Plos ONE: Antrakinon G503 inducira apoptozo v želodcu raka celic skozi mitohondrijske Pathway

Povzetek

G503 je antrakinon spojina izolirana iz sekundarnih metabolitov v mangrove endophytic gliv iz Južno kitajsko morje. Te študije pojasnjuje aktivnost proti tumorjem in mehanizma, G503. Viabilnost celic test izvedemo v devetih raka celičnih linijah in dveh običajnih celičnih linij so pokazale, da je rak celična linija želodčni SGC7901 najbolj G503 občutljive rakave celice. G503 povzroča SGC7901 celično smrt z apoptozo. izpostavljenosti G503 aktivirane kaspaze-3, -8 in -9. Predobdelava s pan-kaspaze zaviralec Z-VAD-FMK in zaviralec kaspaze-9 Z-LEHD-FMK, ne pa tudi kaspaze-8 inbibitor Z-IETD-FMK, oslabljen učinek G503. Ti rezultati kažejo, da je notranja mitohondrijska apoptoza pot, ne pa zunanja pot, je bila vključena v-G503 inducirane apoptoze. Poleg tega, G503 poveča razmerje Bax, da Bcl-2 v mitohondrijih in zmanjšan delež v citosolu. Zdravljenje G503 povzročilo mitohondrijske depolarizacijo, citohrom c sproščanje in kasnejšo cepitvijo kaspaze -9 in -3. Poleg tega je poročal, da se lahko Endoplazemski Retikulum apoptoza pot aktivira tudi G503 z indukcijo capase-4 dekolte. V zameno za nižjo 50% inhibitorno koncentracijo za želodčne rakavih celic, lahko G503 služi kot obetaven kandidat za želodčne kemoterapiji raka

Navedba. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Antrakinon G503 inducira apoptozo v želodcu raka celice preko mitohondrijske Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286

Urednik: Javier S. Castresana, University of Navarra, Španija

Prejeto: 19. april 2014; Sprejeto: 19. avgust 2014; Objavljeno: 30. september 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. V avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje: Ta študija je bila podprta z National Nature Science Foundation Kitajske, število Grant:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech posebnega projekta Kitajske, številka Grant: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Program za doktorski postaji v univerze, število Grant: 20120171110053, 20130171110053; Ključ Projekt Nature Science Foundation v provinci Guangdong, Kitajska, število Grant: 10251008901000009; Key Sci-tech Raziskava iz province Guangdong, Kitajska, število Grant: 2011B031200006; Guandong Naravoslovna sklad, število Grant: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-tech raziskovalni projekt občine Guangzhou, Kitajska, število Grant: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Program za mlade učitelja na Univerzi, število Grant: 10YKPY28; Changjiang Štipendisti in inovativna Raziskovalna ekipa na univerzi, številka:. 985 projekt PCSIRT 0947. blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

Konkurenčni interesi: The avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi.

Uvod

kirurgija, radioterapija in kemoterapija sta primarni klinični tumor zdravljenja. Vendar pa je operacija in obsevanje so neučinkovite pri metastatskim rakom; če je kemoterapija pravilno uporabljen, se metastaze inhibiramo [1]. Kar zadeva boj proti raku razvoju zdravil, antraciklini so najbolj učinkovita zdravila proti raku [2]. Naravni izdelki iz oceanov so pomemben vir novih zdravil proti raku [3]. Morskih mikroorganizmov metabolite z edinstvenimi strukture in farmakoloških aktivnosti se običajno uporabljajo kot vodilni protitumornih spojin [4]. Antrakinona spojine, kot so daunorubicin, doksorubicin, epirubicin in mitoksantronom, sta najbolj učinkovita klinični zdravila proti raku [2]. Morsko antrakinon SZ-685C zavira proliferacijo človeškega raka dojke [5] - [6] in nazofaringealni karcinom človeka (NPC) celic [7]. Huang et al. pokazale, da antrakinoni iz rabarbare, kot emodin, aloe-emodin in rheina, zavira rast in razmnoževanje različnih rakavih celicah, kot pljučnega adenokarcinoma, mielogeno levkemijo, nevroblastom, hepatocelularnega karcinoma, raka sečnega mehurja in druge [8].

mehanizem delovanja protitumorskega iz antrakinonov predvsem vključen v naslednjih vidikov [9] - [10]: interakcije DNA preko vezave interkalacijski in vmešavanje ločitev dvojne verige DNK; neposredne membrane učinki; poškodbe DNK v odgovor na topoizomerazo inhibicije II ali nastajanja prostih radikalov, kot reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in indukcijo apoptoze preko inhibicije topoizomeraze II, funkcionalno p53 ali nastajanja ROS. Poleg tega antrakinoni sprožiti tudi apoptozo preko JNK (c-Jun N-terminalne kinaze) [11] Akt /PKB (proteinska kinaza B) [5], [12] in mitohondrijske poti [13] - [14].

G503 je antrakinon spojina izolirana iz sekundarnih metabolitov mangrove endophytic glive št 1403 iz South China Sea [15] .Vendar, ali G503 ima potencial proti raku kot antrakinon spojine, ni bila raziskana. Zato je bila ta študija namenjena za pojasnitev aktivnost anti-tumorskih G503, ki so vključeni osnovni mehanizem.

Materiali in metode

Kemikalije in reagenti

3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylterazolium bromid (MTT) in ROS odstranjevalec N-acetil-cistein (NAC) smo kupili pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Hochest 33342, karboksi H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Vsebnost Kit in MitoProbe prehod Pore Test Kit (M34153) so bili pridobljeni iz Invitrogen (ZDA). Aneksin V-FITC (fluorescein izotiocianatom) /PI (propidijevim jodid) Apoptoza Detection Kit je bila kupljena iz Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kitajska). RPMI1640 srednje in fetalni goveji serum (FBS) je bilo iz Hyclon (Logan, UT, ZDA ).
Kaspazne-8 inhibitor Z-IETD-FMK,-9 kaspaze inhibitor Z-LEHD-FMK in kaspaze-družina z zaviralcem z-VAD-FMK je bilo iz Calbiochem (Gibbstown, New Jersey, ZDA) in Beyotime (Kitajska). Protitelesa proti kaspaze-3, kaspaze-4, kaspaze-8, kaspaze-9 in COXIV protitelesa so iz signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA, ZDA). Protitelesa proti citokroma C
, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 in anti-kozjega IgG-HRP so iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). Miš anti-β-aktina in anti-GAPDH primarna antibodywere iz Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Anti-rabbit IgG-peroksidaza in anti-mouse IgG-peroksidaze so od Vector (Burlingame, CA, ZDA) .Mitochondria izolacija kit je bila kupljena od Pierce (Pierce, IL, ZDA), so bile beljakovine test kit, kupljen pri Bio-Rad (Hercules , CA, ZDA), in komplet za odkrivanje ECL so bili iz Applygen Technologies Inc (Peking, Kitajska).

fermentacija, ekstrakcija in izolacija G503 s Nigrospora
sp. No. 1403

NO.1403 smo izolirali iz razpadajočega lesa Kandeliacandel
(L.) Druce in reidentified kot Nigrospora
sp. (Genske banke pristopna številka: HQ891110), zbranih iz Mai Pad, Hong Kong, in slano jezero na Bahamih. G503 smo izolirali in očistili iz sekundarnih metabolitov NO. 1403 [15]. Starter kulture so se ohranili na koruzne agar morsko vodo. Vtič agar, ki podpirajo rast micelija smo razrezali in aseptično prenesli v 250 ml erlenmajerico, ki vsebuje 100 ml tekočega medija (glukoza 10 g /L, peptonsko 2 g /L, ekstrakta kvasa 1 g /L, NaCl _{2 g /L, pH D 7,0). Bučko smo inkubirali pri 28 ° C. Po stresanju na rotacijskem stresalniku za 3-5 dni, smo micelij aseptično prenesemo v 500 ml erlenmajerico, ki vsebuje tekočino kulture (200 ml). Bučko smo nato inkubirali pri 28 ° C 25 dni.}

Kulture (150 L) smo filtrirali skozi gazo. Filtrat smo koncentrirali do 5 L pod 50 ° C in ekstrahiramo trikrat s stresanjem z enakim volumnom etilacetata. Združene organske ekstrakte podvržemo koloni s silikagelom in eluiramo z gradientom petroletra v etilacetatu, da dobimo spojino.

spojino raztopimo v dimetilsulfoksidu (DMSO) pri koncentraciji zalog 50 mmol /L in razredčimo s posebnimi koncentracije pred uporabo

celični kulturi

HUVECs smo izolirali iz človeških popkovine venskih normalnih parturitions in kultivirani po protokolu je opisano prej [16]. - [ ,,,0],17]. Chang jetrne celice in tumorske celične linije Brus-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 in SGC7901, AGS so vzdržuje našem laboratoriju in kultivirani v RPMI1640 mediju, dopolnjenem z 10% FBS, 100 U /ml streptomicina in 100 U /ml penicilina (Gibco), pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO _{2. Ta študija je v skladu z načeli, opisanimi v Helsinški deklaraciji, ki jo je Odbor za etiko Medicinske Sun Yat-Sen univerzi odobril, in pisno privolitev je bila pridobljena od darovalca.}

preživetja celic test

celice smo zasejali z gostoto 2 x 10 ^{4 celic /ml v 24-vdolbinami (HUVECs smo zasejali v želatinske obloženih 24 vdolbinami). Ko celice dosegli gostoto 60% -70%, so obdelamo z različnimi koncentracijami G503 za 48 ur v RPMI1640 nosilcu (1 ml /vdolbinico) brez FBS; negativne kontrolne skupine so bili zdravljeni s PBS. Pozneje je bil 100 u.l MTT (5 mg /ml) raztopili v PBS dodamo v vsako vdolbino in inkubiramo dodatne 4 ure, da se omogoči nastanek formazancrystals. Kristale smo raztopili v 1 ml DMSO v vsako vdolbino. Vrednosti optične gostote (OD) v vijolično rešitev, ki zastopa sposobnost preživetja celic, so izmerjeni pri 570nm [18] - [19]. Po treh neodvisnih poskusih, je preživetje celic izračuna po naslednji formuli: preživetje (%) = (pomeni eksperimentalno OD vrednost /pomeni kontrolno OD vrednost) × 100%. Vrednosti smo izrazili kot 50% inhibitorna koncentracija (IC _{50), ki je bila izračunana po metodi regresije v linearnem območju.}}

Hoechst 33.342 obarvanje vsebnosti

zasadimo SGC7901 celice v 6 vdolbinami z gostoto 10 ^{5 celic na jamico in obdelamo s koncentracijami G503 od 0 mol /L do 40 mol /L za 24 h. Celice so bile označene s 10 ug /ml Hoechst 33.342 [20] 10 minut pri 37 ° C in ugotovili s pomočjo fluorescenčno mikroskopijo (Olympus X71-A12FL /PH).}

aneksin V-FITC /PI obarvanju test

SGC7901 celice zberemo v gostoti 5 x 10 ^{5 do 5 x 10 6 /ml po zdravljenju G503 pri koncentracijah v območju od 0 mol /L do 40 mol /L za 24 ur v 6-jamicami; celice, predelane z 25 mol /L kolhicin smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Celice smo nato sprali in obarvamo v skladu z navodili proizvajalca (aneksin V-FITC /PI apoptoza Detection Kit). Na kratko smo celice resuspendirali v 500 p.L 1 x vezavnega pufra. Naslednji, je 5 u.l AnnexinV-FITC in 5 xl 20 ug /ml PI doda vzorec in inkubiramo pri sobni temperaturi 15 minut v temi. Obarvane Vzorce smo nato ocenili citometrije pretoka (Becton Dickinson, NJ, USA) za identifikacijo apoptotične celice.}

Določanje mitohondrijsko membranski potencial

SGC7901 celice zasadimo v 6 vdolbinami. Ko se doseže gostoto 60%, smo celice obdelali s 20 mol /L G503 18 h in nato zbrali oceniti membranski potencial mitohondrijske v skladu s priporočili proizvajalca (MitoProbe DiOC2 (3) Vsebnost Kit). Na kratko smo 1 x 10 ^{6 /ml celice ponovno suspendirali pri 37 ° C PBS. pozitivni kontrolni skupini so bile predhodno obdelamo z 1 p.L 50mmola /L CCCP pri 37 ° C 5 min. Vse skupine smo nato obdelali s 5 p.L 10 mol /L DiOC _{2 (3), 30 minut pri 37 ° C in ocenjeni s pretočno citometrijo. Membrana potencial mitohondrijev je bila izračunana na podlagi naslednje enačbe:. Mitohondrijski membranski potencial = (rdeča intenziteta fluorescence) /(zelena intenziteta fluorescence)}}

Odkrivanje odprtje mitohondrijev prepustnosti prehodnega Pore (MPTP)

SGC7901 celice zasadimo v 6 vdolbinami. Ko se doseže gostoto 60%, smo celice obdelali s 20μmol /L G503 za 18 h in zberemo oceniti MPTP odpiranje po citometrije pretoka (Becton Dickinson, NJ, USA) po protokolu proizvajalca (MitoProbe prehod por Vsebnost Kit). Na kratko, smo vsak vzorec razdeljen v 3 alikvote in obdelamo takole: Alikvot 1 smo obdelali s 5 ul 2 mol /L kalcein AM v temi; alikvot 2 smo obdelali s 5 ul kalceina AM in 5 ul 80 mmol /L COCI _{2 v temi; in alikvot 3 je bil obdelan s 5 ul kalceina AM, 5 ul COCI 2 in 5 xl 100 umol /L ionomicina. Je alikvote smo nato inkubirali pri 37 ° C 15 min v temi. Potem ko izperemo s HBSS /Ca ^{2+ in ponovno suspendiramo v 400! Li HBSS /Ca 2+, so bile celice ocenjena s pretočno citometrijo v 1 uri. Odprtje pogoj MPTP se izračuna na naslednji način: (fluorescence alikvot 2- fluorescence alikvota 3) /(fluorescence od alikvot 1- fluorescence alikvota 3). Kalcein AM prodre v citoplazmo in organele, vključno mitohondrijih. COCI 2 poteši kalcein AM fluorescence v citoplazmi, vendar ne v mitohondrijih. Kalcein AM premikanjem v citoplazmo iz mitohondrijev, ko se odprejo MPTP in fluorescence se zmanjša z COCI 2.}}

Izolacija celičnih mitohondrijev in citoplazmo

SGC7901 celice zasadimo v 100-mm plošče; Vsaka skupina je bila prekrita v dveh plošč. Po doseganju 60% -70% strnjene, smo celice obdelali z ali brez 20 mol /l G503 za 18 ur. Po obdelavi so bile mitohondrijski in citoplazemska frakcije pridobljena v skladu z navodili proizvajalca (Mitohondriji izolacijo kit).

Western blot analizo

Kot smo že opisali, smo celice lizirali v RIPA pufra [21] . Koncentracije beljakovin v mitohondrije, citoplazmo in celotne celice so bile odkrite po metodi BCA uporabo protein Preskusno komplet Bio-Rad. Skupno je bilo 60 mikrogramov beljakovine iz vsake skupine ločene z 12% ali 15% natrijevega dodecilsulfat-Poliakrilamidni gel elektroforeza (SDS-PAGE). Proteini iz SDS-PAGE smo prenesli na PVDF membrano. Po so nespecifični veznih mest membran blokiran 1-2 h pri sobni temperaturi s TBST pufru, ki vsebuje 10% mleka brez maščobe, smo membrane inkubirali preko noči pri 4 ° C s primarnim protitelesom v skladu z navodili proizvajalca. Sekundarnih protiteles z ali brez fluorescence konjugiran z ustreznimi primarnimi protitelesi inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi. Membrane s fluorescenčnimi sekundarnih protiteles so ocenili z Odyssey sistema (Li-COR, Nebraska, ZDA) za skeniranje fluorescenčnih pasove [22], in membrane z normalnimi sekundarnih protiteles smo prikazali s pomočjo kompleta za odkrivanje ECL za immunoblots. Membrane smo odstranili in ponovno preizkusimo s P-aktina ali COXIV protiteles. β-aktin uporabimo kot interni standard za celotno lizatom celične in citoplazme izvlečenja, ker je bil COXIV uporabili kot kontrolo za mitohondrijskih ekstrakciji. Densitometric analysis godb je bila izvedena z količina ena (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) [23].

Statistična analiza

so bili predstavljeni vsi podatki pomeni ± SD vsaj trikratno določitev . SPSS 13.0 programska oprema je bila uporabljena za t-test in enosmerno analizo variance (ANOVA) v vseh statističnih analiz. A P
vrednost 0.05 smo imeli statistično pomembna v vseh primerih.

Rezultati

-G503 posredovano zaviranje na orožja je najmočnejše v SGC7901 celicah med 11 celičnih linijah pregledanih

smo uporabili MTT test za ugotavljanje, ali je antrakinon spojina G503 citotoksična v naslednjih celičnih linijah: dva normalna celic linije (Human popkovna vene endotelijske celice (HUVECs) in Chang jetrne celice in devet tumorske celične linije (Brus -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb PC3, A549 in SGC7901). Vse celice smo inkubirali z 0, 2,5, 5, 10, 20 ali 40 umol /L G503 48 ur. Cell viabilnost so bile izmerjene z uporabo MTT testom, kot je navedeno, in IC _{50 vrednost za SGC7901 celic je bila najnižja, ker je IC 50 vrednosti običajnih celičnih linij, HUVEC in Chang jetrne celice, so bile bistveno večje od SGC7901 ( Tabela 1).}

G503 inducira apoptozo v SGC7901 in AGS želodčne rakavih celic

Glede na to, da je bil SGC7901 celična linija je najbolj občutljiv na G503 na celičnih linij enajstih pregledati (tabela 1), smo nadalje raziskala to celično linijo posebej. SGC7901 Celice smo obarvali z Hoechst 33342 ugotoviti, ali je zaviralni učinek povezane z apoptozo. Rezultati kažejo na povečanje števila celic prikazovanje jedrskega krčenje in kromatin kondenzacijo z naraščajočimi koncentracijami G503 (slika 1A). Poleg tega, da razišče, ali G503 inducira apoptozo pri drugih želodčnih raka celičnih linijah, so bili pregledani tudi AGS želodca rakave celice. Aneksin V /PI obarvanje je bila uporabljena za analizo učinkov G503 v SGC7901 in AGS želodčne rakavih celic s pretočno citometrijo. Za te poskuse je bil 25 umol /L kolhicin uporabimo kot pozitivno kontrolo. Po obdelavi z 0 mol /L, 2,5 mol /l, 5 mol /L, 10 umol /L, 20 umol /L in 40 mol /l G503 in 25 mol /L colchicines za 24 ur, so bili odstotek apoptotskih SGC7901 celic 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% in 20,69% ± 1,91%, v tem zaporedju (slika 1B); odstotek od apoptotskih AGS celic je bilo 15,37% ± 2,36% 19,30% ± 4,45% 22,72% ± 4,89% 24,93% ± 4,76% 30,44% ± 9,42% 47,51% ± 18.29% ter 31,49% ± 2,45% oziroma (slika 1C). Odkrivanje apoptoze v AGS celic in zgornjih rezultatov je pokazala, da G503 inducira želodčni rak apoptozo celic na način, ki je odvisen od odmerka.

G503 inducira apoptozo v kaspaze-odvisen način

V nadaljnji preiskavi mehanizem vpleten v-G503 inducirane apoptoze v želodčnih rakavih celic, smo proučevali SGC7901 celice. Kaspaze-3 je efektor kaspaze, ki lahko vstopijo jedro in neposredno interakcijo s podlago, s čimer se spodbuja apoptozo celic [24]. Caspse-9 je pobudnik kaspaze, ki aktivira caspse-3 [25]. Celice so zdravili z različnimi G503 koncentracij, navedenih časov in zbrali za oceno kaspaze-3 in -9 Western blot. Izraz predhodnika kaspaze-3 zmanjšal na od odmerka in časovno odvisni način, medtem ko kaspaze-3 razkrajanja fragmenti v odmerka in časovno odvisni moda povečal (Slika 2A, B). Izraz predhodnika kaspaza-9 znižala in razkrajanja fragmenti poveča, potem ko so celice obdelamo s 20 mol /L G503 za 24 ur (slika 2C). Ti učinki se odpravijo s pan-kaspaze zaviralec Z-VAD-FMK (slika 2C, D). Skladna z aktivacijo kaspaze-9 in -3, stopnje apoptotske celice povzročene z 20 mol /L G503 inducira v SGC7901 celice so bile močno zmanjša po predhodnem zdravljenju z Z-VAD-FMK (slika 2E). Ti podatki kažejo, da G503 inducira apoptozo v SGC7901 celic v kaspaze-odvisen način.

G503 inducirano apoptozo ni odvisna od kaspaze-8

Da bi raziskali, ali je smrt posredujejo receptorji apoptotske poti je induciran z G503, smo proučevali kaspaze-8, pobudnik kaspaza na smrt receptor posredovano apoptotske poti [26]. SGC7901 Celice smo obdelali z različnimi odmerki G503 za navedene čase. Celice smo zbrali za merjenje kaspaze-8 z Western blotting-om. Rezultati so pokazali, da kaspaze-8 predhodnik zmanjšala in cepimo kaspaze-8 povečala v časovno in od odmerka odvisno način (slika 3A, B). Celice smo predhodno obdelali s 20 umol /L kaspaze-8 zaviralca Z-IETD-FMK 30 minut in nato obdelamo z 20μmol /L G503 24 h. Kaspaze-8 PROFORM povečala v celicah sočasno zdravljeni z zaviralcem kaspaze-8 in G503 primerjavi s celicami, ki so se zdravili samo z G503. Vendar pa je kaspaze-9 PROFORM, razklani kaspaze-9 in kaspaze-3 so se ohranila na podobni ravni v celicah, zdravljenih z zaviralcem kaspaze-8 in G503 ali G503 samo (slika 3C). V skladu s Slika 3C,-G503 povzroča stopenj apoptotskih celic v SGC7901 celice niso zmanjšala za predhodno obdelavo z Z-IETD-FMK (slika 3D). Ti podatki kažejo, da kljub sproži G503, ki je kaspaze-8 ni vključena v pro-apoptotske aktivnosti G503.

G503-inducirano apoptozo je odvisna od kaspaze-9

kaspazne-9, pobudnik kaspaza na mitohondrijske apoptotske poti, se lahko aktivira z združevanjem z citokroma c
(Cyto c
) in apoptotske proteaz aktivira faktor-1 (aPAF-1) [25] - [26]. Da bi še dodatno raziskati, ali je mitohondrijska pot vključena v-G503 inducirane apoptoze, je bila preučena aktivacija kaspaze-9 po zdravljenju G503 v različnih koncentracijah in časih. Poleg tega je bila stopnja apoptotično celično merimo tudi ob sočasnem zdravljenju z G503 in kaspaza-9 zaviralca Z-LEHD-FMK. Rezultati so pokazali, da je kaspaze-9 PROFORM zmanjšala in razkrajanja fragmenti povečala v časovnem in način odvisna od odmerka (slika 4A, B). Dostavo, smo celice predhodno obdelamo z 20 mol /L Z-LEHD-FMK 30 minut in sočasno inkubirali z 20 mol /L G503 24 h. Količinsko apoptotičnih celic, smo celice obarvali z AnnexinV /PI in analiziramo s pretočno citometrijo. Rezultati so pokazali, da je stopnja apoptotske celic zmanjšala, ko so celice so sočasno zdravljeni z Z-LEHD-FMK in G503 (slika 4C). Če povzamemo, ti podatki kažejo, da je G503 inducirane SGC7901 apoptoza celic odvisna od kaspaze-9 aktivacijo.

G503 inducira apoptozo preko mitohondrijske apoptotske poti

To je dobro znano, da je mitohondrijska pot pomemben apoptotskega pot. Da razišče, ali G503 inducira apoptozo preko mitohondrijske poti, smo pregledali, povezanih z apoptozo beljakovine, membranski potencial mitohondrijske (MMP), in odprtje MPTP za potrditev indukcijo mitohondrijske apoptotske poti. Sledite z obdelavo G503, mitohondrijsko fluorescence zmanjšal v primerjavi s kontrolno skupino (slika 5A), kar nakazuje, da je bil MPTP odprl G503. Poleg tega, kot je prikazano na sliki 5B, je precej intenzivnost rdeče /zeleno fluorescenco opazili v kontrolni skupini. Vendar pa je po zdravljenju z 20 mol /L G503, je bila rdeča /zelena intenziteta fluorescence zmanjša. Ta rezultat je predlagal, da G503 zmanjšuje membranski potencial mitohondrijske za SGC7901 celic. Poleg tega so skupaj Cyto c
vsebnosti beljakovin ni sicer spreminja iz kontrolne skupine in skupine z drogami; Vendar Cyto c
je relocalized v citoplazmo iz mitohondrijev (slika 5C). Bax in Bcl-2 sta ključna dejavnika pri urejanju mitohondrijskih kanalov in sproščanje različnih proteinov, povezanih z apoptoze [27]. Zato smo preučevali distribucijo Bax in Bcl-2 v različnih mobilnih oddelkov in niso opazili pomembno spremembo v vseh stopnjah beljakovin Bax in Bcl-2 med kontrolni skupini in drog; Vendar G503 promoviral translokacijo Bax iz citoplazme v mitohondrijih kot tudi prenosom Bcl-2 od mitohondrije v citoplazmi (Slika 5D). Skupaj, G503 inducira apoptozo v SGC7901 celice preko mitohondrijske poti.

G503 inducira apoptozo pri SGC7901 celic deloma skozi kaspaze-4 aktivacijo

kaspazne-4 lahko neposredno activate kaspaze-9, vendar ne preko mitohondrijske poti [28] - [29]. Raziskati, ali je kaspaze-4 aktivira G503 in ali aktivira kaspaze-4 aktivira kaspaze-9, smo pregledali razkrajanja fragmente kaspaze-4 in -9. Rezultati so pokazali, da je kaspaza-4 cepitev fragment: v celicah, obdelanih s G503 v primerjavi s kontrolno skupino (slika 6A) znatno povečala. Zdravljenje z kaspaze-4 zaviralcev Z-LEVD-FMK povečala kaspaze-9 PROFORM, ki ni zaznal v skupini, ki je G503 (slika 6B). Ti rezultati so pokazali, da G503 povzroča SGC7901 želodčni rak apoptozo celic v delu z aktivacijo kaspaze-4.

Pogovor

To je poročal, da je p
-quinone del s kinona vsebujoč molekulamih igra zelo pomembno vlogo pri morebitni proti raku [30]. Perchellet sod. Prav tako je ugotovila, da p-kinon J4, o-kinon J1 in nesubstituiranega modela p-kinon J7 zniža največ preživetja L1210 tumorskih celic med osmimi spojin sintetiziranih in presejane v svoji predhodni študiji [31]. Razumevanje odnosa med potencialom proti raku altersolanol A in struktura-aktivnost, Teiten et al. ocenili učinek altersolanol A in z njo povezane antracenska derivatov: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B in ampelanol. Ugotovili so, da je samo altersolanol A in njegovo acetiliranega derivata tetraacetylaltersolanol Sedanja citotoksična učinek na K562 celicah, ker derivatov z zmanjšanjem ene od karbonilnih skupin, kot so tetrahydroaltersolanol B in ampelanol, nimajo učinka [32]. p
-quinone strukture G503 (slika S1) lahko prispevali tudi rakave celice apoptoze, ter v naslednjem raziskave bomo analizirali G503 in njenih derivatov za identifikacijo predhodnega odnosa med strukturo in aktivnostjo. V tej študiji smo ugotovili, da je rak celična linija želodca SGC7901 najbolj G503 občutljiv rak celična linija preučila uporabo viabilnosti celic testa v devetih raka celičnih linij in dveh običajnih celičnih linij. G503 povzroča SGC7901 želodčni rak celično smrt z apoptozo na način, ki je odvisen od odmerka. Še želodca rakave celice AGS je preučilo tudi, in je občutljiv na-G503 inducirane apoptoze kot dobro. Kot rezultat, 20 umol /L G503 je optimalna koncentracija, ki povzroči resno apoptozo.

človeški genom kodira vsaj 10 vrst kaspaznih homologov. Naslednji kaspaze homologov sodelujejo pri apoptozi: kaspazne-2, -3, -8, -9 in -10 [33]. Čeprav kaspaze igrajo vlogo v apoptozi, obstajajo različni kaspaza neodvisni poti obstajajo. Na primer, v prisotnosti inhibitorjev kaspaznih, faktor tumorske nekroze (TNF) inducira celično nekrozo, in ki ima značilnosti apoptoze in nekroze [34] - [36]. Poleg tega, apoptozo inducira faktor (AIS) je DNA encim, ki razgrajuje neposredno DNK. Ko je membranski potencial mitohondrijev spreminjajo, se AIS sprosti v citoplazmo iz mitohondrije in se aktivira z njegovo interakcijo z cyclophilinA [37] - [38]. Endo G lahko razgradijo DNA neposredno v kaspaze neodvisen način [39].

V raziskavi, G503 izpostavljenost aktivira kaspaze-3, -8 in -9 na od odmerka in časovno odvisni način (Slika 2A, B, 3A, B, 4A, B). Je-G503 inducirano apoptozo odvisna od kaspaz? Ko celice so sočasno zdravljeni z Z-VAD-FMK in G503, Z-VAD-FMK zavira kaspazo-9 in -3 aktivacijo (slika 2C, D), in število apoptotskih celic, G503 induciranih zmanjšala (slika 2E), kar kaže, da-G503 povzroča SGC7901 apoptozo celic je kaspaze-odvisna. Razlikovati, ali je-G503 inducirano apoptozo odvisna od kaspaze-8, -9 ali oboje, so SGC7901 celice obdelamo z Z-IETD-FMK in Z-LEHD-FMK in nato sočasno zdravijo z G503. Rezultati kažejo, da Z-IETD-FMK ne ovirajo kaspaze-9 in -3 aktiviranje (slika 3C), niti zmanjšati število apoptotskih celic z G503 (slika 3D) induciranih; Vendar Z-LEHD-FMK zmanjšalo število apoptotskih celic (slika 4C). Tako G503 inducirane SGC7901 apoptoza celic ni odvisna od kaspaze-8, vendar je na kaspaze-9.

mitohondriji sestavljen iz zunanje membrane, membrane prostora in matrike. povezanih apoptosis proteini, kot kaspaznih proenzymes, Cyto C
in AIS obstajajo v prostoru membrane. Vendar, če se por oblikovane v zunanji mitohondrijske membrane ali prepustnosti spreminjati, so ti proteini povezani z apoptosis sprosti v citoplazmo. Člani družine Bcl-2, nadzorujejo prepustnost zunanjo mitohondrijsko membrano, in jih lahko razdelimo v dva člana, ki spodbujajo apoptozo (kot Bax in Bak) ali zaviranje apoptoze (kot Bcl-2 in Bcl-XL). Člani pro-apoptotske spodbuja sprostitev, povezanih z apoptoze proteinov, kot Cyto C
od mitohondrijev, ker imajo antiapoptozne člani nasproten učinek [40]. Bax obstaja predvsem v citoplazmi, medtem Bcl-2 kombinira s hidrofobnimi skupinami na C-terminalu celice v bioloških membran [41]. Bax struktura se spremeni med zunanjim stresom, tako da se združuje z zunanjo mitohondrijsko membrano tospontaneously tvorijo galerijo s pomočjo homologne oligomerizacijo. Ta ukrep povzroča sproščanje povezanih apoptoze proteinov [42] ali tvorbo mitohondrijev permeabilnostjo prehodnega por (MPTP), ki sestoji iz napetosti odvisnega anionskim kanala (VDAC) na zunanjem mitohondrijske membrane in adenin nukleotidov translocator (ANT) o notranja membrana [43]. Bax komunicira le z VDAC ustvariti odprt pore, ko so koncentracije BAX nizka. V nasprotju s tem, Bax hkrati komunicira z VDAC in ANT ko so koncentracije Bax visoke odpreti pore v notranjo in zunanjo membrano. Ta ukrep zmanjšuje membranskega potenciala notranjo povečuje osmotskega tlaka mitohondrijske matrice spodbuja notranjo membrano otekline in povečuje osmotski pritisk zunanje membrane, s čimer se pospešuje sproščanje povezanih apoptoze proteinov [26], [44] - [46 ]. Pomemben korak v mitohondrijski apoptotske poti je sprostitev Cyto C
[47] - [49]. Cyto c
združuje z aPAF-1 in kaspaze-9 PROFORM ustvariti apoptosome. APAF-1 izpostavlja svojo oligomerizacijo domeno in N-terminal aktiviranje kaspazne in področja zaposlovanja (CARD) združuje z kaspaze-9 PROFORM KARTICO. Tako je kaspaza-9 aktiviran, aktivirani kaspaza-9 cepi nadaljnji kaspaz, kot caspse-3 in -7. Efektor kaspaze sčasoma cepila njihovih ustreznih podlag za induciranje apoptoze celic [47], [49] -. [50]

V tej študiji, G503 poveča delež Bax /Bcl-2 na mitohondrijske membrane in zmanjša razmerje Bax /Bcl-2 v citoplazmi (Slika 5D). G503 spodbuja tudi odprtje MPTP in zmanjšanje membranski potencial mitohondrijev (slika 5A, B). Nato Cyto C
je bil prenesen iz mitohondrijev v citoplazmi (slika 5C). Poleg tega, G503 pospešuje prenos Bax v mitohondrije iz citoplazme in Bcl-2 v citoplazmi od mitohondrijih. Povečana Bax in zmanjšano Bcl-2 v mitohondrijih poveča prepustnost za mitohondrijev zunanje membrane in spodbuja sproščanje Cyto C
. Ureditev Bax /Bcl-2, ki ga G503 je mogoče opaziti, ker G503 je majhna molekularna spojina.

• Plos ONE: Izražanje XPG beljakovine v razvoj, napredovanje in prognozo želodčnega raka
• Plos ONE: Kirurške Rezultati in napovedni dejavniki za T4 Rak želodca bolnikov brez daljnih metastaze