PLOS ONE: anthraquinone G503 induit une apoptose dans les cellules cancéreuses gastrique par le mitochondrial Pathway

Résumé

G503 est un composé anthraquinone isolé des métabolites secondaires d'un champignon mangrove endophytes de la mer de Chine méridionale. La présente étude met en lumière l'activité anti-tumorale et le mécanisme sous-jacent de G503. test de viabilité cellulaire réalisée dans neuf lignées cellulaires de cancer et de deux lignées cellulaires normales ont démontré que la lignée cellulaire de cancer gastrique est SGC7901 les cellules cancéreuses les plus sensibles à G503. G503 a induit la mort cellulaire par apoptose SGC7901. exposition à G503 caspases-3 activée, -8 et -9. Le prétraitement avec l'inhibiteur pan-caspase Z-VAD-FMK et de la caspase-9 inhibiteur Z-LEHD-FMK, mais pas caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, atténué l'effet de la G503. Ces résultats ont suggéré que la voie de l'apoptose mitochondriale intrinsèque, plutôt que de la voie extrinsèque, a été impliqué dans l'apoptose induite par G503. En outre, G503 a augmenté le rapport de Bax à la protéine Bcl-2 dans la mitochondrie et une diminution de la proportion dans le cytosol. traitement G503 a abouti à la dépolarisation mitochondriale, libération du cytochrome c et le clivage ultérieur de caspase -9 et -3. En outre, il est rapporté que la voie du réticulum endoplasmique à l'apoptose peut également être activé par G503 en induisant le clivage Capase-4. En contrepartie de la concentration inhibitrice inférieure à 50% pour les cellules de cancer gastrique, G503 peut servir comme un candidat prometteur pour la chimiothérapie du cancer gastrique

Citation:. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) anthraquinone G503 induit une apoptose dans les cellules cancéreuses gastrique par le biais du mitochondrial Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10.1371 /journal.pone.0108286

Editeur: Javier S. Castresana, Université de Navarre, en Espagne

Reçu: 19 Avril 2014; Accepté le 19 Août 2014; Publié: 30 Septembre 2014

Droit d'auteur: © 2014 Huang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement: Cette étude a été soutenue par la National Science Foundation Nature de la Chine, de Grant Number:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; Projet spécial National Key Sci-Tech de la Chine, numéro Grant: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Programme pour la station de doctorat à l'Université, Grant Number: 20120171110053, 20130171110053; Projet clé de la Nature Science Foundation de la province du Guangdong, en Chine, Nombre Grant: 10251008901000009; Projet de recherche clé Sci-tech de la province du Guangdong, en Chine, Nombre Grant: 2011B031200006; Fonds sciences naturelles Guandong, Grant Number: S2012010009250, S2012040006986; Projet de recherche clé Sci-tech de la municipalité de Guangzhou, en Chine, Nombre Grant: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programme pour les jeunes enseignants à l'université, Grant Number: 10YKPY28; Changjiang Scholars et innovante équipe de recherche de l'Université, le numéro: 985. Projet PCSIRT 0947. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents: Le les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent.

introduction

Chirurgie, radiothérapie et la chimiothérapie sont les traitements cliniques primaires de tumeurs. Cependant, la chirurgie et la radiothérapie ne sont pas efficaces dans le cancer métastatique; si la chimiothérapie est utilisée correctement, la métastase peut être inhibée [1]. En ce qui concerne anticancéreuse le développement de médicaments, les anthracyclines sont des médicaments anticancéreux les plus efficaces [2]. Les produits naturels provenant des océans sont des sources importantes de médicaments anticancéreux nouveaux [3]. métabolites de micro-organismes marins avec des structures uniques et les activités pharmacologiques sont généralement utilisés comme principaux composés antitumoraux [4]. Composés d'anthraquinone, tels que la daunorubicine, la doxorubicine, l'épirubicine et la mitoxantrone, sont les médicaments les plus efficaces contre le cancer clinique [2]. Anthraquinone marin SZ-685C supprime la prolifération du cancer du sein humain [5] - [6] et des cellules humaines carcinome nasopharyngé (NPC) [7]. Huang et al. démontré que les anthraquinones de la rhubarbe, tels que l'émodine, l'aloe-émodine et la rhéine, inhibent la croissance et la prolifération de diverses cellules cancéreuses, telles que l'adénocarcinome du poumon, une leucémie myéloïde, un neuroblastome, un carcinome hépatocellulaire, le cancer de la vessie et d'autres [8].

le mécanisme de l'activité antitumorale de anthraquinones est principalement impliquée dans les aspects suivants [9] - [10]: les interactions d'ADN par la liaison, intercalant et interférant séparation du double brin d'ADN; effets directs membrane; lésions de l'ADN, en réponse à l'inhibition de la topoisomérase II, ou la génération de radicaux libres, tels que les espèces réactives de l'oxygène (ROS), et l'induction de l'apoptose par l'intermédiaire de l'inhibition de la topoisomérase II, p53 fonctionnelle ou la génération de ROS. En outre, les anthraquinones déclenchent également l'apoptose par la JNK (kinase c-Jun N-terminal) [11], Akt /PKB (Protein Kinase B) [5], [12] et des voies mitochondriales [13] - [14].

G503 est un composé anthraquinone isolé des métabolites secondaires de la mangrove champignon endophyte n ° 1403 de la mer de Chine méridionale [15] .Cependant, si G503 possède un potentiel anticancéreux en tant que composé d'anthraquinone n'a pas été étudiée. Par conséquent, la présente étude a été conçue pour élucider l'activité anti-tumorale de G503 et le mécanisme sous-jacent impliqué.

Les Matériaux et méthodes chimiques et réactifs

3- (4 , 5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium (MTT) et ROS piégeur N-acétyl-cystéine (NAC) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, carboxy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Kit de dosage et MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) ont été obtenus chez Invitrogen (Etats-Unis). Annexin V-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) /PI (iodure de propidium) Kit de détection de l'apoptose a été acheté chez Keygen (Nanjing, Jiangsu, Chine). milieu RPMI1640 et le sérum de veau fœtal (FBS) provenaient de Hyclon (Logan, UT, USA )
Caspase-8 inhibiteur Z-IETD-FMK,-9 caspase inhibiteur de l'inhibiteur Z-LEHD-FMK et de la caspase-famille. Z-VAD-FMK provenaient de Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) et Beyotime (CHINE). Des anticorps contre caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 et de l'anticorps COXIV étaient de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Les anticorps dirigés contre le cytochrome c
, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 et anti-chèvre LGG-HRP était de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). anti-β-actine Mouse et antibodywere primaire anti-GAPDH de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-lapin LGG-peroxydase et IgG anti-souris-peroxydase étaient de Vector (Burlingame, CA, USA) kit d'isolation .Mitochondria a été acheté chez Pierce (Pierce, IL, USA), kit de dosage de la protéine ont été achetés chez Bio-Rad (Hercules , CA, USA), et le kit de détection ECL étaient de Applygen Technologies Inc (Beijing, Chine).

fermentation, extraction et l'isolement de G503 de sp
Nigrospora. No. 1403

NO.1403 a été isolé à partir de bois pourri de (L.) Druce
Kandeliacandel et réidentifiés comme sp
Nigrospora. (Genebank numéro d'accession: HQ891110), recueillies auprès de Mai Po, Hong Kong, et un lac de sel dans les Bahamas. G503 a été isolé et purifié à partir des métabolites secondaires de NO. 1403 [15]. Cultures de départ ont été maintenues sur gélose d'eau de mer de semoule de maïs. Les bouchons d'agar favorisant la croissance mycélienne ont été coupées et transférées de manière aseptique dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml contenant 100 ml de milieu liquide (glucose 10 g /l, peptone 2 g /L, extrait de levure 1 g /l, NaCl _{2 g /L, pH D 7.0). Le ballon a été mis à incuber à 28 ° C. Après agitation par secousses sur un agitateur rotatif pendant 3-5 jours, le mycélium a été transférée aseptiquement dans un ballon Erlenmeyer de 500 ml contenant le liquide de culture (200 ml). Le ballon a ensuite été incubé à 28 ° C pendant 25 jours
.}

Les cultures (150 L) ont été filtrés à travers une étamine. Le filtrat a été concentré à 5 L inférieure à 50 ° C et on extrait trois fois par secousses avec un volume égal d'acétate d'éthyle. Les extraits organiques combinés ont été soumis à une colonne de gel de silice et on élue avec un gradient d'éther de pétrole à l'acétate d'éthyle pour donner le composé.

Le composé a été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration stock de 50 mmol /L et dilué à des concentrations spécifiques avant d'utiliser

les HUVEC Cell culture ont été isolés à partir des cordons de la veine ombilicale humaine de parturitions normales et cultivées suivant un protocole décrit précédemment [16] -. [ ,,,0],17]. les cellules hépatiques de Chang et des lignées cellulaires tumorales Hone-1, CNE 2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 et SGC7901 AGS ont été maintenues par notre laboratoire et cultivées dans un milieu RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 100 U /mL de streptomycine et 100 U /ml de pénicilline (Gibco) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _{2. Cette étude est conforme aux principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki, approuvé par le Comité d'éthique médicale de l'Université Sun Yat-Sen, et le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir du donneur.}

La viabilité des cellules test

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 x 10 ^{4 cellules /ml dans des plaques à 24 puits (HUVEC ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits revêtues de gélatine). Lorsque les cellules ont obtenu une masse volumique de 60% à 70%, elles ont été traitées avec diverses concentrations de G503 pendant 48 h dans du milieu RPMI1640 (1 ml /puits) sans SFB; les groupes témoins négatifs ont été traités avec du PBS. Ensuite, 100 ul de MTT (5 mg /ml) dissous dans du PBS a été ajouté à chaque puits et mis en incubation pendant 4 heures supplémentaires pour permettre la formation de formazancrystals. Les cristaux ont été solubilisés dans 1 ml de DMSO dans chaque puits. Les valeurs de densité optique (DO) de la solution pourpre qui représente la viabilité cellulaire ont été mesurés à 570 nm [18] - [19]. Après trois expériences indépendantes, la survie cellulaire a été calculé selon la formule suivante: survie (%) = (valeur moyenne de DO expérimentale /valeur moyenne de DO de contrôle) x 100%. Les valeurs ont été exprimées comme la concentration inhibitrice 50% (CI _{50), qui a été calculée par la méthode de régression linéaire dans l'intervalle.}}

Hoechst 33342 coloration dosage

SGC7901 cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits à une densité de 10 ^{5 cellules par puits et traitées avec des concentrations de G503 allant de 0 pmol /L à 40 mol /L pendant 24 h. Les cellules ont été marquées avec 10 pg /ml de Hoechst 33342 [20] pendant 10 min à 37 ° C et observées en utilisant un microscope à fluorescence (Olympus X71-A12FL /PH).}

Annexin V-FITC /PI essai de coloration

SGC7901 cellules ont été recueillies à une densité de 5 x 10 ^{5 à 5 x 10 6 /mL après traitement G503 à des concentrations allant de 0 pmol /L à 40 pmol /L pendant 24 h à des plaques à 6 puits; les cellules traitées avec 25 umoles /L de la colchicine ont été utilisées comme témoin positif. Les cellules ont ensuite été lavées et colorées selon les instructions du fabricant (annexine V-FITC /Kit de détection de l'apoptose PI). En bref, les cellules ont été remises en suspension dans 500 ul de 1 x tampon de liaison. Ensuite, 5 ul AnnexinV-FITC et 5 ul de 20 ug /ml de PI ont été ajoutés à l'échantillon et incubés à température ambiante pendant 15 minutes dans l'obscurité. Les échantillons colorés ont ensuite été évalués par cytométrie en flux (Becton Dickinson, NJ, USA) pour identifier les cellules apoptotiques.}

Détermination de potentiel de membrane mitochondriale

cellules SGC7901 ont été étalées dans des plaques 6 puits. Lorsqu'on obtient une masse volumique de 60%, les cellules ont été traitées avec 20 umoles /L de G503 pendant 18 h, puis recueillies pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale selon les recommandations du fabricant (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). En bref, 1 x 10 cellules 6 /ml ^{ont été remises en suspension dans 37 ° C PBS. Les groupes témoins positifs ont été pré-traitées avec 1 ul de 50 mmol /L CCCP à 37 ° C pendant 5 min. Tous les groupes ont ensuite été traitées avec 5 pi de 10 pmol /L DIOC _{2 (3) pendant 30 min à 37 ° C et évaluée par cytométrie en flux. Le potentiel de la membrane mitochondriale a été calculée sur la base de l'équation suivante:. Potentiel de membrane mitochondriale = (intensité de fluorescence rouge) /(intensité de fluorescence verte)}}

Détection de l'ouverture de la mitochondrie Perméabilité pore de transition (MPTP)

SGC7901 cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits. Lorsqu'on obtient une densité de 60%, les cellules ont été traitées avec 20μmol /L G503 pour 18h et collectées pour évaluer mPTP ouverture par cytométrie en flux (Becton Dickinson, NJ, USA) selon le protocole du fabricant (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). En bref, chaque échantillon a été divisé en 3 fractions aliquotes et on traite comme suit: 1 aliquote a été traitée avec 5 pi 2 pmol /L calcéine AM dans l'obscurité; aliquote 2 a été traitée avec 5 pi calcéine AM et 5 pi 80 mmol /L CoCl _{2 dans l'obscurité; et aliquote 3 a été traitée avec 5 pi calcéine AM, 5 ul CoCl 2 et 5 pi de 100 pmol /L ionomycine. Les portions aliquotes ont ensuite été incubées à 37 ° C pendant 15 min dans l'obscurité. Après avoir été lavé avec du HBSS /Ca ^{2+ et remis en suspension dans 400 ul de HBSS /Ca 2 +, les cellules ont été évaluées par cytométrie en 1 h. La condition d'ouverture mPTP est calculée comme suit: (fluorescence de la fluorescence 2 aliquote de aliquote 3) /(fluorescence de la fraction aliquote de la fluorescence de 1- aliquote 3). Calcéine AM pénètre dans le cytoplasme et des organites, y compris les mitochondries. CoCl 2 calcéine AM étanche fluorescence dans le cytoplasme, mais non dans les mitochondries. Calcéine AM translocation vers le cytoplasme de la mitochondrie lors de MPTP est ouvert, et la fluorescence est atténuée par CoCl 2.}}

Isolement des mitochondries de cellules et le cytoplasme

SGC7901 cellules ont été étalées _{en plaques de 100 mm; chaque groupe a été plaqué en deux plaques. Après avoir atteint 60% à 70% de confluence, les cellules ont été traitées avec ou sans 20 pmol /L de G503 pendant 18 h. Après traitement, les mitochondries et cytoplasmiques fractions ont été obtenus selon les instructions du fabricant (kit d'isolement des mitochondries).}

Analyse par Western Blot

Comme décrit précédemment, les cellules ont été lysées dans du tampon RIPA [21] . Les concentrations de protéine de la mitochondrie, et un cytoplasme des cellules entières ont été détectées par la méthode BCA en utilisant le kit de dosage de protéine Bio-Rad. Au total, 60 pg de protéines provenant de chaque groupe ont été séparés par 12% ou 15% de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate (SDS-PAGE). Les protéines provenant de SDS-PAGE ont été transférées sur une membrane de PVDF. Une fois que les sites de liaison non spécifiques des membranes ont été bloquées pendant 1 à 2 h à température ambiante avec du tampon TBST contenant 10% de lait sans matières grasses, les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire selon les instructions du fabricant. Les anticorps secondaires avec ou sans fluorescence conjugué à des anticorps primaires pertinentes ont été incubées pendant 2 h à température ambiante. Les membranes avec des anticorps secondaires fluorescents ont été évalués en utilisant le système Odyssey (Li-COR, Nebraska, États-Unis) pour numériser les bandes fluorescentes [22], et les membranes avec des anticorps secondaires normales ont été visualisées en utilisant le kit de détection ECL pour immunoblots. Les membranes ont été dépouillés et re-sondés avec β-actine ou anticorps COXIV. β-actine a été utilisée comme étalon interne pour le lysat cellulaire totale et l'extraction cytoplasmique, alors que COXIV a été utilisé comme témoin pour les extractions mitochondriales. L'analyse densitométrique des bandes a été effectuée en utilisant Quantité One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

L'analyse statistique

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SD au moins trois exemplaires déterminations . logiciel SPSS 13.0 a été utilisé pour le test t et à sens unique de l'analyse de l'étudiant de la variance (Anova) dans toutes les analyses statistiques. A P
valeur 0,05 a été considérée comme statistiquement significative dans tous les cas.

Résultats

G503 médiée par l'inhibition de la prolifération est le plus puissant en SGC7901 cellules parmi les lignées cellulaires 11 examinés

Nous avons utilisé le test MTT pour déterminer si le G503 composé anthraquinone est cytotoxique dans les lignées cellulaires suivantes: deux lignées cellulaires normales (cellules de veine ombilicale humaines endotheliales (HUVEC) et des cellules du foie de Chang et neuf lignées de cellules tumorales (HONE -1, 2-CNE, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 et SGC7901). Toutes les cellules ont été incubées avec 0, 2,5, 5, 10, 20 ou 40 pmol /L de G503 pendant 48 h. viabilités cellulaires a été mesurée en utilisant le test MTT comme indiqué, et le circuit intégré _{50 pour SGC7901 cellules est la plus faible, alors que le circuit intégré 50 valeurs pour les lignées cellulaires normales, les cellules hépatiques HUVEC et Chang, étaient significativement plus élevés que SGC7901 ( tableau 1).}

G503 induit l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques SGC7901 et AGS

Étant donné que la lignée cellulaire de SGC7901 était la plus sensible à G503 des lignées cellulaires onze étudiés (tableau 1), nous en outre enquêté sur cette lignée cellulaire séparément. SGC7901 cellules ont été colorées avec Hoechst 33342 pour déterminer si l'effet inhibiteur est lié à l'apoptose. Les résultats indiquent une augmentation du nombre de cellules présentant un retrait nucléaire et la condensation de la chromatine avec des concentrations croissantes G503 (figure 1A). En outre, pour étudier si G503 induit l'apoptose dans d'autres lignées cellulaires de cancer de l'estomac, des cellules cancéreuses gastriques AGS ont également été examinés. Annexine V /PI coloration a été utilisée pour analyser les effets de G503 dans SGC7901 et des cellules de cancer gastrique AGS par cytométrie en flux. Pour ces expériences, 25 pmol /L colchicine a été utilisé comme témoin positif. Après traitement avec 0 pmol /L 2,5 pmol /L, 5 umol /L, 10 umol /L, 20 pmol /L et 40 mol /L de G503 et 25 umol /L colchicine pendant 24 heures, le pourcentage de cellules SGC7901 apoptotiques étaient 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55% 31,03 ± 1,03% et 20,69% ± 1,91%, respectivement (figure 1B); le pourcentage de cellules AGS apoptotiques étaient 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% et 31,49% ± 2,45%, respectivement (figure 1C). La détection de l'apoptose dans les cellules AGS et les résultats ci-dessus ont indiqué que G503 induit gastrique apoptose des cellules cancéreuses d'une manière dose-dépendante.

G503 induit une apoptose d'une manière
caspase-dépendante

Pour étudier plus le mécanisme impliqué dans l'apoptose induite par G503 dans des cellules de cancer gastrique, nous avons étudié SGC7901 cellules. Caspase-3 est une caspase effectrice qui peut pénétrer dans le noyau et d'interagir directement avec le substrat, ce qui favorise l'apoptose des cellules [24]. Caspse-9 est la caspase initiatrice qui active caspse-3 [25]. Les cellules ont été traitées avec diverses concentrations G503 pour les durées indiquées et collectées pour évaluer la caspase-3 et -9 par Western Blot. L'expression du précurseur de la caspase-3 a diminué d'une manière dose et dépendante du temps, alors que les fragments de clivage de la caspase-3 a augmenté dans une dose et dépendante du temps mode (figure 2A, B). L'expression du précurseur de la caspase-9 a également diminué et les fragments de clivage a augmenté après que les cellules ont été traitées avec 20 umoles /L de G503 pendant 24 h (figure 2C). Ces effets sont abolies par l'inhibiteur pan-caspase Z-VAD-FMK (figure 2C, D). Compatible avec l'activation de la caspase-9 et -3, les taux de cellules apoptotiques induites induites par 20 pmol /L de G503 dans SGC7901 cellules ont été nettement réduite après un traitement préalable avec des Z-VAD-FMK (figure 2E). Ces données suggèrent que G503 induit une apoptose dans les cellules SGC7901 d'une manière dépendante de la caspase.

G503 apoptose induite ne dépend pas de la caspase-8

Afin de déterminer si la voie apoptotique médiée par les récepteurs de mort, est induite par G503, nous avons étudié la caspase-8, la caspase initiatrice de la voie apoptotique mort médiée par le récepteur [26]. SGC7901 cellules ont été traitées avec différentes doses de G503 pour les temps indiqués. Les cellules ont été recueillis pour mesurer la caspase-8 par Western Blot. Les résultats indiquent que la caspase-8 précurseur réduit et caspase-8 a augmenté dans un temps et de manière dose-dépendante (figure 3A, B). Les cellules ont été pré-traitées avec 20 umoles /L de la caspase-8 IETD inhibiteur Z-FMK pendant 30 min, puis traités avec 20μmol /L de G503 pendant 24 h. La caspase-8 proforme augmentée dans les cellules co-traités avec l'inhibiteur de caspase-8 et G503 par rapport aux cellules traitées avec G503 seulement. Toutefois, la caspase-9 proforme, caspase-9 et la caspase-3 ont été maintenues à des niveaux similaires dans les cellules traitées avec l'inhibiteur de caspase-8 et G503 ou G503 seul (figure 3C). Conformément à la figure 3C, les taux de cellules apoptotiques induites par G503-en SGC7901 cellules n'a pas été réduit par un prétraitement avec Z-IETD-FMK (Figure 3D). Ces données suggèrent que, en dépit d'une activation par la G503, la caspase-8 ne participe pas à l'activité pro-apoptotique de G503. Apoptose

G503-induite est dépendante de la caspase-9

Caspase-9, la caspase initiatrice de la voie apoptotique mitochondriale, peut être activé par combinaison avec le cytochrome c
(Cyto c
) et apoptotique la protéase activant le facteur-1 (Apaf-1) [25] - [26]. Afin d'étudier plus avant si la voie mitochondriale est impliqué dans l'apoptose induite par G503, l'activation de la caspase-9 a été examinée après un traitement G503 à diverses concentrations et des temps. En outre, le taux de cellules apoptotiques a également été mesurée lors de la co-traitement avec G503 et de la caspase-9, un inhibiteur de Z-LEHD-FMK. Les résultats indiquent que la caspase-9 a diminué proforme et les fragments de clivage augmentée de temps et de façon dose-dépendante (figure 4A, B). Ensuite, les cellules ont été pré-traitées avec 20 pmol /L Z-LEHD-FMK pendant 30 min et co-incubées avec 20 umoles /L de G503 pendant 24 h. Pour quantifier les cellules apoptotiques, les cellules ont été colorées avec AnnexinV /PI et analysées par cytométrie en flux. Les résultats indiquent que le taux de cellules apoptotiques a diminué lorsque les cellules ont été co-traitées avec Z-LEHD-FMK et G503 (figure 4C). Pris ensemble, ces données indiquent que G503 induite par l'apoptose des cellules SGC7901 dépend de l'activation de la caspase-9.

G503 induit l'apoptose par l'intermédiaire de la voie apoptotique mitochondriale

Il est bien connu que la voie mitochondriale une voie apoptotique importante. Afin de déterminer si G503 induit l'apoptose par la voie mitochondriale, nous avons examiné les protéines liées à l'apoptose, le potentiel de la membrane mitochondriale (MMP), et l'ouverture de la MPTP pour confirmer l'induction de la voie apoptotique mitochondriale. Suivi par un traitement G503, la fluorescence mitochondriale diminué par rapport au groupe témoin (figure 5A), ce qui suggère le fait que le mPTP a été ouverte par G503. En outre, comme le montre la figure 5B, l'intensité de la fluorescence rouge /verte considérable a été observée dans le groupe témoin. Cependant, après le traitement avec 20 umoles /L de G503, l'intensité de la fluorescence rouge /verte a été réduite. Ce résultat suggère que G503 diminue le potentiel de la membrane mitochondriale des cellules SGC7901. En outre, le total des Cyto c
niveaux de protéines ne changent notamment entre le témoin et le groupe de la drogue; cependant, Cyto c
a été relocaliser dans le cytoplasme de la mitochondrie (Figure 5C). Bax et Bcl-2 sont des facteurs cruciaux dans la régulation des canaux mitochondriaux et la libération de diverses protéines liées à l'apoptose [27]. Par conséquent, nous avons étudié la distribution de Bax et Bcl-2 dans différents compartiments cellulaires et n'a pas observé un changement important dans les niveaux totaux de protéines de Bax et Bcl-2, entre le groupe témoin et le médicament; cependant, G503 a favorisé la translocation de Bax du cytoplasme vers les mitochondries, ainsi que la translocation de la protéine Bcl-2 à partir des mitochondries vers le cytoplasme (figure 5D). Pris ensemble, G503 induit l'apoptose dans les cellules SGC7901 par la voie mitochondriale.

G503 induit l'apoptose dans les cellules SGC7901 en partie par la caspase-4 activation

Caspase-4 peut activer directement caspase-9, mais pas par la voie mitochondriale [28] - [29]. Afin de déterminer si la caspase-4 est activé par G503 et si activé caspase-4 active caspase-9, nous avons examiné les fragments de clivage de la caspase-4 et -9. Les résultats indiquent que le fragment de clivage par la caspase-4 a augmenté de manière significative dans les cellules traitées avec G503 par rapport au groupe témoin (figure 6A). Le traitement avec l'inhibiteur de caspase-4-Z-LEVD FMK a augmenté la caspase-9 proforme, qui n'a pas été détecté dans le groupe traité par G503 (figure 6B). Ces résultats indiquent que G503 induit SGC7901 gastrique apoptose des cellules cancéreuses en partie grâce à l'activation de la caspase-4.

Discussion

Il est rapporté que p
-quinone fragment de quinone contenant des pièces moléculaires un rôle très important dans le potentiel anti-cancer [30]. Perchellet et al. ont également constaté que p-quinone J4, o-quinone J1 et non substitué modèle p-quinone J7 réduit le plus L1210 viabilité des cellules tumorales chez les huit composés synthétisés et filtrés dans leur étude préliminaire [31]. Pour comprendre la relation entre le potentiel anti-cancer altersolanol A et structure-activité, Teiten et al. évalué l'effet de altersolanol A et ses dérivés anthracéniques connexes: tetraacetylaltersolanol A, B et tetrahydroaltersolanol ampelanol. Ils ont constaté que seulement altersolanol A et son dérivé acétylé tetraacetylaltersolanol A présente un effet cytotoxique sur les cellules K562, alors que les dérivés avec la réduction de l'un des groupes carbonyle, tels que tetrahydroaltersolanol B et ampelanol, n'a pas d'effet [32]. Le p
-quinone structure du G503 (figure S1) peut également être contribué à l'apoptose des cellules cancéreuses, et dans la recherche suivante, nous allons analyser le G503 et ses dérivés pour identifier l'avant-relation structure-activité. Dans cette étude, nous constatons que la lignée cellulaire de cancer gastrique SGC7901 est la lignée cellulaire de cancer le plus sensible à G503 a examiné en utilisant un dosage de viabilité cellulaire dans neuf lignées de cellules cancéreuses et les deux lignées cellulaires normales. G503 induit SGC7901 gastrique mort des cellules cancéreuses par apoptose d'une manière dépendante de la dose. Un autre gastriques cellules cancéreuses AGS est également examiné, et est sensible à l'apoptose induite G503-aussi. Par conséquent, 20 pmol /L de G503 est la concentration optimale qui induit l'apoptose sévère.

Le génome humain code pour au moins 10 types d'homologues de la caspase. Les homologues de caspase suivants participent à l'apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 et -10 [33]. Bien que les caspases jouent un rôle dans l'apoptose, il existe plusieurs voies indépendantes caspase existent. Par exemple, en présence d'inhibiteurs de caspases, le facteur de nécrose tumorale (TNF) induit une nécrose cellulaire, qui possède les caractéristiques de l'apoptose et de la nécrose [34] - [36]. En outre, le facteur induisant l'apoptose (AIF) est une enzyme qui dégrade l'ADN directement l'ADN. Lorsque le potentiel de la membrane mitochondriale est altérée, l'AIF est libérée dans le cytoplasme de la mitochondrie et est activé par son interaction avec cyclophilinA [37] - [38]. Endo G peut également dégrader l'ADN directement d'une manière indépendante des caspases [39].

Dans notre étude, l'exposition G503 active caspase-3, -8 et -9 dans une dose et de manière dépendante du temps (Figure 2A, B; 3A, B; 4A, B). L'apoptose induite est G503-dépendante caspases? Lorsque les cellules sont co-traitées avec Z-VAD-FMK et G503, Z-VAD-FMK inhibe la caspase-9 et -3 activation (figure 2C, D) et le nombre de cellules apoptotiques induites par une diminution G503 (figure 2E), ce qui indique que les cellules SGC7901 apoptose induite par la G503-est caspase-dépendant. Pour distinguer si l'apoptose induite par G503-est dépendante de la caspase-8, -9, ou les deux, SGC7901 cellules ont été prétraitées avec Z-IETD-FMK et Z-LEHD-FMK, puis co-traitée avec G503. Les résultats indiquent que Z-IETD-FMK ne pas inhiber la caspase-9 et -3 activation (figure 3C), ni diminuer le nombre de cellules apoptotiques induites par G503 (figure 3D); Cependant, Z-LEHD-FMK a diminué le nombre de cellules apoptotiques (figure 4C). Ainsi, G503 induit l'apoptose des cellules SGC7901 ne dépend pas de la caspase-8, mais se trouve sur caspase-9.

Les mitochondries sont constituées d'une membrane externe, l'espace de la membrane et la matrice. protéines liées à Apoptose, tels que les proenzymes de caspases, Cyto c
et AIF existent dans l'espace de la membrane. Cependant, lorsque les pores formés dans la membrane mitochondriale externe ou la perméabilité est modifiée, ces protéines liées à l'apoptose sont libérés dans le cytoplasme. Les membres de la famille Bcl-2 contrôlent la perméabilité de la membrane mitochondriale externe et peut être divisé en deux éléments qui favorisent l'apoptose (par exemple, Bax et Bak) ou inhibent l'apoptose (tels que Bcl-2 et Bcl-xL). Les membres pro-apoptotiques favoriser la libération de protéines liées à l'apoptose, tels que Cyto c
, de la mitochondrie, alors que les membres anti-apoptotiques ont un effet inverse [40]. Bax existe principalement dans le cytoplasme, alors que Bcl-2 se combine avec des groupes hydrophobes à l'extrémité C-terminale de la bio-membrane de la cellule [41]. la structure Bax est modifiée au cours du stress externe afin qu'il se combine avec la membrane mitochondriale externe former tospontaneously une galerie par oligomérisation homologue. Cette action induit la libération des protéines liées à l'apoptose [42] ou la formation de la perméabilité de transition Pore mitochondries (MPTP), qui est constitué d'un anion canal dépendant de la tension (VDAC) sur la membrane et adénine mitochondriale nucléotidique translocateur externe (ANT) sur la membrane interne [43]. Bax interagit uniquement avec VDAC pour créer un pore ouvert lorsque les concentrations Bax sont faibles. En revanche, Bax interagit simultanément avec VDAC et ANT lorsque les concentrations Bax sont élevées pour ouvrir les pores dans la membrane interne et externe. Cette action réduit le potentiel de membrane interne, augmente la pression osmotique de la matrice mitochondriale, favorise la membrane interne de gonflement et augmente la pression osmotique de la membrane externe, ce qui favorise la libération des protéines liées à l'apoptose [26], [44] - [46 ]. Une étape importante dans la voie apoptotique mitochondriale est la libération de Cyto c
[47] - [49]. Cyto c
combine avec Apaf-1 et la caspase-9 proforme pour créer l'apoptosome. Apaf-1 expose son domaine d'oligomérisation, et l'activation de la caspase N-terminale et les domaines de recrutement (CARD) se combine avec la proforme CARTE caspase-9. Ainsi, la caspase-9 est activé et la caspase-9 clive des caspases en aval, comme caspse-3 et -7 activé. Caspases effectrices éventuellement clivent leurs substrats correspondants pour induire l'apoptose cellulaire [47], [49] - [50].

Dans cette étude, G503 augmente la proportion de Bax /Bcl-2 sur la membrane mitochondriale et une diminution le rapport Bax /Bcl-2 dans le cytoplasme (figure 5D). G503 favorise également mPTP ouverture et la réduction du potentiel de membrane mitochondriale (figure 5A, B). Puis, Cyto c
a été transféré de la mitochondrie vers le cytoplasme (Figure 5C). En outre, G503 favorise le transfert de Bax à la mitochondrie du cytoplasme et Bcl-2 dans le cytoplasme à partir des mitochondries. Augmentation de Bax et réduit Bcl-2 dans les mitochondries augmenter la perméabilité de la membrane mitochondriale externe et de promouvoir la libération de Cyto c
. La régulation de Bax /Bcl-2 par G503 peut être observé parce G503 est un composé moléculaire faible.

• PLOS ONE: Expression de XPG Protein dans le développement, la progression et le pronostic du cancer gastrique
• PLOS ONE: Résultats du traitement chirurgical et facteurs pronostiques de T4 gastriques patients atteints de cancer sans métastases à distance