PLOS Genetics: MIR-218 inhiberar invasion och metastas av gastric cancer genom att fokusera på ROBO1 Receptor

Abstrakt

MicroRNAs spelar nyckelroller i tumörmetastas. Här beskriver vi reglering och funktion av MIR-218 i magcancer (GC) metastaser. MIR-218 uttryck minskas tillsammans med ett uttryck för en av sina värdgener, Slit3 i metastaserande GC. Men ROBO1, en av flera Slit-receptorer är negativt regleras av MIR-218, att kunna skapa en negativ återkopplingsslinga. Minskade miR-218 nivåer eliminera ROBO1 förtryck, som aktiverar Slit-ROBO1 väg genom interaktionen mellan ROBO1 och Slit2, sålunda trigg tumörmetastas. Restaureringen av MIR-218 undertrycker ROBO1 uttryck och hämmar tumörcellinvasion och metastas In vitro Mössor och In vivo
. Sammantaget våra resultat beskriver en Slit-MIR-218-ROBO1 reglerande krets vars störningar kan bidra till GC metastaser. Inriktning miR-218 kan ge en strategi för att blockera tumörmetastaser.

Författare Sammanfattning

MicroRNAs har identifierats som spelar en viktig roll i tumörmetastas, men deras inverkan på GC metastaser har dåligt utforskat. Vi har upptäckt miR-218, som fungerar som en suppressor av tumörmetastaser och är korrelerad med kliniskt stadium, lymfkörtel metastas, och prognos för patienter med GC. Våra resultat visar att miR-218 är en del av en regleringskrets som innefattar den slits ROBO1 pathway. I metastatiska tumörceller, var miR-218 undertryckt tillsammans med Slit3, en av dess värdgener. Under tiden är ROBO1, en av flera Slit-receptorer, uppregleras som svar på minskningen i MIR-218, vilket i sin tur inducerade en reaktiv uppreglering av den slits ROBO1 väg genom en interaktion med Slit2, vilket sålunda underlättar tumörcellmigrering och invasion. Sådana fynd inte bara ger nya insikter i metastaserande mekanismer GC men också ge bevis för en miRNA-medierad regleringssättet receptorsignalering roman

Citation. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, sön S, et al. (2010) MIR-218 hämmar invasion och metastas av gastric cancer genom att fokusera på ROBO1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Redaktör: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA

Mottagna: 15 juli, 2009; Accepteras: 10 februari 2010. Publicerad: 12 mars 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 30.670.970, nr 30.873.026, nr 30.672.369, nr 30.530.780) och National Basic Research Program of China (No.2010CB529300). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Framsteg inom diagnostiska och terapeutiska metoder har lett till goda förväntningar för långsiktig överlevnad för magcancer tidigt (GC). Men prognosen för avancerad GC med omfattande invasion och metastaser är fortfarande dålig [1]. För att metastasera, måste tumörcellerna passera genom en serie av sekventiella och selektiva händelser, inklusive avskildhet, migration, lokal invasion, angiogenes, intravasering, överlevnad i cirkulationssystemet, extravasering och återväxt i olika organ. I den metastatiska kaskaden, är invasionen av GC i den omgivande vävnaden ett avgörande tidigt steg [2] - [4]. Men mekanismerna för invasion har ännu inte helt klarlagd.

Ett stort antal microribonucleic syror (mikroRNA eller miRNA) har nyligen inblandad i cancermetastaser [5], inklusive MIR-10b, MIR-21, mIR-126, mIR-335, mIR-373, mIR-146, mIR-520C, och mIR-205 i bröstcancer [6] - [11]; MIR-224 och MIR-21 i prostatacancer [12], [13]; MIR-29c i nasofaryngeala karcinom [14]; MIR-10a, MIR-222, MIR-125b, MIR-7, och MIR-452 i uroteliala karcinom [15]; MIR-182 i melanom [16]; MIR-92b och MIR-9/9 * i hjärntumörer [17]; och MIR-21 i kolorektal cancer [18]. Emellertid har mycket få miRNA kända för att vara inblandade i GC metastaser rapporterats. miRNA är naturligt förekommande, korta, icke-kodande RNA-molekyler som negativt reglerar genexpression [19]. Hos däggdjur är mogna miRNA genereras från pri-miRNA och pre-miRNA via sekventiell bearbetning av Drosha och Dicer och finns i många organismer. De består av 21-24 nukleotider, integreras i RNA framkallande tyst komplex, och koppla ihop med 3 'otranslaterade regioner (3'-UTR) av specifika mål budbärar-RNA (mRNA) för att undertrycka translation eller inducera nedbrytning av mål mRNA [20 ]. Emerging bevis har visat att miRNAs spelar nyckelroller i olika biologiska processer, inklusive celldifferentiering, proliferation, apoptos, stresstålighet, fettförbränningen, tumörbildning och metastas [21] - [23]. En bättre förståelse för de förändringar i miRNA uttryck under GC invasion kan leda till en bättre förståelse för GC utveckling, samt eventuella förbättringar i diagnos och behandling av avancerad GC.

I den aktuella studien har vi etablerat hög (MKN28-M och SGC7901-M) och låga invasiva cellRader (MKN28-NM och SGC7901-NM) med en repetitiv transwell analys in vitro
. Vi undersökte sedan den globala miRNA uttrycksprofilen i varje cell delområde med hjälp av en miRNA microarray att identifiera differentiellt uttryckta miRNA rör människors GC invasion. Totalt var 45 miRNA visat sig vara differentiellt uttryckta i invasiv kontra icke-invasiva GC-celler. Bland dessa, MIR-218, en betydligt nedregleras miRNA i mycket invasiva celler, visade sig vara nära korrelerad med GC tumörbildning och metastas hos patienter. På senare tid har en minskning i MIR-218 rapporterats i flera typer av solida tumörer, inklusive prostatacancer, GC, lungcancer, och cervikal karcinom [24] - [27], men denna minskning av miRNA-218 var helt enkelt sållas bort som en av de dussintals potentiella miRNAs av intresse i cancer som beskrivits ovan. Inga ytterligare studier har utförts för att bedöma betydelsen av MIR-218 i tumörmetastas. Här, har vi funnit att minskade miR-218-uttryck korrelerade med avancerad kliniskt stadium, lymfkörtel metastas, och dålig prognos för patienter, och återexpression av MIR-218 i metastatiska celler kunde inhibera migration, invasion och metastasbildning både in vitro Mössor och in vivo
. Med hjälp av en bioinformatik sökning efter MIR-218 mål, pekade vi receptorn ROBO1 som MIR-218 funktionella mål, och vi bekräftade att samspelet mellan MIR-218 och ROBO1 var avgörande för GC cellrörlighet genom att visa att det fanns en omvänd korrelation mellan miR -218 och ROBO1 i GC cellinjer samt GC patienter. Vidare upptäckte vi en spännande negativ återkopplingsslinga som omfattar Slit, miR-218, och ROBO1, där miR-218 kan härledas från endera av två gener belägna i introner av två distinkta medlemmar av Slit-proteinfamiljen. Dessutom, medlemmar av denna familj är ligander av ROBO1-receptorn. Vi visat att expression av de två miRNA föregångargener (MIR-218-1 och MIR-218-2) korrelerade med uttryck av värdgener (Slit2 och Slit3, respektive), och att den mogna miR-218 i huvudsak härrör från miR -218-2 prekursor, med en åtföljande minskning av värd Slit3 men inte av Slit2 i metastatiska GC-celler. Således, uppreglering av ROBO1 som svar på minskningen i MIR-218 inducerade ett reaktivt uppreglering av den slits ROBO1 väg genom dess interaktion med Slit2, vilket sålunda underlättar tumörcellinvasion och metastas. Våra resultat ger inte bara nya insikter i metastaserande mekanismer i GC, men de visade också en ny regleringsmekanism av receptorsignalering.

Resultat

Upprättande och karakterisering av cell sublinjer med olika invasiva och metastatisk potentialer

för att fastställa GC metastaser modeller, skapade vi invasiva och icke-invasiva cell sublinjer från humana GC cellinjerna SGC7901 och MKN28 hjälp av upprepade transwell strategi (Figur 1A, se Material och Metoder). I korthet framställdes en repetitiv invasionsanalys utföras, och de celler som inte lyckades invadera membranen och celler som hade förmågan att migrera genom det kollagenbelagda membranet i alla urvalsomgångarna separerades. Efter tio selektionsrundor, erhöll vi invasiva (MKN28-M och SGC7901-M) och icke-invasiva cell sublinjer (MKN28-NM och SGC7901-NM). De metastatiska egenskaperna hos varje cell sublinje sedan karaktäriseras In vitro Mössor och In vivo
. Såsom visas i figur 1B och 1C, migration förmåga MKN28-M-celler var ungefär 4 gånger större än den för MKN28-NM-celler. På samma sätt, den invasiva potentialen var cirka fem gånger större för MKN28-M-celler i jämförelse med MKN28-NM-celler. I In vivo
studier har tumörcellmetastas observerats i nakna möss. Såsom visas i figur 1D och 1E, nästan inga metastatiska GC-celler detekterades i lungorna eller levern hos nakna möss vid 10 veckor efter injektion av MKN28-NM-celler, medan de flesta av mössen injicerades med MKN28-M-celler visas uppenbara lunga eller lever metastaser. Liknande resultat observerades för SGC7901-M och SGC7901-NM-celler (data ej visade). Inga signifikanta skillnader i celltillväxt eller cellcykelfördelningen observerades bland dessa cellRader (Text S1, figurer S1 och S2).

Identifiering av metastaser relaterade miRNA av array-baserad hybridisering

för att identifiera miRNAs potentiellt involverade i GC invasion vi granskat globala miRNA uttryck i varje cell sublinje hjälp av mikroRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Danmark), som består av 847 infångningssonder för mogna mänskliga miRNA. De microarray resultat avslöjade att uttrycket av 124 miRNA väsentligt skilde sig mellan den starkt invasiv variant MKN28-M och icke-invasiv cell sublinje MKN28-NM. Av dessa var 83 uppreglerat och 41 nedregleras. Jämfört med SGC7901-NM, var 62 miRNAs differentiellt uttryckta i SGC7901-M cellunderlinje, inklusive 47 nedreglerade och 15 uppreglerad miRNA. Totalt var 11 miRNA befanns vara uppreglerade och 34 miRNAs var nedregleras i både MKN28-M och SGC7901-M-celler jämfört med dem i motsvarande icke-invasiva sublinjer (Tabell S1).

Av de 45 differentiellt reglerade miRNA, mIR-218 var en av dem som uppvisade signifikant differentiellt uttryck. MIR-218 har rapporterats vara nedregleras i livmoderhalscancer [25], GC [26], lungcancer [27] och prostatacancer [28], vilket tyder på eventuell inblandning i både onkogen transformation och tumörmetastaser. Det var miRNA-218 bara en av de många potentiella miRNAs av intresse i cancer. I detta arbete har miR-218 undersökts i mycket större detalj. Att validera microarray resultat bedömde vi miR-218 uttryck i GC cellRader som tidigare nämnts och i den odödliga gastrisk epitelceller linje GES använder QRT-PCR [29]. MIR-218 uttryck minskade signifikant i MKN28-M och SGC7901-M-celler och var lägre i alla fyra GC cellRader jämfört med förevigade mänskliga gastric epithelial GES celler (Figur 2A). Vidare jämförde vi miR-218 uttryck i primär GC tumören vs. metastaserande lymfkörtlar i 10 patienter med stadium III /IV GC använder QRT-PCR. Som visas i figur 2B, mogna miR-218 nivåer var signifikant minskade 7 av 10 metastatiska lymfkörtlar, vilket indikerar att MIR-218 kan spela en avgörande roll i GC metastaser.

Minskad miR-218 uttryck i GC associerades med avancerad klinisk fas, lymfkörtel metastas, och dålig patient prognos

för att bestämma de potentiella kliniskt patologiska konsekvenserna av förändrade miR-218 uttryck, undersökte vi de uttrycksnivåer av mIR-218 i 40 GC vävnader (T) och icke-tumör slemhinnor (N) genom QRT-PCR. Termen -ΔCt användes för att beskriva den expressionsnivån av MIR-218. I överensstämmelse med ovanstående data, verifieras resultaten att miR-218-expressionsnivån i GC (-13,81 ± 0,15, medelvärde ± SE) vävnader var signifikant lägre än den i icke-neoplastiska slemhinna (-11,62 ± 0,15, medelvärde ± SE) ( P Hotel < 0,0001, t = 10,62, parat t
-test) (Figur 3A). Samband mellan MIR-218 uttryck nivå och clinicopathologic egenskaper GC sammanfattas i tabell 1. Statistiskt signifikanta samband mellan Mir-218 uttryck nivå och kliniska stadiet och mellan Mir-218 uttryck nivå och GC metastaser observerades i denna studie. Median uttryck av MIR-218 var -14,25 ± 0,17 i de 22 fall med framskridet stadium (stadium III och IV) sjukdom, medan median uttryck var -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney test) i 18 fall med tidigt stadium (stadium i och II) sjukdom. I de 29 fall av GC med lymfkörtelmetastaser, median uttryck av MIR-218 var -14,09 ± 0,16, vilket var betydligt lägre än median uttryck (-13,07 ± 0,24) i de 11 icke-metastatiska fall GC ( P
= 0,0036). Uttrycket av MIR-218 i GC patienter inte korrelerar med ålder, kön, tumörstorlek eller celldifferentiering. Dessutom undersökte vi om nivån på MIR-218 uttryck i samband med överlevnaden hos patienter med GC. Patienter därefter delas upp i låg expression (n = 20) och höga expressions grupper (n = 20) baserat på MIR-218 nivåer större eller mindre än medelvärdet (-13,81) (figur 3B). Kaplan-Meier överlevnadsanalyser visade att patienter vars primära tumörer visade lågt uttryck av MIR-218 hade en kortare median överlevnadstid. De tre-års överlevnad av patienter med låg miR-218 uttryck var 30%, vilket var betydligt lägre än överlevnaden hos patienter med högt MIR-218 uttryck (65%; P
= 0,0012, log- rank test, fig. 3C) katalog

ektopiskt uttryck av mIR-218 inhiberade tumörcellinvasion och metastas in vitro Mössor och in vivo

att studera rollen av mIR-218 i GC metastas, var MKN28-M-celler transfekterade med pGenesil-1-miR-218 eller en kontrollvektor som uttrycker en icke-specifik miRNA, cel-miR-67, med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Cellerna selekterades sedan med 400 mg /L G418 för att generera MKN28-M-miR-218 och MKN28-M-miR-kontroll stabila celler. Vi fann att ektopisk expression av MIR-218 resulterade i en cirka trefaldig minskning av migration och invasiv. För att bestämma huruvida förlusten av MIR-218 skulle gynna migrering eller invasion av cancerceller, tystas vi miR-218 med en antisensoligonukleotid inhibitor i MKN28-NM-cellinjen, vilket resulterar i en tre- till fyrfaldig ökning av cellmigration och invasivitet (figur 4A och 4B). För att testa om hämning av tumörinvasion genom miR-218 orsakas genom att försämra den invasiva förmågan hos tumörceller, uteslutas vi effekten av MIR-218 på proliferationen och cellcykelfördelning av gastriska cancerceller. Överuttryck av MIR-218 inte påverkar spridning och cellcykelfördelning av MKN28-M-celler In vitro
(Figur S5A och S5D). För att ytterligare undersöka inhiberingen av in vivo
tumörmetastas genom miR-218, implanterade vi MKN28-M-miR-218-celler, som stabilt uttrycker miR-218 eller kontrollceller in i nakna möss genom den laterala svansvenen. Lunga och lever metastas av GC var uppenbar i möss som injicerats med MKN28-M-miR-kontrollceller. I motsats härtill var några metastatiska tumörer detekterades i möss som injicerats med MKN28-M-miR-218-celler (Figur 4C). Dessutom samtidigt observerade vi tillväxten av primära tumörer och förekomsten av avlägsna metastaser i nakna möss injicerades subkutant med MKN28-M-miR-218-celler eller kontrollceller. Resultaten visade lunga eller levermetastaser var uppenbar i 3 av 10 möss som injicerats med MKN28-M-miR-kontrollceller; i bjärt kontrast, var ingen metastas hos möss som injicerats med MKN28-M-MIR-218-celler (Figur s5e). Dessa resultat överensstämmer med data som erhållits från svansvenen analyser som utvärderar cancer metastaser och indikerar att MIR-218 har förmågan att undertrycka metastas utan att påverka celltillväxt.

ROBO1 var en direkt funktionell mål av MIR-218 i GC metastas

för att bedöma hur en låg nivå av mIR-218 uttryck bidrar till invasion och metastas av GC, vi sökte de potentiella reglerings mål för mIR-218 med hjälp av prognosverktyg, inklusive Miranda, PicTar och TargetScan. Även hundratals olika mål förutsågs, kan dessa gener som är involverade i migrering eller invasion vara relevanta mål med hänsyn till de biologiska funktionerna hos MIR-218. Vi sedan utförde en funktionell klassificering av de förväntade målen med hjälp av DAVID programmet (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Av dessa gener, är ROBO1 betraktas som en proto-onkogen och hamnar migration befrämjande aktivitet [30] - [35]. Mertsch et al.
Visade att ROBO1 underlättar gliom cellmigration förmedlas av Slit2 [36]. Schmid et al.
Fann att brösttumör cellmigration induceras av Slit2-ROBO1 interaktion In vitro
[37]. Dessa fynd tyder på att ROBO1 kan vara ett mål för MIR-218. För att ytterligare testa vår hypotes, analyserade vi uttrycket av MIR-218 och ROBO1 i GES och icke-invasiv (MKN28-NM och SGC7901-NM) och invasiv (MKN28-M och SGC7901-M) GC-celler. Resultaten visade en negativ korrelation mellan nivåerna av miR-218 och ROBO1 mRNA i dessa celler (figur S3A). Dessutom observerade vi att ROBO1 mRNA (Figur S3B) och protein (figur 5B2) nivåerna minskade när miR-218 uttrycktes av pGenesil-1-MIR-218 i MKN28-M-celler (Figur 5B1). Den omvända observerades för ROBO1 uttryck när miR-218 slogs ner i MKN28-NM-celler (Figur 5C1 och Figur 5C2). Det omvända förhållandet mellan MIR-218 och ROBO1 uttryck bekräftades ytterligare genom immunhistokemi (Text S1) i 40 fall av magcancer i matchade närliggande normala vävnader som också användes i kliniskt patologiska studier och i 29 matchade metastaser. Resultaten visar att ROBO1 var uppreglerat i GC, särskilt i metastaserande GC (Figur S4), där MIR-218 har en relativt låg uttryck.

För att få ytterligare direkta bevis för att ROBO1 är ett mål för MIR-218 , vi undersökte bindningsstället hos mIR-218 i 3'-UTR av ROBO1 mRNA (figur 5A). Vi konstruerade en luciferasrapportör (Luc-ROBO1) i vilken nukleotiderna i ROBO1 3'-UTR komplementär till miR-218 (nt 971-978) infördes i pMIR-RAPPORT miRNA expressionsreportervektor [38]. På motsvarande sätt, vi också genererat både en mutant reporter (Luc-ROBO1-mu), där de första sex nukleotider i Mir-218 frö-region komplementära platser togs bort, och en kontroll reporter, som innehöll en icke-relaterad fragment av cDNA (Luc-Ctrl). MIR-218-expressionsplasmider samtransfekterades med Luc-ROBO1, Luc-ROBO1-mu, eller Luc-Ctrl i MKN28-M-celler. Analyserna visade att luciferasaktiviteten i Luc-ROBO1-transfekterade celler var signifikant minskade jämfört med luciferasaktiviteten i de muterade och negativa kontrollceller ( P Hotel < 0,05), vilket tyder på att MIR-218 minskade luciferasaktivitet av Luc-ROBO1 men hade ingen effekt på Luc-ROBO1-mu (figur 5D). Därför drog vi slutsatsen att det insatta fragmentet av ROBO1 (nt 971 -
978). Var målet för MIR-218

ROBO1 har visat sig vara överuttryckt i cancerceller och är känd för att främja tumörangiogenes och metastaser via en interaktion med Slit [39], [40]. För att testa huruvida ROBO1 är funktionellt reglerade av MIR-218, genererade vi en ROBO1 expressionskonstrukt innehållande endast ett fragment av den förutsagda miR-218-bindningsstället och ROBO1 mutant expressionsvektor helt saknar den 3'-UTR. Vi gjorde också ROBO1 siRNA. MKN28-M-miR-218-celler, som stabilt uttryckt miR-218 ektopiskt, transfekterades transient med ROBO1-konstruktionen eller den mutanta konstrukt (utan miR-218-bindningsstället), och MKN28-M-celler transfekterades med ROBO1 siRNA eller ett negativ kontroll siRNA. MKN28-M-miR-218-celler transfekterade med ROBO1 mutant-konstruktionen uppvisade en 3,8-faldig ökning av invasion förmåga jämfört med celler transfekterade med ROBO1 konstruktet. Dessa resultat tyder på att införandet av mutant ROBO1 cDNA som saknade Mir-218 bindningsställe i Mir-218-överuttryckande celler omvända effekten av MIR-218-medierad hämning av cellinvasion. Emellertid var effekten av ROBO1 trycks av MIR-218 i närvaro av den ROBO1 3'-UTR innehållande miR-218 bindningsställen. Knockdown av ROBO1 av siRNA i MKN28-M-celler inhiberade cellinvasion, som föll till nivåer som liknar de som observerats efter transfektion med Mir-218-uttryckande vektorn (Figur 5E och 5F). Dessa observationer tyder på att MIR-218 undertrycker direkt ROBO1-medierad cellinvasion.

Slit2, men inte Slit3 kan interagera med ROBO1, berikas av avsaknad av MIR-218, för att främja GC invasion

Två typer av miRNA förekommer: intergena och intron. Den förra är belägna i icke-kodande regioner mellan gener och deras motsvarande pri-miRNA är i allmänhet transkriberade från sina egna promotorer av RNA-polymeras II. De senare är belägna inom introner av värdgener och deras biogenes styrs av värd genpromotorer [41], [42]. MIR-218 är en intron miRNA. Två gener kodar för moget MIR-218, MIR-218-1 och MIR-218-2, som ligger inom intron 15 Slit2 och intron 14 Slit3, respektive (Figur 6A). Den intron placeringen av de två miR-218 gener fick oss att fråga huruvida MIR-218-1 och MIR-218-2 transkriberas tillsammans med sina värd gen mRNA. För att testa denna hypotes använde vi QRT-PCR för att undersöka uttrycket av MIR-218-1 prekursor, Mir-218-2 prekursor, mogna miR-218, Slit2 mRNA och Slit3 mRNA i de GC vävnader som används i överlevnad analys. Statistisk analys av korrelationskoefficienten av QRT-PCR-resultat avslöjade en signifikant positiv korrelation mellan nivåerna av Slit2 mRNA och miR-218-1 och mellan nivåerna av Slit3 mRNA och miR-218-2 (figur 6B och 6C). Dessa resultat indikerar att miR-218-kodande gener, miR-218-1 och miR-218-2, transkriberas tillsammans med sina värdgener, Slit2 och Slit3, respektive. En signifikant positiv korrelation mellan nivåerna av miR-218 och MIR-218-2 (figur 6D) sågs i GC; dock ingen sådan korrelation ses mellan nivåerna av miR-218 och MIR-218-1 (figur 6E). Dessa resultat indikerar att nedreglering av MIR-218 i GC främjas av en minskning i MIR-218-2, men inte i MIR-218-1. I överensstämmelse med denna slutsats, var Slit3 uttryck signifikant reducerad i GC (-22,43 ± 0,21, medelvärde ± SE) jämfört med normal gastrisk vävnad (-20,79 ± 0,23, medelvärde ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, parad t
-test) (Figur 6F), medan Slit2 uttryck var inte signifikant ( P
= 0,0772, parat t
-test) ( Figur 6G). Sammanfattningsvis våra experimentella resultat tyder på att betydande uppreglering av ROBO1-genen som svar på avlägsnandet av MIR-218 kan framkalla en efterföljande uppreglering av Slit-ROBO1 vägen genom dess interaktion med Slit2, underlättar tumörcellvandring och invasion.

Diskussion

för att studera en sjukdom, är det viktigt att bygga en idealmodell. I den aktuella studien, isolerade vi invasiva och icke-invasiva celler subpopulationer från etablerade humana GC cellinjer med hjälp av upprepade transwell tillvägagångssätt som har använts med framgång i många studier undersöker tumörmetastas [43] - [48]. Resultaten av metastatisk undersökning In vitro Mössor och In vivo
visade att de etablerade cellRader hade tydliga invasiva och metastatiska kapacitet. Här, skärmad vi inte bara cellRader som härrör från GC cellinjer med hög invasiv potential, utan även de med låg-invasiv potential. Med undantag för de metastaserande förmågor, de utvalda cellRader var båda ganska lika, eftersom de delar samma genetiska bakgrund. Eftersom den stora skillnaden mellan de två typerna av sublinjer är metastatisk kapacitet, bör de gener som skiljer sig mellan dem korrelerar väl med metastaser. Dessutom är vår metod kan skilja invasionsstadier från metastaser och möjliggör studier av särskilda åtgärder i metastaser, som inte kan bedömas i live-djurmodell.

Nyligen har miRNA rapporterats att främja [49] [50] eller undertrycka [51] - [54] tumörmetastas, vilket ger ett nytt perspektiv på den metastatiska processen. Icke desto mindre roll miRNAs GC metastaser saknas. I denna rapport har vi undersökt och fick för första gången 45 metastaser relaterade miRNA i GC baserat på en väletablerad metastasering cellmodell. Upptäckten att MIR-218 var nedregleras i metastatisk GC är spännande, som minskade MIR-218 nivåer har rapporterats i flera typer av solida tumörer [24] - [27], [55], vilket tyder på att förlusten av MIR-218 kan vara en vanlig händelse i tumörbildning. I den aktuella studien har vi fokuserat på effekten av MIR-218 GC metastaser och visade att MIR-218 fungerar som en tumörsuppressor i GC metastaser. Restaurering av MIR-218 reducerade cellmigration och invasion In vitro Mössor och tumörmetastas In vivo
. Att erhålla stabila cellinjer som överuttryckt miR-218, transfekterade vi MKN28-M-celler med MIR-218-plasmider och screenades genom G418. Vi valde tolv cellkolonier i Mir-218-transfekterade grupp och fann 10 av 12 kolonier uppvisade anmärkningsvärt jämn, stabil och hög nivå uttryck av MIR-218. Dessutom tre slumpvis utvalda monoklonala cellinjer uppvisade liknande minskning av invasiva ablility. Emellertid plasmidtransfektion strategier resulterar ofta i lägre effektivitet integration jämfört med viral expressions leder till möjligheten av stokastiska urval av sällsynta funktionellt heterogena varianter från den initiala bulkpopulation. Därför den framtida användningen av virala expressionssystem bör skapa en mer objektiv start befolkningen att testa vår hypotes.

Som en del av vår forskning om hur förlusten av MIR-218 påverkar GC metastaser visade vi att ROBO1 var en kritisk nedströms mål av mIR-218. Det är känt att robo är en axon vägledning receptor för Slit och är konserverat hos djur som sträcker sig från fruktflugor till däggdjur. I däggdjur har tre Slit (Slit1-3) och fyra Robo (Robo1-4) gener beskrivits [56], [57]. De Slit-Robo interaktioner förmedlar signaler förmedlar motbjudande ledtrådar om axoner och tillväxtkoner under neural utveckling och delta i T-cell och monocytkemotaxi [58] - [64]. Liksom för andra utvecklingsvägar, avvikande uttryck för Slit -
Robo gener har observerats i en mängd olika tumörtyper [65] - [68]. Till exempel i bröstkarcinom vävnadsprover, ROBO1 har visats vara överuttryckt, och det har visats inducera migration av bröstcancercellinjer [37]. Slit2-ROBO1 signalering underlättar gliom cell migration [36] och är involverad i angiogenes genom att öka mikrokärlsdensitet och tumörmassan i en tumör xenograft modell [30]. Wang et al.
Visade att överuttryck av ROBO1 i nya blodkärl i tumörer inducerar cancer kärlnybildning och tillväxt via en interaktion mellan ROBO1 och dess ligand, Slit2. De identifierade också fosfoinositid-3-kinas (PI-3K) som en nedströms effektor av Slit2 /ROBO1 signalering. Detta tyder på att det finns en Slit-ROBO1-PI-3K kaskad som kan leda till genereringen av fosfoinositol-3,4,5-trifosfat och den efterföljande aktiveringen av små GTPaser som medierar cellrörelse och remodellering av aktin cytoskelettet [30] [35]. Däremot har andra studier hävdat att nedreglering av ROBO1 orsakas av strykningar eller epigenetiska förändringar kan spela en roll i tumörprogression [69] - [73]. Vi föreslår att ett vävnadsspecifikt uttrycksmönster finns för Slit-Robo-gener.

I den aktuella studien fann vi att ROBO1 ofta uttrycktes vid höga nivåer i invasiva celler och vid låga nivåer i icke-invasiva celler , medan miR-218 visas den motsatta uttrycksmönstret. När vi transfekterade Mir-218-expressionsvektor och hämmande oligonukleotider in i MKN28-M och MKN28-NM-celler, respektive, var en invers uttrycksmönster observerades mellan miR-218 och ROBO1, det vill säga om miR-218 expression var hög, ROBO1 expression var låg och omvänt. Detta resultat bekräftades ytterligare i kliniska prover och luciferasaktiviteten analyser. Vi märkte också att induktion av uttryck av ROBO1 av ROBO1 mutant konstruktionen utan Mir-218 bindningsställe skulle kunna vända miR-218-medierad hämning av tumörcellinvasion. I motsats, knockdown av ROBO1 genuttrycket RNAi hade en effekt på att minska tumörcellinvasion som liknar återställandet av MIR-218, även om ROBO1 knockdown enbart visade en svag effekt. Detta kan bero på att ROBO1 är inte det enda målet för MIR-218 som är relevant för tumörmetastas. Dessa upptäckter indikerar att invasionen undertryckande effekten av MIR-218 är åtminstone delvis medieras genom en minskning i ROBO1 expression. Detta är också den första studien som visar att den tumörassocierade genen ROBO1 regleras negativt av MIR-218 via ett specifikt målställe (nt 971-978) inuti 3'-UTR. Den ROBO1 receptorn är avgörande för svaret på extracellulära signaler och cellulära fenotypiska förändringar; Därför kan stram reglering av ROBO1 receptorn genom MIR-218 underlätta mer robust signaltransduktion. Anti-ROBO1 monoklonal antikropp har rapporterats vara en effektiv behandling för ROBO1-uttryckande cancer [30], [33]. I den aktuella studien fann vi en ny hämmare av ROBO1, MIR-218, som potentiellt kan användas för att behandla vissa typer av cancer.

Som nämnts ovan, Slit1, Slit2 och Slit3 omfattar Slit familjen proteiner. Även om generna överlappar varandra, deras uttrycksmönster och funktioner är distinkta. De tidigare två proteiner är kända för att vara inblandade i axon vägledning och cellmigration [37], [74], medan Slit3 är inblandade i utvecklingen av organ och organsystem, inklusive membranet och njuren [75]. I överensstämmelse med dessa uppgifter, fann vi att Slit2, men inte Slit3, samverkade med ROBO1 att främja GC invasion.

Dessutom har vi visat att Mir-218-kodande gener belägna i och transkriberas tillsammans med Slit gener , som var ROBO1 ligander, vilket skapar en negativ återkopplingsslinga som reglerar Slit /ROBO1 signalering. Søilen Barik visas att ett intron miRNA, miR-338, tystade gener som är funktionellt antagonistiska till sin värd genprodukt, vilket skapar en positiv feedback loop som hjälper till vid den fysiologiska rollen för värd genen [76].

• PLoS ONE: Vascular CXCR4 uttryck - en roman angiogeneshämmande mål i Gastric Cancer
• PLOS ONE: tysta Claudin-11 är associerad med ökad spridnings av Gastric cancerceller