalen of het remmende effect was gerelateerd aan apoptose. De resultaten duiden op een toename van het aantal cellen die nucleaire chromatine condensatie krimp en met toenemende concentraties G503 (Figuur 1A). Bovendien, te onderzoeken of G503 induceert apoptose in andere maagkanker cellijnen werden AGS maagkanker cellen onderzocht. Annexine V /PI-kleuring werd toegepast om de effecten van G503 in SGC7901 en AGS maagkanker cellen cytometrie geanalyseerd door flow. Voor deze experimenten werd 25 umol /L colchicine als positieve controle gebruikt. Na behandeling met 0 umol /L, 2,5 umol /l, 5 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L en 40 umol /l G503 en 25 umol /L colchicine gedurende 24 uur, het percentage apoptotische SGC7901 cellen 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% en 20,69% ± 1,91%, respectievelijk (Figuur 1B); het percentage van apoptotische AGS cellen waren 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% en 31,49% ± 2,45%, respectievelijk (Figuur 1C). De detectie van apoptose in AGS cellen en de bovenstaande resultaten gaven aan dat G503 induceert maagkanker cel apoptose in een dosisafhankelijke wijze.

G503 induceert apoptose in een caspase-afhankelijke manier

Om verder het mechanisme betrokken bij G503-geïnduceerde apoptose in cellen maagkanker, bestudeerden we SGC7901 cellen. Caspase-3 is een effector die caspase kern binnendringen en rechtstreeks met het substraat, waardoor apoptose [24] bevorderen. Caspse-9 is de initiator caspase dat caspse-3 [25] activeert. De cellen werden behandeld met verschillende concentraties G503 aangegeven tijdstippen verzameld en caspase-3 en -9 bepalen door Western blotting. De expressie van het caspase-3 precursor afgenomen op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze, terwijl caspase-3 splitsingsfragmenten op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze toe (Figuur 2A, B). De expressie van het caspase-9 precursor ook verlaagd en de splitsingsfragmenten toegenomen na de cellen werden behandeld met 20 umol /L G503 gedurende 24 uur (figuur 2C). Deze effecten worden afgeschaft door de pan-caspase-remmer Z-VAD-FMK (figuur 2C, D). Consistent met de activatie van caspase-9 en -3, de apoptotische cell rates geïnduceerd geïnduceerd door 20 umol /l G503 in SGC7901 cellen werden duidelijk verminderd na voorbehandeling met Z-VAD-fmk (Figuur 2E). Deze gegevens suggereerden dat G503 induceert apoptose in cellen SGC7901 in een caspase-afhankelijke wijze.

G503-geïnduceerde apoptose niet afhankelijk is van caspase-8

Om te onderzoeken of de dood-receptor gemedieerde apoptotische route geïnduceerd door G503, bestudeerden we caspase-8, caspase de initiator van de death receptor-gemedieerde apoptotische pathway [26]. SGC7901 cellen werden behandeld met verschillende doses voor G503 aangegeven tijden. De cellen werden verzameld caspase-8 door Western blotting meten. De resultaten geven aan dat caspase-8 precursor verlaagd en gesplitst caspase-8 verhoogd in een tijd- en dosis-afhankelijke wijze (Figuur 3A, B). De cellen werden voorbehandeld met 20 umol /L caspase-8-remmer Z-IETD-FMK gedurende 30 min en vervolgens behandeld met 20μmol /l G503 gedurende 24 uur. De caspase-8 proform verhoogd in cellen samen behandeld met de caspase-8-remmer en G503 in vergelijking met cellen behandeld met alleen G503. De caspase-9 proform, gesplitst caspase-9 en caspase-3 werden op vergelijkbare niveaus in cellen behandeld met de caspase-8-remmer en G503 of G503 alleen (Figuur 3C) gehandhaafd. In overeenstemming met Figuur 3C-G503 geïnduceerde apoptotische cellen prijzen SGC7901 cellen werden niet verminderd door voorbehandeling met Z-IETD-FMK (Figuur 3D). Deze gegevens suggereerden dat ondanks activering door G503, caspase-8 is niet betrokken bij pro-apoptotische activiteit van G503.

G503-geïnduceerde apoptose afhankelijk is van caspase-9

Caspase-9, de initiator caspase van de mitochondriale apoptotische route, kan worden geactiveerd door vermenging met cytochroom c
(Cyto c
) en apoptotische protease-activerende factor-1 (Apaf-1) [25] - [26]. Om verder te onderzoeken of het mitochondriale pathway betrokken bij G503-geïnduceerde apoptose, de activering van caspase-9 werd onderzocht na G503 behandeling met verschillende concentraties en tijden. Daarnaast werd het percentage apoptotische cellen gemeten na co-behandeling met G503 en caspase-9-inhibitor Z LEHD-FMK. De resultaten gaven aan dat de caspase-9 proform verlaagd en de splitsingsfragmenten nam op tijd- en dosis-afhankelijke wijze (Figuur 4A, B). Vervolgens werden de cellen voorbehandeld met 20 umol /L Z-LEHD-FMK voor 30 min en co-geïncubeerd met 20 umol /L G503 gedurende 24 uur. Om de apoptotische cellen te kwantificeren, werden de cellen gekleurd met AnnexinV /PI en middels flowcytometrie geanalyseerd. De resultaten gaven aan dat de apoptotische cellen daalde wanneer de cellen werden behandeld met co-Z-LEHD-fmk en G503 (Figuur 4C). Samengenomen geven deze gegevens aan dat G503 SGC7901 geïnduceerde apoptose afhankelijk is van caspase-9 activatie.

G503 apoptose via de mitochondriale apoptotische route

Het is algemeen bekend dat de mitochondriale pathway een belangrijke apoptotische route. Om te onderzoeken of G503 apoptose via mitochondriale pathway onderzochten we apoptose-gerelateerde eiwitten, de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP), en de opening van MPTP naar de inductie van de mitochondriale apoptotische route te bevestigen. Volg door G503 behandeling, mitochondriale fluorescentie gedaald in vergelijking met de controlegroep (figuur 5A), waardoor wat suggereert dat de MPTP werd geopend door G503. Zoals getoond in figuur 5B is aanzienlijke rood /groen fluorescentie-intensiteit waargenomen in de controlegroep. Echter, na behandeling met 20 umol /l G503, werd de rood /groene fluorescentie-intensiteit verlaagd. Dit resultaat suggereerde dat G503 vermindert de mitochondriale membraanpotentiaal van cellen SGC7901. Daarnaast totaal Cyto c
eiwitgehalten is niet noemenswaardig veranderd tussen de controle en de drug-groep; echter Cyto c
werd geherlokaliseerde naar het cytoplasma van de mitochondriën (figuur 5C). Bax en Bcl-2 een cruciale factor bij de regulatie van mitochondriale kanalen en de afgifte van verschillende apoptose-gerelateerde eiwitten [27]. Daarom We bestudeerden de verdeling van Bax en Bcl-2 in verschillende cellulaire compartimenten en heeft een prominente verandering in de totale hoeveelheid eiwit niveaus van Bax en Bcl-2 tussen de controle en de drug groep niet in acht nemen; echter G503 bevorderde de translocatie van Bax van het cytoplasma naar de mitochondriën en de translocatie van Bcl-2 van de mitochondriën naar het cytoplasma (figuur 5D). Bij elkaar genomen, G503 induceert apoptose in SGC7901 cellen via de mitochondriale pathway.

G503 induceert apoptose in SGC7901 cellen mede door caspase-4 activering

caspase-4 kan direct activeren caspase-9, maar niet door de mitochondriale pathway [28] - [29]. Om te onderzoeken of caspase-4 wordt geactiveerd door G503 en of geactiveerde caspase-4 activeert caspase-9, onderzochten we de splitsing fragmenten van caspase-4 en -9. De resultaten gaven aan dat de caspase-4 splitsingsfragment in cellen behandeld met G503 aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de controlegroep (figuur 6A). Behandeling met de caspase-4 inhibitor Z-LEVD-FMK verhoogde de caspase-9 proform, die niet werd gedetecteerd in de G503 behandelde groep (Figuur 6B). Deze resultaten gaven aan dat G503 induceert SGC7901 maagkanker cel apoptose in een deel door de activering van caspase-4.

Discussie

Het is gemeld dat p
-quinone rest van chinon -bevattende moleculaire speelt een belangrijke rol bij anti-kanker potentieel [30]. Perchellet et al. gevonden dat p-chinon J4, o-chinon J1 en ongesubstitueerd model p-chinon J7 verminderde de L1210 tumor cellevensvatbaarheid over acht verbindingen gesynthetiseerd en gescreend op hun voorstudie [31]. De relatie tussen de potentiële antikanker of altersolanol A en structuur-activiteitsrelaties, Teiten et al begrijpen. evalueerde het effect van altersolanol A en de bijbehorende anthraceenderivaten: tetraacetylaltersolanol A, B en tetrahydroaltersolanol ampelanol. Zij vonden slechts altersolanol A en geacetyleerde derivaat tetraacetylaltersolanol Een heden een cytotoxisch effect op K562-cellen, terwijl derivaten met reductie van één van de carbonylgroepen zoals tetrahydroaltersolanol B ampelanol geen effect [32] hebben. De p
-quinone structuur van G503 (figuur S1) kan ook worden bijgedragen aan de kankercel apoptose, en in het volgende onderzoek zullen we analyseren de G503 en zijn derivaten op de voorlopige structuur-activiteit relatie te identificeren. In deze studie, vinden we dat de maagkanker cellijn SGC7901 is de G503-gevoelige kanker cellijn onderzocht met een cellevensvatbaarheid assay negen kankercellijnen en twee normale cellijnen. G503 induceert SGC7901 maagkanker celdood via apoptose in een dosis-afhankelijke wijze. Andere maagkanker cellen AGS is ook onderzocht, en gevoelig voor G503-geïnduceerde apoptose ook. Dientengevolge, 20 umol /L G503 is de optimale concentratie die ernstige apoptose induceert.

Het menselijk genoom codeert voor ten minste 10 soorten caspase homologen. De volgende caspase homologen deelnemen apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 en -10 [33]. Hoewel caspasen een rol spelen bij apoptose, caspase er verschillende onafhankelijke routes bestaan. Bijvoorbeeld in aanwezigheid van caspase remmers, tumornecrosefactor (TNF) induceert celnecrose, waarvan de karakteristieken van apoptose en necrose [34] bezit - [36]. Bovendien, apoptose-inducerende factor (AIF) is een DNA-enzym dat DNA direct afbreekt. Wanneer de mitochondriale membraanpotentiaal wordt veranderd, wordt AIF vrijgegeven aan het cytoplasma van de mitochondriën en wordt geactiveerd door de interactie met cyclophilinA [37] - [38]. Endo G kan ook DNA afbreken direct in een caspase-onafhankelijke wijze [39].

In onze studie was de blootstelling G503 geactiveerd caspase-3, -8 en -9 op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze (figuur 2A, B; 3A, B; 4A, B). Is-G503-geïnduceerde apoptose afhankelijk van caspases? Wanneer cellen werden behandeld samen met Z-VAD-FMK en G503, Z-VAD-FMK remt caspase-9 en -3 activatie (Figuur 2C, D), en het aantal apoptotische cellen geïnduceerd door verminderde G503 (figuur 2E), hetgeen aangeeft dat-G503 geïnduceerde SGC7901 cel apoptose is caspase-afhankelijk. Om te onderscheiden of-G503-geïnduceerde apoptose is afhankelijk van caspase-8, -9 of beide, werden SGC7901 cellen voorbehandeld met Z-IETD-FMK en Z-LEHD-FMK en vervolgens co-behandeld met G503. De resultaten geven aan dat Z-IETD-FMK niet remt caspase-9 en -3 activatie (Figuur 3C) of verminderen het aantal apoptotische cellen geïnduceerd door G503 (figuur 3D); echter Z-LEHD-FMK nam het percentage apoptotische cellen (Figuur 4C). Aldus G503-geïnduceerde SGC7901 apoptose is onafhankelijk van caspase-8, maar is caspase-9.

De mitochondria bestaan ​​uit een buitenste membraan, ruimte en matrix. Apoptose-gerelateerde eiwitten, zoals caspase pro-enzymen, Cyto c Kopen en AIF bestaan ​​in het membraan ruimte. Echter, wanneer de poriën gevormd in de buitenste mitochondriale membraan en de permeabiliteit wordt veranderd, deze apoptose-gerelateerde eiwitten worden vrijgegeven aan het cytoplasma. Leden van de Bcl-2 familie controle van de permeabiliteit van de buitenste mitochondriale membraan en kan worden onderverdeeld in twee leden die apoptose (zoals Bax en Bak) het bevorderen of remmen apoptose (zoals Bcl-2 en Bcl-xL). De pro-apoptotische leden bevorderen de afgifte van apoptose-gerelateerde eiwitten, zoals Cyto c
, de mitochondria, terwijl de anti-apoptotische leden een tegengesteld effect [40]. Bax bestaat voornamelijk in het cytoplasma, terwijl Bcl-2 gecombineerd met hydrofobe groepen aan het C-uiteinde van de cel biologische membraan [41]. Bax structuur gewijzigd tijdens de externe spanning zodat het combineert met de buitenste mitochondriale membraan tospontaneously een galerie door homologe oligomerisatie vormen. Deze actie veroorzaakt vrijstelling van apoptose-gerelateerde eiwitten [42] of de vorming van de mitochondria permeabiliteittransitieporie (MPTP), dat bestaat uit spanningsafhankelijke anion kanaal (VDAC) op de buitenste mitochondriale membraan en adenine nucleotide translocator (ANT) op de binnenste membraan [43]. Bax interageert alleen VDAC om een ​​open poriën te maken wanneer Bax concentraties zijn laag. Daarentegen Bax tegelijkertijd samenwerkt met VDAC en ANT als Bax concentraties hoog om de poriën te openen in de binnenste en buitenste membraan. Deze actie reduceert de binnenste membraanpotentiaal, verhoogt de osmotische druk van de mitochondriale matrix, bevordert binnenmembraan zwelling en verhoogt de osmotische druk van de buitenste membraan, waardoor de afgifte van apoptose-gerelateerde eiwitten [26], [44] bevorderen - [46 ]. Een belangrijke stap in het mitochondriaal apoptotische route is de release van Cyto c
[47] - [49]. Cyto c
combineert met Apaf-1 en het caspase-9 proform de apoptosoom creëren. Apaf-1 onthult de oligomerisatie domein en het N-terminale caspase activering en recrutering domein (CARD) combineert met de caspase-9 proform CARD. Aldus wordt caspase-9 geactiveerd, en de geactiveerde caspase-9 splitst stroomafwaartse caspasen, zoals caspse-3 en -7. De effector caspasen uiteindelijk splitsen hun overeenkomstige substraten cel apoptose te induceren [47], [49] -. [50]

In deze studie, G503 verhoogt het aandeel van Bax /Bcl-2 op de mitochondriale membraan en vermindert de Bax /Bcl-2-verhouding in het cytoplasma (figuur 5D). G503 bevordert ook MPTP opening en de reductie van de mitochondriale membraanpotentiaal (Figuur 5A, B). Vervolgens Cyto c
werd overgebracht van de mitochondriën naar het cytoplasma (figuur 5C). Bovendien, G503 bevordert de overdracht van Bax naar de mitochondriën uit het cytoplasma en Bcl-2 aan het cytoplasma van de mitochondriën. Verhoogde Bax en Bcl-2 gereduceerd in de mitochondriën verhoging van de permeatie van de mitochondriale buitenste membraan en het bevorderen van de afgifte van Cyto c
. De regulering van Bax /Bcl-2 door G503 kan waargenomen worden omdat G503 is een kleine moleculaire compound.

• PLoS ONE: Expressie van XPG Eiwit in de ontwikkeling, de progressie en prognose van maagkanker
• PLoS ONE: chirurgische resultaten en prognostische factoren van T4 maagkanker Patiënten zonder metastasen op afstand