PLoS Genetics: MIR-218 Hæmmer invasion og metastase af Gastric Cancer ved Målretning af Robo1 Receptor

Abstrakte

MikroRNA'er spiller nøgleroller i tumormetastaser. Her beskriver vi reguleringen og funktionen af ​​miR-218 i gastrisk cancer (GC) metastaser. MIR-218-ekspression formindskes sammen med ekspressionen af ​​en af ​​dens værtsgener, Slit3 i metastatisk GC. Imidlertid er Robo1, en af ​​flere Spalteventiler receptorer, reguleres negativt af MIR-218, hvorved der etableres en negativ feedback-sløjfe. Nedsat miR-218 niveauer fjerne Robo1 undertrykkelse, der aktiverer Slit-Robo1 vej gennem interaktionen mellem Robo1 og Slit2, hvilket udløser tumor metastase. Restaureringen af ​​miR-218 undertrykker Robo1 udtryk og hæmmer tumor celle invasion og metastase in vitro
in vivo
. Tilsammen vores resultater beskrive en Slit-MIR-218-Robo1 regulerende kredsløb, hvis afbrydelse kan bidrage til GC metastase. Målretning miR-218 kan give en strategi for at blokere tumor metastase.

Author Summary

MikroRNA'er er blevet identificeret som at spille vigtige roller i tumor metastase, men deres indvirkning på GC metastaser har været dårligt udforsket. Vi har opdaget MIR-218, der fungerer som en undertrykker af tumormetastase og er korreleret med klinisk stadium, lymfeknudemetastase, og prognosen hos patienter med GC. Vores resultater viser, at miR-218 er en del af en regulerende kredsløb involverer Slit-Robo1 vej. I metastatiske tumorceller, blev miR-218 undertrykt sammen med Slit3, en af ​​dens vært gener. I mellemtiden er Robo1, en af ​​flere Spalteventiler receptorer, opreguleret som svar på fald i MIR-218, som igen inducerede en reaktiv opregulering af Slit-Robo1 pathway gennem en interaktion med Slit2 og således lette tumorcellemigration og invasion. Sådanne fund ikke kun give ny indsigt i de metastatiske mekanismer i GC, men også bevis for en ny miRNA-medieret regulering tilstand af receptor signalering

Henvisning:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) MIR-218 Hæmmer invasion og metastase af Gastric Cancer ved Målretning af Robo1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000879

Redaktør: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA

Modtaget: 15 juli, 2009; Accepteret: 10. februar 2010. I Udgivet: 12 marts 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.670.970, No. 30.873.026, No. 30.672.369, No. 30.530.780) og National Basic Research Program Kina (No.2010CB529300). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Fremskridt inden diagnostiske og terapeutiske metoder har ført til gode forventninger til langsigtet overlevelse for tidlig mavekræft (GC). Men prognosen for avanceret GC med omfattende invasion og metastase forbliver fattige [1]. For at metastasere, skal tumorceller passere gennem en række sekventielle og selektive hændelser, herunder frigørelse, migration, lokal invasion, angiogenese, intravasation, overlevelse i kredsløbet, ekstravasation, og genvækst i forskellige organer. I den metastatiske kaskade, invasion af GC i det omgivende væv er et afgørende tidlig trin [2] - [4]. Men mekanismerne for invasion er endnu ikke fuldstændigt belyst.

Et stort antal microribonucleic syrer (microRNA eller miRNA) er for nylig blevet impliceret i cancer metastase [5], herunder MIR-10b, MIR-21, mIR-126, mIR-335, mIR-373, mIR-146, mIR-520C, og mIR-205 i brystcancer [6] - [11]; MIR-224 og MIR-21 i prostatacancer [12], [13]; miR-29c i nasopharyngeale carcinomer [14]; MIR-10a, MIR-222, MIR-125b, MIR-7, og MIR-452 i urothelial carcinomer [15]; miR-182 i melanom [16]; MIR-92b og miR-9/9 * i hjernetumorer [17]; og miR-21 i kolorektal cancer [18]. Imidlertid har meget få miRNA vides at være involveret i GC metastase blevet rapporteret. miRNA er naturligt forekommende, korte, ikke-kodende RNA-molekyler, som negativt regulerer genekspression [19]. I pattedyr, er modne miRNA genereret fra pri-miRNA og præ-miRNA via sekventiel behandling af drosha og Dicer og findes i mange organismer. De består af 21-24 nukleotider, integrere i RNA-fremkaldende lyddæmpende komplekser, og parre med 3 'utranslaterede områder (3'-UTR) af specifikke mål messenger RNA (mRNA) for at undertrykke oversættelse eller inducere nedbrydning af target mRNA [20 ]. Emerging beviser har vist, at miRNA spiller nøgleroller i forskellige biologiske processer, herunder celledifferentiering, proliferation, apoptose, stress modstand, fedtstofskiftet, tumorgenese, og metastase [21] - [23]. En bedre forståelse af de ændringer i miRNA udtryk under GC invasion kan føre til en bedre forståelse af GC udvikling, samt mulige forbedringer i diagnosticering og behandling af fremskreden GC.

I den foreliggende undersøgelse, vi etableret høj (MKN28-M og SGC7901-M) og lave invasive celle underlinjer (MKN28-NM og SGC7901-NM) ved hjælp af en gentagen transwell assay in vitro
. Vi derefter undersøgt det globale miRNA udtryk profil i hver celle delområde ved hjælp af en miRNA microarray at identificere differentielt udtrykte miRNA relateret til menneskelig GC invasion. I alt blev 45 miRNA vist at være differentielt udtrykt i invasive versus ikke-invasive GC-celler. Blandt disse MIR-218, et signifikant nedreguleret miRNA i stærkt invasive celler, blev vist at være tæt korreleret med GC tumorgenese og metastase hos patienter. For nylig er et fald i MIR-218 blevet rapporteret i flere slags faste tumorer, herunder prostatacancer, GC, lungecancer og cervical carcinoma [24] - [27], men dette fald i miRNA-218 blev simpelthen screenet ud som værende en af ​​de snesevis af potentielle miRNA af interesse i de kræftformer er beskrevet ovenfor. Ingen yderligere undersøgelser er blevet udført for at vurdere betydningen af ​​miR-218 i tumor metastase. Her har vi fundet, at faldet MIR-218-ekspression blev korreleret med avanceret klinisk stadium, lymfeknudemetastase, og dårlig prognose hos patienter, og re-ekspression af MIR-218 i metastatiske celler var i stand til at inhibere migration, invasion, og metastase-dannelse både in vitro
in vivo
. Ved hjælp af en bioinformatik søgning på MIR-218 mål, vi sat fingeren receptoren Robo1 som miR-218 funktionelle mål, og vi bekræftede, at interaktionen mellem miR-218 og Robo1 var afgørende for GC celle motilitet ved at demonstrere, at der var en omvendt korrelation mellem miR -218 og Robo1 i GC cellelinier såvel som i GC patienter. Desuden opdagede vi en spændende negativ feedback loop involverer Slit, MIR-218 og Robo1, hvori MIR-218 kan afledes fra to gener lokaliseret i introner af to forskellige medlemmer af Slit proteinfamilien. Desuden medlemmer af denne familie er ligander af Robo1 receptoren. Vi viste, at ekspression af de to miRNA precursor-gener (MIR-218-1 og MIR-218-2) korrelerede med ekspression af værten gener (Slit2 og Slit3 henholdsvis), og at det modne MIR-218 hovedsagelig blev afledt af miR -218-2 precursor, med en ledsagende reduktion af værten Slit3 men ikke af Slit2 i metastatiske GC-celler. Således opregulering af Robo1 som reaktion på fald i MIR-218 inducerede en reaktiv opregulering af Slit-Robo1 pathway gennem dets interaktion med Slit2 og således lette tumorcelleinvasion og metastase. Vores resultater ikke kun give ny indsigt i de metastatiske mekanismer i GC, men de afslørede også en ny reguleringsmekanisme receptor signalering.

Resultater

Etablering og karakterisering af celle underlinjer med forskellige invasive og metastatiske potentialer

for at fastsætte GC metastase-modeller, vi skabte invasive og non-invasive celle underlinjer fra humane GC cellelinjer SGC7901 og MKN28 hjælp af gentagne transwell tilgang (figur 1A, se materialer og metoder). Kort fortalt blev en repetitiv invasion assay udført, og de celler, som undlod at invadere membranerne og celler, der havde evnen til at migrere gennem collagen-coatede membran i alle udvælgelsesrunderne blev separeret. Efter ti runder af udvælgelse, vi opnåede invasive (MKN28-M og SGC7901-M) og ikke-invasive celle underlinjer (MKN28-NM og SGC7901-NM). De metastatiske egenskaber af hver celle sublinie blev derefter karakteriseret in vitro
in vivo
. Som vist i figur 1B og 1C, migration evne MKN28-M-celler var ca. 4 gange større end den af ​​MKN28-NM-celler. Ligeledes den invasive potentiale var omkring 5 gange større for MKN28-M-celler sammenlignet med MKN28-NM-celler. I in vivo
undersøgelser blev tumorcellemetastase observeret i nøgne mus. Som vist i figur 1D og 1E, næsten ikke detekteret metastatiske GC-celler i lungerne eller lever fra nøgne mus ved 10 uger efter injektion af MKN28-NM-celler, hvorimod de fleste af musene injiceret med MKN28-M-celler i åbenbar lunge eller lever metastaser. Lignende resultater blev observeret for SGC7901-M og SGC7901-NM-celler (data ikke vist). Ingen signifikante forskelle i celledeling eller celle-cyklus fordeling blev observeret blandt disse celle underlinjer (Tekst S1, figur S1 og S2).

Identifikation af metastase-relaterede miRNA ved matrix-baserede hybridisering

for at identificere miRNA potentielt involveret i GC invasion, vi undersøgte globale miRNA udtryk i hver celle delområde hjælp af microRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbæk, Danmark), som består af 847 capture prober til modne menneskelige miRNA. Mikroarrayet Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​124 miRNA meget forskelligt for den stærkt invasive variant MKN28-M og ikke-invasiv celle sublinie MKN28-NM. Af disse blev 83 opreguleret og 41 blev nedreguleret. Sammenlignet med SGC7901-NM, blev 62 miRNA differentielt udtrykt i SGC7901-M celle underlinie, herunder 47 nedreguleres og 15 opreguleres miRNA. I alt blev der fundet 11 miRNA at være opreguleret og 34 miRNA blev nedreguleret i både MKN28-M og SGC7901-M-celler sammenlignet med dem i de tilsvarende ikke-invasive underlinjer (tabel S1).

Af de 45 forskelligt regulerede miRNA, miR-218 var en af ​​dem, der udviste betydeligt differentieret udtryk. MIR-218 er blevet rapporteret at blive nedreguleret i livmoderhalskræft [25], GC [26], lungecancer [27] og prostatacancer [28], hvilket indikerer mulige involvering i både oncogen transformation og tumormetastase. Men miRNA-218 var kun én af de mange potentielle miRNA af interesse i kræft. I dette arbejde har MIR-218 blevet undersøgt i langt større detaljer. For at validere microarray resultater, vurderede vi miR-218 udtryk i GC celle underlinjer nævnt tidligere, og i den udødelige gastrisk epitelcelle linje GES hjælp QRT-PCR [29]. MIR-218-ekspression blev signifikant reduceret i MKN28-M og SGC7901-M-celler og var lavere i alle fire GC celle underlinjer sammenlignet med immortaliserede humane gastriske epitelceller GES celler (figur 2A). Desuden vi sammenlignet miR-218 udtryk i den primære GC tumor vs. metastatiske lymfeknuder i 10 patienter med stadium III /IV GC hjælp QRT-PCR. Som vist i figur 2B, modne MIR-218 niveauer signifikant reduceret i 7 ud af 10 metastatiske lymfeknuder, hvilket indikerer, at MIR-218 kan spille en kausal rolle i GC metastase.

Nedsat MIR-218-ekspression i GC var forbundet med avanceret klinisk stadie, lymfeknude metastaser og dårlig patient prognose

for at bestemme de mulige klinisk-patologiske konsekvenser af ændret miR-218 udtryk, vi undersøgte ekspressionsniveauerne af miR-218 i 40 GC væv (T) og ikke-tumor mucosa (N) ved QRT-PCR. Udtrykket -ΔCt blev anvendt til at beskrive ekspressionsniveauet af MIR-218. I overensstemmelse med ovennævnte data resultaterne kontrolleret, at miR-218 ekspressionsniveauet i GC (-13,81 ± 0,15, gennemsnit ± SE) væv var signifikant lavere end i ikke-neoplastiske slimhinde (-11,62 ± 0,15, gennemsnit ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, parret t
-test) (figur 3A). Korrelationer mellem MIR-218 ekspressionsniveauet og clinicopathologic karakteristika GC er opsummeret i tabel 1. Statistisk signifikante associationer mellem MIR-218 ekspressionsniveauet og klinisk fase og mellem MIR-218 ekspressionsniveauet og GC metastaser blev observeret i denne undersøgelse. Medianen udtryk for miR-218 var -14,25 ± 0,17 i de 22 sager med fremskreden (stadium III og IV) sygdom, mens medianen udtryk var -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney test) i de 18 tilfælde med tidlige fase (fase i og II) sygdom. I de 29 tilfælde af GC med lymfeknude metastaser, medianen udtryk for miR-218 var -14,09 ± 0,16, hvilket var betydeligt lavere end medianen udtryk (-13,07 ± 0,24) i de 11 ikke-metastatiske GC tilfælde ( P
= 0,0036). Udtrykket af miR-218 i GC patienter korrelerede ikke med alder, køn, tumorstørrelse, eller celledifferentiering. Desuden har vi undersøgt, om niveauet af MIR-218-ekspression var forbundet med overlevelse hos patienter med GC. Patienterne blev efterfølgende opdelt i lav ekspression (n = 20) og høje ekspressionsniveauer grupper (n = 20) baseret på MIR-218 niveauer større eller mindre end den gennemsnitlige (-13,81) (figur 3B). Kaplan-Meier overlevelse analyser viste, at patienter, hvis primære tumorer viste lav ekspression af miR-218 havde en kortere median overlevelsestid. De tre-års overlevelse på patienter med lav miR-218-ekspression var 30%, hvilket var betydeligt lavere end overlevelsen hos patienter med forhøjet miR-218-ekspression (65%; P
= 0,0012, log- rank test;. figur 3C)

Ektopisk udtryk for miR-218 hæmmede tumor celle invasion og metastase in vitro
in vivo

at studere rolle mIR-218 i GC metastase, blev MKN28-M-celler transficeret med pGenesil-1-mIR-218 eller en kontrol vektor, der udtrykker en uspecifik miRNA, cel-mIR-67, under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Cellerne blev derefter selekteret med 400 mg /l G418 til generering MKN28-M-MIR-218 og MKN28-M-MIR-kontrol stabile celler. Vi fandt, at ektopisk ekspression af MIR-218 resulterede i en ca. tre gange reduktion i migration og invasivitet. For at bestemme hvorvidt tabet af MIR-218 ville fremme migration eller invasion af cancerceller, vi tavshed MIR-218 med et antisense-oligonukleotid-inhibitor i MKN28-NM-cellelinie, hvilket resulterer i en tre- til fire gange stigning i cellemigrering og invasivitet (figur 4A og 4B). For at teste om inhibering af tumorinvasion af MIR-218 er forårsaget ved at ændre den invasive evne af tumorceller, vi udelukkede virkningen af ​​MIR-218 på proliferationen og cellecyklusfordeling af gastriske cancerceller. Over-ekspressionen af ​​miR-218 påvirkede ikke spredning og cellecyklus distribution af MKN28-M-celler in vitro
(figur S5A og S5D). For yderligere at undersøge inhiberingen af ​​ in vivo
tumormetastase af MIR-218, vi implanteret MKN28-M-MIR-218 celler, som var stabilt udtrykker MIR-218 eller kontrolceller i nøgne mus via den laterale halevene. Lunge og lever metastase af GC var tydelig i mus injiceret med MKN28-M-MIR-kontrolceller. I modsætning hertil påvistes nogle metastatiske tumorer i mus injiceret med MKN28-M-MIR-218 celler (figur 4C). Endvidere har vi samtidigt observeret væksten af ​​de primære tumorer og forekomsten af ​​fjerne metastaser i nøgne mus injiceret subkutant med MKN28-M-MIR-218 celler eller kontrolceller. Resultaterne viste lunge eller levermetastaser var tydelig i 3 ud af 10 mus injiceret med MKN28-M-MIR-kontrolceller; i skarp kontrast, blev ingen metastase fundet i mus injiceret med MKN28-M-MIR-218 celler (figur S5E). Disse resultater er i overensstemmelse med data fra hale vene analyser, der vurderer kræft metastase og viser, at miR-218 har evnen til at undertrykke metastaser uden at påvirke celleproliferation.

Robo1 var en direkte funktionel mål for miR-218 i GC metastaser

for at vurdere, hvordan et lavt niveau af miR-218 udtryk bidrager til invasion og metastase af GC, søgte vi efter de potentielle lovgivningsmæssige mål for miR-218 bruger forudsigelsesværktøjer, herunder Miranda, PicTar, og Targetscan. Selvom hundredvis af forskellige mål blev forudsagt, kan disse gener involveret i migration eller invasion være de relevante mål med hensyn til de biologiske funktioner af miR-218. Vi udførte derefter en funktionel klassificering af de forudsagte mål ved hjælp af DAVID programmet (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Af disse gener, er Robo1 betragtes som et proto-onkogen og havne migration-fremmende aktivitet [30] - [35]. Mertsch et al.
Viste, at Robo1 letter gliom cellemigration medieret af Slit2 [36]. Schmid et al.
Fandt, at bryst tumor celle migration er foranlediget af Slit2-Robo1 interaktion in vitro
[37]. Disse resultater tyder på, at Robo1 kan være et mål for miR-218. For yderligere at teste vores hypotese, vi analyserede udtryk for miR-218 og Robo1 i GES og i ikke-invasiv (MKN28-NM og SGC7901-NM) og invasive (MKN28-M og SGC7901-M) GC celler. Resultaterne viste en negativ korrelation mellem niveauerne af miR-218 og Robo1 mRNA i disse celler (figur S3A). Desuden observerede vi, at Robo1 mRNA (figur S3B) og protein (figur 5B2) niveauer blev reduceret ved miR-218 blev udtrykt af pGenesil-1-miR-218 i MKN28-M-celler (Figur 5B1). Det omvendte blev observeret for Robo1 udtryk, når miR-218 blev slået ned i MKN28-NM celler (figur 5C1 og figur 5C2). Det omvendte forhold mellem MIR-218 og Robo1 ekspression blev yderligere bekræftet ved immunhistokemi (Tekst S1) i 40 tilfælde af mavecancer, i matchede tilgrænsende normalt væv, der også anvendes i klinisk-patologiske undersøgelser, og i 29 matchede metastaser. Resultaterne viser, at Robo1 blev opreguleret i GC, især i metastatisk GC (Figur S4), hvor miR-218 har en relativt lav udtryk.

For at få yderligere direkte bevis for, at Robo1 er et mål for miR-218 undersøgte vi bindingsstedet for mIR-218 i 3'-UTR af Robo1 mRNA (figur 5A). Vi konstruerede en luciferase reporter (Luc-Robo1), hvor nukleotider af Robo1 3'-UTR komplementær til MIR-218 (nt 971-978) blev indsat i pMIR-RAPPORT miRNA ekspression reporter vektoren [38]. Tilsvarende vi også genereres både et mutant reporter (Luc-Robo1-mu), ved hvilken de første seks nukleotider i Mir-218 frø-region komplementære steder blev slettet, og en kontrolgruppe reporter, som indeholdt et ikke-beslægtet fragment af cDNA (Luc-Ctrl). miR-218-ekspressionsplasmider blev co-transficeret med Luc-Robo1, Luc-Robo1-MU, eller Luc-Ctrl ind MKN28-M-celler. Assayene viste, at luciferaseaktiviteten i Luc-Robo1-transficerede celler var signifikant faldt i forhold til luciferaseaktiviteten i de mutante og negative kontrolceller ( P
< 0,05), hvilket antyder, at MIR-218 reducerede luciferaseaktiviteten af ​​Luc-Robo1 men havde ingen effekt på Luc-Robo1-mu (figur 5D). Konkluderede vi derfor, at det indsatte fragment af Robo1 (nt 971 -
978). Var målet for miR-218

Robo1 har vist sig at være over-udtrykkes i cancerceller og er kendt for at fremme tumorangiogenese og metastase via en interaktion med Slit [39], [40]. For at teste, om Robo1 er funktionelt reguleret af MIR-218, genereret vi en Robo1 ekspressionskonstruktion indeholdende kun et fragment af det forudsagte MIR-218 bindingssted og Robo1 mutant ekspressionsvektor helt mangler 3'-UTR. Vi har også gjort det Robo1 siRNA. MKN28-M-MIR-218-celler, som stabilt udtrykte MIR-218 ektopisk, blev kortvarigt transficeret med Robo1-konstruktionen eller mutant-konstruktionen (med ingen MIR-218 bindingssted), og MKN28-M-celler blev transficeret med Robo1 siRNA eller en negativ kontrol siRNA. MKN28-M-MIR-218-celler transficeret med Robo1 mutant-konstruktionen viste en 3,8 gange stigning i invasion evne sammenlignet med celler transficeret med Robo1 konstruktionen. Disse resultater viser, at indførelsen af ​​mutant Robo1 cDNA, som manglede den MIR-218-bindingsstedet i MIR-218-overudtrykkende celler tilbageføres virkningen af ​​MIR-218-medieret suppression af celleinvasion. Imidlertid var virkningen af ​​Robo1 undertrykkes af MIR-218 i nærvær af Robo1 3'-UTR indeholdende MIR-218-bindingssteder. Knockdown af Robo1 af siRNA i MKN28-M-celler hæmmede celle invasion, som faldt til niveauer svarende til dem observeret efter transfektion med miR-218-udtrykkende vektor (figur 5E og 5F). Disse iagttagelser antyder, at MIR-218 direkte undertrykker Robo1-medieret celleinvasion.

Slit2, men ikke Slit3, kan interagere med Robo1, beriget ved fraværet af MIR-218, til at fremme GC invasion

Der findes to typer af miRNA: intergeniske og intron. Førstnævnte er placeret i ikke-kodende regioner mellem gener og deres tilsvarende pri-miRNA er generelt transkriberet fra deres egne promotorer med RNA-polymerase II. Sidstnævnte er beliggende inden intronerne værtsgener, og deres biogenese styres af værten genpromotorer [41], [42]. MIR-218 er et intronisk miRNA. To gener koder for moden MIR-218, MIR-218-1 og MIR-218-2, som er beliggende inden intron 15 i Slit2 og intron 14 i Slit3 henholdsvis (figur 6A). Den intron placering af de to miR-218 gener fik os til at spørge, om miR-218-1 og miR-218-2 er transskriberet sammen med deres vært gen mRNA. For at teste denne hypotese anvendte vi QRT-PCR til at undersøge ekspressionen af ​​MIR-218-1 precursor, den MIR-218-2 precursor, modne MIR-218, Slit2 mRNA og Slit3 mRNA i GC væv, der anvendes i overlevelse analyse. Statistisk analyse af korrelationskoefficienten af ​​QRT-PCR-resultater afslørede en signifikant positiv sammenhæng mellem niveauerne af Slit2 mRNA og miR-218-1 og mellem niveauerne af Slit3 mRNA og miR-218-2 (figur 6B og 6C). Disse resultater indikerer, at MIR-218-kodende gener, MIR-218-1 og MIR-218-2, transkriberes sammen med deres værtsgener, Slit2 og Slit3 hhv. En signifikant positiv sammenhæng mellem niveauerne af miR-218 og miR-218-2 (figur 6D) blev set i GC; blev dog ikke en sådan sammenhæng ses mellem niveauerne af miR-218 og miR-218-1 (figur 6E). Disse resultater indikerer, at nedregulering af MIR-218 i GC fremmes af en formindskelse i MIR-218-2, men ikke i MIR-218-1. I overensstemmelse med denne konklusion, blev Slit3 udtryk væsentligt reduceret i GC (-22,43 ± 0,21, gennemsnit ± SE) i forhold til normal gastrisk væv (-20,79 ± 0,23, gennemsnit ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, parret t
-test) (figur 6F), mens Slit2 udtryk var ikke signifikant forskellig ( P
= 0,0772, parret t
-test) ( Figur 6G). Sammenfattende vores eksperimentelle resultater antyder, at væsentlig opregulering af Robo1 genet som reaktion på fjernelse af MIR-218 kan inducere en efterfølgende opregulering af Slit-Robo1 pathway gennem dets interaktion med Slit2, lette tumorcellemigration og invasion.

diskussion

at studere en sygdom, er det vigtigt at konstruere en ideel model. I den foreliggende undersøgelse har vi isoleret invasive og ikke-invasive cellesubpopulationer fra etablerede humane GC cellelinier ved hjælp af gentagne transwell tilgang, som er blevet anvendt med succes i mange undersøgelser undersøge tumormetastase [43] - [48]. Resultaterne af metastatisk undersøgelse in vitro
in vivo
viste, at de etablerede celle underlinjer havde tydelige invasive og metastatiske kapaciteter. Her har vi screenet ikke kun celle underlinjer afledt GC-cellelinier med høj-invasiv potentiale, men også dem med lav-invasiv potentiale. Med undtagelse af deres metastatiske evner, de valgte celle underlinjer var begge ret ens, da de deler den samme genetiske baggrund. Da den største forskel mellem de to typer af underlinjer er metastatisk kapacitet, bør de gener, der afviger mellem dem korrelerer godt med metastase. Desuden er vores metode er i stand til at skelne invasion stadier fra metastaser og muliggør studiet af specifikke trin i metastaser, som ikke kan vurderes i live-dyremodel.

For nylig er der rapporteret miRNA for at fremme [49] , [50] eller undertrykke [51] - [54] tumormetastase, tilvejebringelse et nyt perspektiv på den metastatiske proces. Ikke desto mindre er den rolle, miRNA i GC metastaser mangler. I denne rapport, vi udforskes og opnået for første gang 45 metastase-relaterede miRNA i GC baseret på en veletableret metastaser celle model. Konstateringen af, at miR-218 blev nedreguleret i metastatisk GC er spændende, som faldt miR-218 niveauer er blevet rapporteret i flere typer af solide tumorer [24] - [27], [55], hvilket indikerer, at tabet af miR-218 kan være en fælles begivenhed i tumorigenese. I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på virkningen af ​​MIR-218 på GC metastase og viste, at MIR-218 virker som en tumorsuppressor i GC metastase. Restaurering af miR-218 reducerede celle migration og invasion in vitro
og tumormetastaser in vivo
. At opnå stabile cellelinier, som over-udtrykkes MIR-218, vi transficerede MKN28-M-celler med MIR-218 plasmider og gennemlyses med G418. Vi valgte tolv cellekolonier i MIR-218-transficerede gruppe og fandt 10 ud af 12 kolonier udviste bemærkelsesværdigt ensartet, stabil og høj-niveau ekspression af MIR-218. Desuden tre tilfældigt udvalgte monoklonale cellelinjer udviste tilsvarende reduktion i invasiv ablility. Imidlertid plasmid transfektionstrategier resulterer ofte i lavere integration virkningsgrad sammenlignet med viral ekspression fører til muligheden for stokastiske udvælgelse af sjældne funktionelt heterogene varianter fra den oprindelige bulkpopulation. Derfor den fremtidige anvendelse af virale ekspressionssystemer skal skabe en mere fordomsfri udgangspunkt befolkning til at teste vores hypotese.

Som en del af vores forskning om, hvordan tabet af miR-218 påvirker GC metastase, viste vi, at Robo1 var en kritisk nedstrøms mål for miR-218. Det er kendt, at Robo er en axon vejledning receptor for Slit og er konserveret i dyr lige fra bananfluer til pattedyr. I pattedyr har tre Slit (Slit1-3) og fire Robo (Robo1-4) gener blevet beskrevet [56], [57]. De Slit-Robo interaktioner formidle signaler medierer frastødende tidskoder på axoner og vækst kegler under neural udvikling og deltage i T-celle og monocytkemotaksis [58] - [64]. Som for andre udviklingsmæssige veje, afvigende ekspression af Slit - Salg Robo gener er blevet observeret i en række forskellige tumortyper [65] - [68]. For eksempel, i brystcarcinoma vævsprøver, Robo1 har vist sig at være overudtrykt, og det er påvist at inducere migrering af brystcancercellelinier [37]. Slit2-Robo1 signalering letter gliom cellemigrering [36] og er involveret i angiogenese ved at øge mikrokar tæthed og tumormasse i en tumor xenograft model [30]. Wang et al.
Vist, at overekspression af Robo1 i nye blodkar i tumorer fremkalder kræft neovaskularisering og vækst via en vekselvirkning mellem Robo1 og dens ligand, Slit2. De identificerede også phosphoinositid-3-kinase (PI-3K) som en nedstrøms effektor af Slit2 /Robo1 signalering. Dette antyder, at der eksisterer en Slit-Robo1-PI-3K kaskade, der kunne føre til dannelse af phosphoinositol-3,4,5-triphosphat og den efterfølgende aktivering af små GTPaser, som medierer celle bevægelighed og remodellering af actincytoskelettet [30] , [35]. I modsætning hertil har andre undersøgelser hævdet, at nedregulering af Robo1 forårsaget af deletioner eller epigenetiske modifikationer kan spille en rolle i tumorudvikling [69] - [73]. Vi foreslår, at der eksisterer en vævsspecifik udtryk mønster for Slit-Robo gener.

I den aktuelle undersøgelse, fandt vi, at Robo1 ofte blev udtrykt ved høje niveauer i invasive celler og ved lave niveauer i ikke-invasive celler , hvorimod mIR-218 vises den modsatte ekspressionsmønster. Når vi transficeret den MIR-218-ekspressionsvektor og inhiberende oligonukleotider ind MKN28-M og MKN28-NM-celler henholdsvis iagttoges en omvendt ekspressionsmønster mellem MIR-218 og Robo1, det vil sige, hvis MIR-218-ekspression var høj, Robo1 ekspression var lav og vice versa. Dette resultat blev yderligere bekræftet i kliniske prøver og i luciferaseaktivitet assays. Vi har også bemærket, at induktion af ekspressionen af ​​Robo1 af Robo1 mutant konstruktion uden miR-218 bindingssted kunne vende miR-218-medieret undertrykkelse af tumor celle invasion. I modsætning hertil knockdown af Robo1 genekspression ved RNAi havde en effekt på reduktion af tumor celle invasion svarer til restaureringen af ​​miR-218, selv om Robo1 knockdown alene viste en svag effekt. Dette kan skyldes, Robo1 er ikke den eneste mål for MIR-218, der er relevant for tumormetastase. Disse fund indikerer, at invasionen undertrykkende virkning af MIR-218 er i det mindste delvist medieret gennem et fald i Robo1 ekspression. Dette er også den første undersøgelse der viser, at det tumor-associerede gen Robo1 negativt reguleres af MIR-218 via en specifik målsted (nt 971-978) inden for 3'-UTR. Den Robo1 receptoren er afgørende for reaktion på ekstracellulære signaler og cellulære fænotypiske ændringer; derfor kan stramme regulering af Robo1 receptoren med MIR-218 lette mere robust signaltransduktion. Anti-Robo1 monoklonalt antistof er blevet rapporteret at være en effektiv behandling for Robo1-udtrykkende cancere [30], [33]. I nærværende undersøgelse fandt vi en ny hæmmer af Robo1, miR-218, som potentielt kan anvendes til behandling af visse former for kræft.

Som nævnt ovenfor, Slit1, Slit2, og Slit3 omfatter Slit familie proteiner. Skønt generne overlapper hinanden, deres ekspressionsmønstre og funktioner er forskellige. De tidligere to proteiner er kendt for at være involveret i axon vejledning og cellevandring [37], [74], mens Slit3 er involveret i udviklingen af ​​organer og organsystemer, herunder membranen og nyrerne [75]. I overensstemmelse med disse data, fandt vi, at Slit2, men ikke Slit3, interageret med Robo1 at fremme GC invasion.

Derudover har vi vist, at de miR-218 kodning gener blev placeret i og transskriberet sammen med Spalteventiler gener , som var Robo1 ligander, hvilket skaber en negativ feedback loop, der regulerer Slit /Robo1 signalering. Sailen Barik viste, at en intron miRNA, miR-338, tavshed gener, der er funktionelt antagonistiske til sin vært gen-produkt og dermed skabe en positiv spiral, der hjælper i den fysiologiske rolle af værten genet [76].

• PLoS ONE:? Vaskulær CXCR4 Udtryk - en roman Antiangiogenisk Target i Gastric Cancer
• PLoS ONE: Silencing af Claudin-11 er forbundet med øget invasivitet af mavekræft Cells