PLoS ONE: Antrachinonas G503 indukuoja apoptozę skrandžio vėžio ląsteles per mitochondrijų būdas

Anotacija

G503 yra antrachinonas junginys, išskirtas iš antrinių metabolitų yra mangrovių endophytic grybelis iš Pietų Kinijos jūra. Šis tyrimas nušviečia priešnavikinis aktyvumas ir pagrindinės mechanizmą G503. Ląstelių gyvybingumas tyrimas atliekamas devyniose vėžio ląstelių linijų ir dviejų normalių ląstelių linijas parodė, kad skrandžio vėžys ląstelių linija SGC7901 yra labiausiai G503 jautrūs vėžinės ląstelės. G503 sukeltas SGC7901 ląstelių žūtį per apoptozės. G503 poveikio aktyvuotas kaspazių-3, -8 ir -9. Pirminis su visos kaspazės inhibitorių Z VAD-FMK ir kaspazės-9 inhibitorių Z-LEHD-FMK, bet ne kaspazės-8 inbibitor Z-IETD-FMK susilpninto apie G503 poveikį. Šie rezultatai rodo, kad vidinė mitochondrijų apoptozė kelias, o ne išorinė kelias, dalyvavo G503 sukeltos apoptozės. Be to, G503 padidėjo Bax santykis Bcl-2 mitochondrijų ir sumažėjo santykį, esantį citozolyje. G503 gydymas lėmė mitochondrijų depoliarizacijos, citochromo c išleidimo ir vėliau skilimo kaspazės -9 -3. Be to, jis pranešė, kad Endoplazminis tinklas apoptozė kelias taip pat gali būti aktyvuojamas G503, sukeldami capase-4 skilimo. Atsižvelgiant į apatinio 50% slopinanti koncentracija skrandžio vėžio ląsteles, G503 gali tarnauti kaip perspektyvi kandidatė skrandžio vėžio chemoterapijos

nurodomoji dalis:. Huang L Zhang, T Li S Duan J Jūs F Li H, ir kt. (2014) Antrachinonas G503 indukuoja apoptozę skrandžio vėžio ląsteles per mitochondrijų keliu. PLoS ONE 9 (9): e108286. Doi: 10,1371 /journal.pone.0108286

redaktorius: Javier S. Castresana, Navaros universitetas, Ispanija

Įstojo: Balandžio 19, 2014 m Priimtas rugpjūčio 19, 2014 m Paskelbta rugsėjo 30, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Huang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas: Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamta mokslo fondo Kinijos, dotacijos numeris:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; Nacionalinių pagrindinių Fantastika Technika Specialusis projektas Kinijoje, dotacijos numeris: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Programa, skirta doktorantūros stotis universitetas, dotacijos numeris: 20120171110053, 20130171110053; Pagrindiniai projekto Gamtos mokslo fondo Guangdong Province, Kinija, dotacijos numeris: 10251008901000009; Pagrindiniai Fantastika technologijų tyrimų projektas Guangdong Province, Kinija, dotacijos numeris: 2011B031200006; Guandong Gamtos mokslų fondas, dotacijos numeris: S2012010009250, S2012040006986; Pagrindiniai Fantastika technologijų tyrimų projektas Guangzhou savivaldybės, Kinija, dotacijos numeris: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programa, skirta jaunųjų mokytojas universitete, dotacijos numeris: 10YKPY28; Changjiang mokslininkų ir novatorišką mokslinių tyrimų komanda universitete, Numeris:. 985 projektas PCSIRT 0947. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

Konkuruojančios interesų: autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja.

Įvadas

chirurgija, radioterapija ir chemoterapija yra pirminiai klinikiniai naviko gydymo. Tačiau, chirurgija ir radioterapija yra neveiksmingi metastazavusiu vėžiu; jei chemoterapija būtų naudojami tinkamai, metastazės gali būti slopinamas [1]. Kalbant apie kovos su vėžio vaistų kūrimo, antraciklinai yra efektyviausia priešvėžinių vaistų [2]. Natūralūs produktai iš vandenynų yra svarbūs šaltiniai, naujų priešvėžinių vaistų [3]. Jūrų mikroorganizmų metabolitai, kurių unikalių statinių ir farmakologinių veikla paprastai yra naudojamas kaip pirmaujančių priešvėžiniai junginių [4]. Antrachinonas junginiams, pavyzdžiui, daunorubiciną, doksorubicino, epirubicino ir mitoksantrono, yra efektyviausias klinikinių priešvėžinių vaistų [2]. Jūrų antrachinonas SZ-685C slopina žmogaus krūties vėžio proliferaciją [5] - [6] ir žmogaus nosiaryklės (NPK) ląstelės [7]. Huang ir kt. parodė, kad Antrachinonai iš rabarbarų, pavyzdžiui, emodin Aloe-emodin ir Rhein, slopina augimą ir proliferaciją įvairių vėžinių ląstelių, tokių kaip plaučių adenokarcinoma, mieloblastine leukemijos, neuroblastoma, kepenų ląstelių karcinoma, šlapimo pūslės vėžio ir kitų [8].

iš priešvėžiniai aktyvumo antrachinonai mechanizmas yra visų pirma dalyvauja šių aspektų [9] - [10]: DNR sąveikos su prisijungimu interkaliacinių ir trukdo atskyrimą DNR dvigubos krypties; tiesiogines membraniniai poveikis; DNR pažeidimai reaguojant į topoizomerazės II slopintų ar laisvųjų radikalų, pavyzdžiui, aktyvių deguonies formų (ROS) generavimą, ir apoptozės indukcija per topoizomerazės II slopinimo, funkcinio p53 arba ROS kartos. Be to, Antrachinonai taip pat sukelti apoptozę per JNK (c-birželis N-terminalas kinazės) [11], AKT /PKB (Baltymų kinazės B) [5], [12] ir mitochondrijų keliai [13] - [14].

G503 yra antrachinonas junginys, išskirtas iš antrinių metabolitų mangrovių endophytic grybelio Nr 1403 iš Pietų Kinijos jūroje [15] .Tačiau ar G503 turi kaip antrachinonas junginio vėžio potencialą nebuvo tirtas. Todėl šis tyrimas buvo skirtas išsiaiškinti priešnavikinis aktyvumas G503 ir pagrindinis mechanizmas dalyvauja.

Medžiagos ir metodai

Chemija ir reagentai

3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylterazolium bromidas (MTT) ir ROS sugėriklis N-acetil-cisteino (ŠAT) buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Hochest 33342, karboksi-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Analizės komplektas ir MitoProbe Perėjimas Porų Analizės komplektas (M34153) buvo gauti iš Invitrogen (JAV). Aneksinu-FITC (fluoresceino izotiocianato) /PI (propidiumo jodidas) Apoptozę nustatymo rinkinys buvo įsigytas iš keygen (Nanjing, Jiangsu, Kinija). RPMI1640 vidutinio ir vaisiaus jaučio serumo (FBS) buvo iš Hyclon (Logan, UT, USA, ).
Kaspazės-8 inhibitorius Z IETD-FMK, kaspazės-9 inhibitorius Z LEHD-FMK ir kaspazės šeimos inhibitorių Z VAD-FMK buvo iš CalBiochem (Gibbstown, NJ, JAV) ir Beyotime (Kinija). Antikūnai prieš kaspazė-3, kaspazės-4, kaspazės-8, kaspazės-9 ir COXIV antikūnų buvo iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos (Beverly, MA, JAV). Antikūnai prieš citochromo C
, Bax, BCL-2, p38 p-p38 ir anti-ožka LGG-HRP buvo iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). Pelės anti-β-aktino ir anti-GAPDH pagrindinis antibodywere iš Sigma-Aldrich (St Louis, MO, JAV). Anti-triušis LGG-peroksidazės ir anti-pelės IgG peroksidazės buvo nuo ligos sukėlėjus pernešančių (Burlingame, CA, JAV) .Mitochondria izoliacija komplektas buvo pirktas iš Pierce (Pierce, IL, JAV), baltymų tyrimo rinkinys buvo įsigytos iš Bio-Rad (Hercules , CA, JAV) ir ECL aptikimo rinkinys buvo iš Applygen Technologies Inc (Pekinas, Kinija).

fermentacija, ekstrahavimas ir izoliavimas G503 iš Nigrospora
sp. Nr 1403

NO.1403 buvo izoliuotas nuo irstančios medienos yra Kandeliacandel
(L.) Druce ir reidentified kaip Nigrospora
sp. (Prisijungimas GeneBank numeris: HQ891110), surinkti iš Mai Po, Honkongas, ir druskos ežeras Bahamų. G503 buvo izoliuoti ir išgrynintasis iš antrinių metabolitų NO. 1403 [15]. Raugo kultūrų buvo išlaikyta Kukurūzų miltai `jūros vandens agaro. Kištukai agaro patvirtinantys miceliniu augimą buvo supjaustyti ir steriliai perkeliamas į 250 ml Erlenmejerio kolbą, kurioje yra 100 ml skystoje terpėje (gliukozės 10 g /l, peptono 2 g /l, mielių ekstraktas 1 g /l NaCl _{2 g /L, pH D 7.0). Esantį kolboje, buvo inkubuojamos 28 ° C temperatūroje. Po to, kai purtant sukamajame maišytuvu 3-5 dienas, grybiena buvo steriliai perkeliami į 500 ml Erlenmejerio kolboje su kultūra skystį (200 ml). tada kolbą inkubuojamos 28 ° C temperatūroje 25 dienas.}

kultūrų (150 l) buvo filtruojamas per marlę. Filtratas sukoncentruotas iki 5 L yra mažesnis nei 50 ° C ir ekstrahuojamas tris kartus plakant su tokio paties tūrio etilo acetatu. Sumaišyti organiniai ekstraktai buvo atliktas per silikagelio kolonėlę, ir eliuojami iš petrolio eteriu gradientą etilo acetato, siekiant gauti junginį,.

junginys buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO) ne vertybinių popierių koncentracija, lygi 50 mmol /l ir atskiesti iki konkrečių koncentracijos prieš naudojimą

Mobilaus ryšio kultūra

HUVECs buvo izoliuota nuo žmogaus bambos venos virvėmis normaliomis parturitions ir kultūringas po protokolo aprašyta anksčiau [16] -. [ ,,,0],17]. Chang kepenų ląstelių ir navikų ląstelių linijas patobulinti-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, rb, PC3, A549 ir ​​SGC7901, AGS išliko mūsų laboratorijoje ir kultivuojamos RPMI1640 terpė papildyta 10% FBS, 100 V /ml streptomicino ir 100 V /ml penicilino (Gibco) 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _{2. Šis tyrimas atitinka nurodytus principus, Helsinkio deklaraciją, kurią medicinos etikos komiteto Sun Yat-Sen universiteto patvirtintą ir raštu informuoti sutikimas buvo gautas iš donoro.}

Mobilusis gyvybingumo tyrimą

ląstelės buvo pasėjamos esant tankio 2 × 10 ^{4 ląstelių /ml, 24-duobučių lėkštelėse (HUVECs buvo pasėjamos į želatinos dengtos 24 duobučių plokštelėse). Kai ląstelės pasiekti ne mažesnis kaip 60% -70% tankis, jie buvo gydomi įvairios koncentracijos G503 48 h į RPMI1640 terpėje (1 ml /duobutėje) be FBS; neigiamos kontrolės grupės buvo gydomi PBS. Vėliau, 100 pL MTT (5 mg /ml), ištirpinto PBS buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojami už papildomą 4 h, kad būtų galima už formazancrystals formavimas. Kristalai buvo ištirpinta 1 ml DMSO kiekvieną šulinėlį. Optinis tankis (OT) vertės raudonos sprendimą, kuris atstovauja ląstelių gyvybingumui buvo matuojamas 570nm [18] - [19]. Po trijų nepriklausomų eksperimentų, ląstelių išgyvenimas buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: išlikimo (%) = (reiškia eksperimentinio OD vertę /reiškia kontrolės OT vertę) × 100%. Vertės buvo išreikšta 50% slopinanti koncentracija (SSD _{50), kuri buvo apskaičiuota pagal regresijos metodu tiesinio intervalo.}}

Hoechst 33342 dažymo tyrimas

SGC7901 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse, kai jo tankis 10 ^{5 ląstelės per gerai ir gydomi G503 koncentracija svyravo nuo 0 mikromoliai /L 40 mkmol /l 24 h. Ląstelės buvo pažymėtas 10 mikrogramų /ml Hoechst 33342 [20] 10 min 37 ° C temperatūroje ir stebimas naudojant fluorescencijos mikroskopijos ( "Olympus X71-A12FL /Ph).}

ir prie aneksino V-FITC /PI dažymo tyrimas

SGC7901 ląstelės buvo renkami tankio 5 × 10 ^{5 į 5 × 10 6 /ml po G503 gydymo, kurio koncentracija svyruoja nuo 0 mikromoliai /L 40 mkmol /l 24 h 6-duobučių lėkšteles; ląstelės, gydomiems 25 mikromoliai /L kolchicino buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Po to ląstelės buvo plaunamos ir nudažomi pagal gamintojo instrukcijas (ir prie aneksino V-FITC /PI Apoptozę aptikimo rinkinys). Trumpai, ląstelės buvo resuspenduotos 500 pL 1 × rišikliais buferį. Be to, 5 pL AnnexinV-FITC ir 5 pL 20 mikrogramų /ml PI buvo įtraukta į mėginio ir inkubuojami kambario temperatūroje 15 min, tamsoje. tada tamsintas mėginiai buvo įvertintas tėkmės citometrijos (Becton Dickinson, NJ, JAV) nustatyti apoptozinių ląsteles.}

nustatymas mitochondrijų membranos potencialas

SGC7901 ląstelių buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse. Pasiekus ne mažesnis kaip 60% tankis, ląstelės buvo gydomi 20 mikromoliai /L G503 18 h ir tada surinkti įvertinti mitochondrijų membranos potencialą pagal gamintojo rekomendacijas (MitoProbe DiOC2 (3) Analizės rinkinys). Trumpai, 1 × 10 ^{6 /mL ląstelės buvo resuspenduotos 37 ° C PBS. Teigiamas kontrolinės grupės iš anksto buvo gydomi 1 pL 50 m M /L CCCP 37 ° C temperatūroje 5 min. Visi iš šių grupių tada buvo gydomi 5 pL 10 mkmol /L DiOC _{2 (3) 30 min 37 ° C temperatūroje ir įvertinti tėkmės citometrijos metodą. Mitochondrinė membrana potencialas buvo apskaičiuojamas remiantis pagal šią lygtį:. Mitochondrijų membranos potencialas = (raudona fluorescencija intensyvumas) /(žalia fluorescencijos intensyvumas)}}

Detekcija ir mitochondrijų Pralaidumas Transition porėtos (mPTP) atidarymo

SGC7901 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse. Pasiekus 60% tankis, ląstelės buvo gydomi 20μmol /L G503 už 18h ir surinkti įvertinti mPTP atidarymo tėkmės citometrijos (Becton Dickinson, NJ, JAV) pagal gamintojo protokolu (MitoProbe Perėjimas Porų Analizės Kit). Trumpai, kiekvienas mėginys buvo padalintas į 3 alikvotose ir apdorojimo taip: alikvotinė 1 buvo gydomi 5 pL 2 mikromoliai /L chalceino AM tamsoje; alikvotinė 2 buvo gydomi 5 iL chalceino AM ir 5 iL 80 mmol /l CoCl _{2 tamsoje; ir alikvotinė 3 buvo gydomi 5 iL chalceino AM, 5 iL CoCl 2 ir 5 pL 100 mikromoliai /L ionomycin. tada imami mėginiai inkubuojami 37 ° C temperatūroje 15 min tamsoje. Po to, kai nuplauti HBSS /Ca ^{2 + ir vėl sustabdytas 400 iL HBSS /Ca 2 + ląstelės buvo įvertintas tėkmės citometrijos per 1 h. MPTP atidarymo sąlyga apskaičiuojama taip: (fluorescencija alikvotinės dalies 2- iš alikvotinės dalies 3 fluorescencijos) /(iš alikvotinės dalies 1- iš alikvotinės dalies 3 fluorescencijos fluorescencija). Chalceino AM įsiskverbia į citoplazmą organoidus įskaitant mitochondrijas. CoCl 2 malšina chalceino AM fluorescenciją citoplazmoje, bet ne į mitochondrijas. Chalceino AM translocates į citoplazmą iš mitochondrijų kai mPTP atidarytas, o fluorescencija sumažintos CoCl 2.}}

išskyrimas ląstelių mitochondrijose ir citoplazma

SGC7901 ląstelės buvo padengtas į 100 mm plokštelės; kiekviena grupė buvo padengtas į dvi plokštės. Po to, kai pasiekti 60% -70% santaką, ląstelės buvo apdorotas arba be 20 mikromoliai /L G503 už 18 h. Po gydymo, buvo gauti mitochondrijų ir citoplazminio frakcijos pagal gamintojo instrukcijas (Mitochondrija izoliacija rinkiniui).

imunoblotingu analizė

Kaip aprašyta anksčiau, ląstelės buvo lizuojamos į Ripa buferio [21] , Baltymų koncentracijos mitochondrijas, citoplazmos ir sveikų ląstelių buvo aptikta BCA metodu, naudojant Bio-Rad baltymų reagentq rinkini. Iš viso, 60 mikrogramų baltymai iš kiekvienos grupės buvo atskirtos 12% arba 15% natrio dodecilsulfatas-poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE). Baltymai iš SDS-PAGE buvo perkeltas į PVDF membrana. Po to, kai nespecifinių jungimosi vietų Membranos buvo užblokuotas 1-2 valandas kambario temperatūroje su TBST buferio, turinčio 10% lieso pieno, membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C su pirminiais antikūnais pagal gamintojo instrukcijas. Antriniai antikūnai su arba be fluorescencijos konjuguotas su atitinkamų pirminių antikūnų buvo inkubuojami 2 valandas kambario temperatūroje. Membranos su liuminescencinėmis antrinių antikūnų buvo įvertintas naudojantis Odisėjos sistemą (Li-COR, Nebraska, Jungtinės Amerikos Valstijos) nuskaityti liuminescencines juostas [22], o membranos su normaliomis antrinių antikūnų buvo ryškinamos naudojant ECL aptikimo rinkinį immunoblots. Membranos buvo atimta ir vėl tyrinėjo su beta-aktino ar COXIV antikūnų. β-aktino buvo naudojamas kaip vidinis standartas viso ląstelių lizato ir ekstrahavimo citoplazmos, kadangi COXIV buvo naudojama kaip pagrindas ekstrakcijoje mitochondrijų kontrolės. Densitometric analizė juostų buvo atliekama naudojant Kiekis One (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) [23].

Statistinė analizė

buvo pristatyti visi duomenys, kaip tai ± SD bent trigubas nustatymų , SPSS 13.0 programinė įranga buvo naudojama Stjudento t kriterijus ir vienpusio dispersinė analizė (ANOVA) visų statistinės analizės. P
vertė 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas visais atvejais.

Rezultatai

G503 slopinamos dėl neplatinimo yra stiprus ir SGC7901 ląstelių tarp 11 tirtų ląstelių linijų

Mes naudojome MTT nustatyti, ar antrachinonas junginys G503 yra citotoksinis šiose ląstelių linijų: dvi normalias ląstelių linijos (žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) ir Chang kepenų ląstelės ir devyni naviko ląstelių linijas (HONE -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 ir ​​SGC7901). Visos ląstelės buvo inkubuojamos su 0, 2,5, 5, 10, 20 arba 40 mkmol /L G503 už 48 h. Mobilaus ryšio viabilities buvo matuojami naudojant MTT kaip minėta, ir IC _{50 vertė SGC7901 ląstelių buvo mažiausia, o IC 50 vertės normalių ląstelių linijų, HUVEC ir Chang kepenų ląstelės, buvo gerokai didesnis nei SGC7901 ( 1 lentelė).}

G503 indukuoja apoptozę SGC7901 ir AGS skrandžio vėžio ląstelių

Atsižvelgiant į tai, SGC7901 ląstelių linija buvo jautriausios G503 iš vienuolikos ląstelių linijų išnagrinėjo (1 lentelė), mes toliau tiriama šį ląstelių linijos atskirai. SGC7901 ląstelės buvo tamsintas su Hoechst 33342 siekiant nustatyti, ar slopinantis poveikis buvo susijęs su apoptozės. Rezultatai rodo, ląstelių, kurioms būdingi branduolinę susitraukimą ir chromatino kondensaciją didėjant G503 koncentracija (1a paveikslas) skaičiaus padidėjimą. Be to, siekiant ištirti, ar G503 indukuoja apoptozę kitų skrandžio vėžio ląstelių linijų, taip pat buvo išnagrinėti AGS skrandžio vėžio ląstelės. Aneksinu /PI dažymo dirbo analizuoti G503 poveikį SGC7901 ir AGS skrandžio vėžio ląstelių tėkmės citometrijos. Už šių eksperimentų, 25 mkmol /L kolchicino buvo naudojamas kaip teigiama kontrole. Po gydymo 0 mkmol /l 2,5 mkmol /l 5 mkmol /l 10 mkmol /l 20 mkmol /l ir 40 mikromoliai /L G503 ir 25 mkmol /L colchicines 24 h, apoptozinių SGC7901 ląstelių procentas buvo 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% ir 20,69% ± 1.91% atitinkamai (1b paveikslas); iš apoptozinių AGS ląstelių procentas buvo 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9.42% 47.51% ± 18.29% ir 31.49% ± 2,45%, atitinkamai (1c pav). Iš apoptozę AGS ląstelių ir pirmiau minėtus rezultatus aptikimo nurodė, kad G503 skatina skrandžio vėžio ląstelių apoptozę dozės priklausomu būdu.

G503 indukuoja apoptozę kaspazės priklausomu būdu

Jei toliau tirti mechanizmas dalyvauja G503 sukeltos apoptozės skrandžio vėžio ląsteles, mes studijavo SGC7901 ląsteles. Kaspazės-3 efektoriaus kaspazės, kad galite įvesti branduolį ir tiesiogiai bendrauti su savo substrato, taip skatinant ląstelių apoptozę [24]. Caspse-9 yra iniciatorius kaspazės kad aktyvuoja caspse-3 [25]. Ląstelės buvo gydomi įvairių G503 koncentracijų nurodyto laiko ir surinkti įvertinti kaspazę-3 ir -9 Imunoblotingo metodu. Į tai, kaspazės-3 pirmtakas išraiška sumažėjo nuo dozės ir laiko priklausomu būdu, kadangi kaspazė-3 skilimo fragmentai padidėjo nuo dozės ir priklausomai nuo laiko, mados (2A pav B). Į tai, kaspazės-9 pirmtakas sąvoka taip pat sumažėjo, o skilimo fragmentai padidėjo po to, kai ląstelės buvo gydomi 20 mikromoliai /L G503 24 h (2c pav). Šie poveikiai yra panaikintos visos kaspazės inhibitorių Z VAD-FMK (pav 2C, D). Suderinamas su kaspazės-9 ir -3 aktyvavimo, apoptozės mobilieji normos sukeltų sukeltos 20 mikromoliai /L G503 į SGC7901 ląstelių buvo ženkliai sumažintas po pirminio Z-VAD-FMK (2e pav). Šie duomenys rodo, kad G503 indukuoja apoptozę SGC7901 ląstelių kaspazės priklausomu būdu.

G503 sukeltos apoptozės nepriklauso nuo kaspaze 8

Jei ištirti, ar mirties receptorių tarpininkaujant apoptozės kelias yra sukeliama G503, mes tiriamas kaspazės-8, iniciatorius kaspazė iš mirties receptoriaus medijuojamo apoptozės keliu [26]. SGC7901 ląstelės buvo gydomi įvairių dozių G503 už nurodyto laiko. Ląstelės buvo surinkti matuoti kaspazę-8 pagal Vakarų blotingo metodu. Rezultatai parodė, kad kaspazės-8 pirmtakas sumažėjo ir suskaldyti kaspazės-8 išaugo nuo laiko ir dozės priklausomu būdu (3a pav B). Ląstelės buvo iš anksto apdorotas su 20 mkmol /L kaspazės-8 inhibitoriaus Z-IETD-fmk 30 min ir po to yra veikiamas 20μmol /L G503 24 h. Kaspazės-8 PROFORM padidėjo ląstelių kartu gydomi kaspazės-8 inhibitoriais ir G503, palyginti su ląstelėmis gydomų tik G503. Tačiau kaspazės-9 PROFORM, suskaldyti kaspazės-9 ir kaspazės-3 išliko panašaus lygio ląstelėse gydomi kaspazės-8 inhibitoriais ir G503 arba G503 tik (3c pav.) Suderinamas su Fig.3C, G503 sukeltos apoptozinių ląstelių normos SGC7901 ląstelių nebuvo sumažintas apdorojimo su Z-IETD-FMK (3D paveikslas). Šie duomenys rodo, kad, nepaisant aktyvavimo G503, kaspazės-8 nedalyvauja proapoptozinis veiklos G503.

G503 sukeltos apoptozės priklauso nuo kaspaze 9

kaspazės-9, iniciatorius kaspazės iš mitochondrijų apoptozės kelias, gali būti aktyvuota derinant su citochromo c
(Cyto c
) ir aprotoninis proteazės įsijungiantis faktoriaus-1 (aPAF-1) [25] - [26]. Toliau tirti, ar mitochondrijų kelias dalyvauja G503 sukeltos apoptozės, kad kaspaze 9 aktyvavimo buvo išnagrinėta po G503 gydymo įvairiais koncentracijos ir laiko. Be to, apoptozės mobilųjį norma taip pat buvo matuojamas nuo bendro elgesio su G503 ir kaspazės-9 inhibitorių Z-LEHD-FMK. Rezultatai parodė, kad kaspazė-9 PROFORM sumažėjo, o skilimo fragmentai didėjo laiko ir dozės priklausomu būdu (4a paveiksle, B). Be to, ląstelės buvo iš anksto apdorotas su 20 mikromoliai /L Z-LEHD-fmk 30 min ir bendro-inkubuojamos su 20 mikromoliai /L G503 24 h. Kiekybiškai apoptozės ląsteles, ląstelės buvo tamsintas su AnnexinV /PI ir analizuojami tėkmės citometrijos metodą. Rezultatai parodė, kad apoptozės ląstelių lygis sumažėjo, kai ląstelės buvo bendrai gydomi Z-LEHD-FMK ir G503 (4c pav). Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad G503 sukeltos SGC7901 ląstelių apoptozė yra priklausoma nuo kaspaze 9 aktyvacijos.

G503 indukuoja apoptozę per mitochondrijų apoptozės kelias

Jis yra gerai žinoma, kad mitochondrijų būdas yra svarbus aprotoninis kelias. Ištirti, ar G503 indukuoja apoptozę per mitochondrijų keliu, mes išnagrinėjo apoptozę susijusių baltymų, mitochondrijų membranos potencialą (MMP), o mPTP atidarymo patvirtinti, kad mitochondrijų apoptozės kelias indukcijos. Vykdykite G503 gydymo, mitochondrijų fluorescencija sumažėjo, palyginti su kontroline grupe (5a pav), taip daryti prielaidą, kad mPTP atidarė G503. Be to, kaip parodyta 5B pav, didelis raudonas /žalias fluorescencija intensyvumas buvo pastebėtas su kontroline grupe. Tačiau po gydymo 20 mikromoliai /L G503, raudona /žalia fluorescencijos intensyvumas buvo sumažintas. Šis rezultatas rodo, kad G503 mažėja mitochondrijų membranos potencialą SGC7901 ląsteles. Be to, viso Cyto C
baltymų kiekis ne pirma pakeisti tarp kontrolės ir narkomanijos grupės; Tačiau Cyto C
buvo relocalized į citoplazmą iš mitochondrijų (5c pav.) Bax ir BCL-2 yra esminiai veiksniai mitochondrijų kanalų reguliavimo ir įvairių apoptozę susiję baltymų [27] išleidimo. Taigi, mes studijavo Bax ir BCL-2 pasiskirstymą skirtingose ​​korinio skyrių ir nesilaikė svarbų pokytį bendro baltymų lygius Bax ir BCL-2 tarp kontrolės ir narkomanijos grupės; Tačiau, G503 skatino Bax translokaciją iš citoplazmos į mitochondrijų, taip pat Bcl-2 perkėlimas iš mitochondrijų į citoplazmą (5D pav). Kartu paėmus, G503 indukuoja apoptozę SGC7901 ląstelių per mitochondrijų keliu.

G503 indukuoja apoptozę SGC7901 ląstelių dalis per kaspazės-4 aktyvavimo

kaspazės-4 gali tiesiogiai aktyvuoti kaspazės-9, bet ne per mitochondrijų keliu [28] - [29]. Ištirti, ar kaspazės-4 įjungiama G503 ir ar įjungta kaspazės-4 aktyvuoja kaspazės-9, mes išnagrinėjome skilimo fragmentus kaspazė-4 ir -9. Rezultatai parodė, kad kaspazė-4 skaldymas fragmentas žymiai padidėjo ląstelių, gydytų G503, palyginti su kontroline grupe (6a paveikslas). Gydymas su kaspazės-4 inhibitorių Z-LEVD-FMK padidino kaspazės-9 PROFORM, kuris nebuvo aptikta G503 gydymo grupėje (6B pav.) Šie rezultatai parodė, kad G503 skatina SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių apoptozę dalis per kaspazės-4 aktyvacijos.

Diskusijos

Jis pranešė, kad p
-quinone liekana quinone -Kurių sudėtyje Molekulinė vaidina labai svarbų vaidmenį kovos su vėžio galimo [30]. Perchellet ir kt. Taip pat nustatyta, kad P-chinono J4, O-chinono J1 ir nepakeisti modelis P-chinono J7 sumažino labiausiai L1210 auglio ląstelių gyvybingumą tarp aštuonių junginių susintetintų ir patikrintų jų preliminarų tyrimą [31]. Norėdami suprasti tarp priešvėžiniais potencialo altersolanol A ir struktūros ir aktyvumo, Teiten kt santykius. įvertino altersolanol A ir su juo susijusių antraceno išvestinių finansinių priemonių poveikio: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B ir ampelanol. Jie nustatė, kad tik altersolanol A ir jo acetilintu išvestinių tetraacetylaltersolanol Dovana citotoksinis poveikis K562 ląstelių, o išvestinių finansinių priemonių mažinant vieną iš karbonilo grupių, tokių kaip tetrahydroaltersolanol B ir ampelanol, neturės jokio poveikio [32]. P
-quinone struktūros G503 (S1 paveiksle) taip pat gali būti prisidėta prie vėžio ląstelių apoptozę ir kitą mokslinių tyrimų mes analizuoti G503 ir jo darinius nustatyti preliminarią struktūros ir aktyvumo santykio. Šiame tyrime mes pastebėjome, kad skrandžio vėžio ląstelių linija SGC7901 yra labiausiai G503 jautrus vėžio ląstelių linija tiriama naudojant mobilųjį gyvybingumo tyrimą devyniose vėžio ląstelių linijų ir dviejų normalių ląstelių linijų. G503 skatina SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių žūtį per apoptozės dozės priklausomu būdu. Dar skrandžio vėžio ląstelių AGS taip pat išnagrinėjo, ir yra jautrus G503 sukeltos apoptozės taip pat. Kaip rezultatas, 20 mkmol /L G503 yra optimalus koncentracija, sukelianti sunkia apoptozę.

žmogaus genomo koduoja ne mažiau kaip 10 rūšis kaspazės homologai. Šie kaspazė homologai, dalyvauti apoptozės: kaspazė-2, -3, -8, -9 ir -10 [33]. Nors kaspazių vaidinti svarbų vaidmenį apoptozės, yra įvairių kaspazės nepriklausomi keliai egzistuoja. Pavyzdžiui, į kaspazės inhibitorių, auglio nekrozės faktoriaus (TNF) sukelia ląstelių nekrozė, kuri turi apoptozės ir nekrozės [34] charakteristikas - [36]. Be to, apoptozės skatinančius faktorius (AIF), yra DNR fermento, kuris tiesiogiai skyla DNR. Kai mitochondrijų membranos potencialas yra prastesnis, AIF išleidžiami į citoplazmą iš mitochondrijų ir įjungiamas jo sąveika su cyclophilinA [37] - [38]. Endo G taip pat gali pabloginti DNR tiesiogiai kaspazės nepriklausomas būdu [39].

Mūsų tyrimo duomenimis, G503 poveikis aktyvuoja kaspazės-3, -8 ir -9 į dozės ir laiko priklausomu būdu (pav 2A, B; 3A, B; 4A, B). Ar G503 sukeltos apoptozės priklauso nuo kaspazių? Kai ląstelės buvo bendrai gydomi Z-VAD-FMK ir G503, Z-VAD-FMK slopina kaspaze 9 ir -3 aktyvinimas (pav 2C, D) ir sumažėjo nuo apoptozinių ląstelių sukeltų G503 numeris (2E paveikslas), kartu nurodant, kad G503 sukeltos SGC7901 ląstelių apoptozę yra kaspazės priklausomas. Kad būtų galima atskirti, ar G503 sukeltos apoptozės priklauso nuo kaspazė-8, -9 arba abu, SGC7901 ląstelės buvo išvalytos su Z-IETD-FMK ir Z-LEHD-FMK ir tada bendrai gydomi G503. Rezultatai rodo, kad "Z-IETD-FMK netrukdytų kaspazės-9 ir -3 aktyvavimo (Fig.3C), nei sumažinti apoptozinių ląstelių sukeltų G503 (3D paveikslas) numerį; Tačiau Z LEHD-FMK sumažino apoptozinių ląstelių (4c pav) skaičių. Taigi, G503 sukeltos SGC7901 ląstelių apoptozė nepriklauso nuo kaspazė-8, bet yra kaspaze 9 d.

mitochondrijos susideda iš išorinės membranos, membrana kosmoso ir matricos. Apoptozę susijusių baltymus, tokius kaip kaspazė profermentai, Cyto c
ir AIF, egzistuoja membranos erdvėje. Tačiau, kai poras formuojasi išorinėje mitochondrijų membranos arba pralaidumas yra pakeista, šie apoptozę susiję baltymai yra išmetami į citoplazmą. Nariai Bcl-2 šeimos kontroliuoti išorinio mitochondrijų membranos pralaidumą, ir gali būti suskirstyti į dvi narių, kurie skatina apoptozę (pavyzdžiui, "Bax ir Bak) arba slopina apoptozę (pavyzdžiui, Bcl-2 ir Bcl-XL). Proapoptotinį prisijungę skatinti apoptozės susijusių baltymų, pavyzdžiui, Cyto C pervežimas spaudai, iš mitochondrijų, o anti-Apoptozinės nariai turi priešingą poveikį [40]. Bax visų pirma egzistuoja citoplazmoje, kadangi Bcl-2 sujungia su hidrofobinių grupių C-terminalo ląstelės biologinių membranos [41]. Bax struktūra pasikeitė per išorinį stresą, kad ji sujungia su išoriniu mitochondrijų membranos tospontaneously suformuoti homologinės oligomerizuoti galeriją. Šis veiksmas sukelia apoptozės susijusių baltymų [42] arba iš mitochondrijų Pralaidumas Transition porų (mPTP), kuris susideda iš įtampos priklausomų anijonų kanalu (VDAC) ant išorinės mitochondrijų membranos ir adenino nukleotidų translocator (ant) formavimas spaudai vidinis membrana [43]. Bax sąveikauja tik su VDAC sukurti atvirą porų, kai BAX koncentracija yra maža. Priešingai, Bax vienu metu sąveikauja su VDAC ir Anti kai BAX koncentracija yra didelė, atidaryti poras vidinėje ir išorinėje membranoje. Šis veiksmas sumažina vidinį membranos potencialą, didina osmosinį slėgį Mitochondrija, skatina vidinį membraną patinimą ir didina osmosinį slėgį išorinės membranos, tokiu būdu skatinant apoptozės susijusių baltymų [26], [44] Išleidimo - [46 ]. Svarbus žingsnis mitochondrijų apoptozės kelias yra Cyto spaudai, C
[47] - [49]. Cyto C
dera su aPAF-1 ir kaspazės-9 PROFORM sukurti apoptosome. APAF-1 atskleidžia savo oligomerizuoti domeną, ir N-galinio kaspazės aktyvavimo ir įdarbinimo domenai (kortelės) dera su kaspazės-9 PROFORM kortelę. Tokiu būdu, kaspazės-9 yra įjungtas, o aktyvintas kaspazė-9 skaldo tolesni kaspazių, pavyzdžiui, caspse-3 ir -7. Efektoriaus kaspazių galiausiai suskaido savo atitinkamus substratai sukelti ląstelių apoptozę [47], [49] - [50].

Šiame tyrime G503 padidina dalis Bax /BCL-2 dėl mitochondrijų membranos ir sumažėja Bax /BCL-2 santykis citoplazmą (5d pav.) G503 taip pat skatina mPTP atidarymo ir mitochondrijų membranos potencialą (pav 5A, B), mažinimui. Tada Cyto C
buvo perkeltas iš mitochondrijų į citoplazmą (5c pav.) Be to, G503 skatina Bax pervedimą į mitochondrijas nuo citoplazmos ir BCL-2 į citoplazmą nuo mitochondrijas. Padidėjęs "Bax ir sumažinta BCL-2 į mitochondrijas padidinti mitochondrijų išorinės membranos prasiskverbti ir skatinti Cyto C pervežimas spaudai. Iš Bax /BCL-2 reglamentavimas G503 galima pastebėti, nes G503 yra mažas molekulinis junginys. Tai yra įmanoma, kad G503 tiesiogiai patenka į ląsteles ir dera su Bax ir BCL-2 pakeisti savo struktūras, sukeliant Bax privalomas išorinio mitochondrijų membranos ir BCL-2 paleidimo iš mitochondrijas.

Keletas tyrimų parodė, kad ROS kartos yra būtinas antrachinonas sukeltas apoptozę vėžinių ląstelių [51] - [52]. ROS yra stiprus induktorius oksidacijos žalą, kuri gali sukelti bazinių porų oksidacijos, taip pat depurinated ir aldehydic DNR [44], [46], [48], nepaisant to žala gali būti skaitliukas Dažniausios antioksidantų, kurių raiška yra tarpininkaujant Toll

• PLoS ONE: išraiška XPG baltymų plėtros, raidą ir prognozes Skrandžio Cancer
• PLoS ONE:. Chirurginiai išeitys ir prognozės veiksniai T4 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams be Tolima Metastasis