PLoS Genetics: Mir-218 inibisce invasione e metastasi del cancro gastrico di mira le Robo1 Receptor

Estratto

I microRNA giocano un ruolo chiave in metastasi tumorali. Qui, descriviamo la regolazione e la funzione del miR-218 nel carcinoma gastrico (GC) metastasi. miR-218 diminuisce insieme con l'espressione di uno dei suoi geni ospitanti, Slit3 in GC metastatico. Tuttavia, Robo1, uno dei numerosi recettori fessura, è regolata negativamente da miR-218, stabilendo così un ciclo di feedback negativo. Diminuzione miR-218 livelli eliminano repressione Robo1, che attiva il percorso Slit-Robo1 attraverso l'interazione tra Robo1 e Slit2, innescando così metastasi tumorali. Il restauro di miR-218 sopprime l'espressione Robo1 e inibisce l'invasione delle cellule tumorali e metastasi in vitro
e in vivo
. Nel loro insieme, i nostri risultati descrivono un circuito normativo Slit-miR-218-Robo1 la cui interruzione può contribuire al GC metastasi. Targeting miR-218 può fornire una strategia per bloccare le metastasi del tumore.

Autore Sommario

I microRNA sono stati identificati come giocare un ruolo importante nella metastasi tumorali, ma il loro impatto su GC metastasi è stata scarsamente esplorata. Abbiamo scoperto miR-218, che funziona come un soppressore di metastasi del tumore ed è correlata con stadio clinico, metastasi linfonodali, e la prognosi in pazienti con GC. I nostri risultati mostrano che miR-218 è parte di un circuito normativo che coinvolge il percorso fessura-Robo1. Nelle cellule tumorali metastatiche, miR-218 è stato soppresso con Slit3, uno dei suoi geni ospitanti. Nel frattempo, Robo1, uno dei diversi recettori fessura, è upregulated in risposta alla diminuzione miR-218, che a sua volta induce una upregulation reattiva della via a fessura Robo1 attraverso un'interazione con Slit2, facilitando così la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione. Tali risultati non solo forniscono nuove informazioni sui meccanismi metastatici in GC, ma forniscono anche la prova per una modalità di regolamentazione miRNA-mediata romanzo di segnalazione dei recettori

Visto:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) Mir-218 inibisce invasione e metastasi del cancro gastrico di mira il Robo1 recettore. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 15 luglio 2009; Accettato: 10 febbraio 2010; Pubblicato: 12 marzo 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo studio è stata sostenuta dalla National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.670.970, n ° 30.873.026, n ° 30.672.369, n ° 30.530.780) e il Programma nazionale di ricerca di base della Cina (No.2010CB529300). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

I progressi nella approcci diagnostici e terapeutici hanno portato ad ottimi aspettative per la sopravvivenza a lungo termine per il cancro gastrico precoce (GC). Tuttavia, la prognosi per GC avanzata con una vasta invasione e metastasi rimane poveri [1]. Per metastatizzare, cellule tumorali devono passare attraverso una serie di eventi sequenziali e selettive, compresi distacco, migrazione, invasione locale, angiogenesi, intravasation, sopravvivenza nel sistema circolatorio, stravaso e ricrescita in diversi organi. In cascata metastatica, invasione GC nel tessuto circostante è un primo passo cruciale [2] - [4]. Tuttavia, i meccanismi di invasione non sono stati ancora completamente chiariti.

Un gran numero di acidi microribonucleic (microRNA o miRNA) sono stati recentemente implicati nella metastasi del cancro [5], tra cui miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520C, e miR-205 nel cancro al seno [6] - [11]; miR-224 e miR-21 nel cancro della prostata [12], [13]; miR-29c nei carcinomi del rinofaringe [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7, e miR-452 nei carcinomi uroteliali [15]; miR-182 nel melanoma [16]; miR-92b e miR-9/9 * nei tumori cerebrali [17]; e miR-21 in cancro del colon [18]. Tuttavia, sono stati segnalati pochissimi miRNA noti per essere coinvolti in GC metastasi. miRNA sono naturalmente presenti, a breve, le molecole di RNA non codificanti che regolano negativamente l'espressione genica [19]. Nei mammiferi, miRNA maturi sono generati dal pri-miRNA e pre-miRNA attraverso l'elaborazione sequenziale da Drosha e Dicer e si trovano in molti organismi. Sono costituiti da 21-24 nucleotidi, integrare in complessi di silenziamento di RNA che inducono, e abbinamento con le regioni non tradotte al 3 '(3'-UTR) di specifici RNA bersaglio messaggero (mRNA) per sopprimere traduzione o indurre la degradazione degli mRNA bersaglio [20 ]. Prove emergenti ha rivelato che miRNA giocano un ruolo chiave in vari processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare, la proliferazione, l'apoptosi, la resistenza allo stress, il metabolismo dei grassi, tumorigenesi, e le metastasi [21] - [23]. Una migliore comprensione dei cambiamenti dell'espressione dei miRNA durante GC invasione può portare ad una migliore comprensione dello sviluppo GC, così come i possibili miglioramenti nella diagnosi e nel trattamento di GC avanzata.

Nel presente studio, abbiamo stabilito alta (MKN28-M e SGC7901-M) e sottolinee bassi invasive di cellule (MKN28-nm e SGC7901-Nm) con un saggio transwell ripetitivo in vitro
. Abbiamo poi esaminato il profilo globale di espressione miRNA in ciascuna linea d'azione delle cellule utilizzando un microarray miRNA per identificare miRNA differenzialmente espressi legati all'invasione GC umana. In totale, 45 miRNA hanno dimostrato di essere espresso in modo differenziale invasiva vs cellule GC non invasive. Tra questi, miR-218, un miRNA significativamente downregulated in cellule altamente invasive, ha dimostrato di essere strettamente correlata con GC tumorigenesi e delle metastasi nei pazienti. Più di recente, una diminuzione del miR-218 è stato riportato in diversi tipi di tumori solidi, tra cui il cancro alla prostata, GC, il cancro del polmone, e il carcinoma della cervice uterina [24] - [27], ma questa diminuzione in miRNA-218 era semplicemente presentato fuori come uno delle decine di potenziali miRNA di interesse nei tumori di cui sopra. Nessun ulteriori studi sono stati condotti per valutare l'importanza di miR-218 in metastasi tumorali. Qui, abbiamo trovato che diminuita espressione di miR-218 è stata correlata con stadio avanzato clinica, metastasi linfonodali, e la scarsa prognosi nei pazienti, e ri-espressione di miR-218 in cellule metastatiche è stato in grado di inibire la migrazione, l'invasione, e la formazione di metastasi sia in vitro
e in vivo
. Utilizzando una ricerca bioinformatica per miR-218 obiettivi, abbiamo individuato il recettore Robo1 come obiettivo funzionale del miR-218, e abbiamo confermato che l'interazione tra miR-218 e Robo1 è stato cruciale per la motilità delle cellule GC, dimostrando che c'era una correlazione inversa tra miR -218 e Robo1 in linee cellulari GC, così come nei pazienti con GC. Inoltre, abbiamo scoperto un anello di retroazione negativo interessante coinvolge spacco, miR-218, e Robo1, in cui miR-218 può essere derivato da uno di due geni localizzati in introni di due distinti membri della famiglia di proteine ​​fessura. Inoltre, i membri di questa famiglia sono ligandi del recettore Robo1. Abbiamo dimostrato che l'espressione dei due geni precursori miRNA (miR-218-1 e miR-218-2) correlata con l'espressione dei geni ospitanti (rispettivamente Slit2 e Slit3,) e che il miR-218 è principalmente derivato dal miR -218-2 precursore, con una concomitante riduzione ospitante Slit3 ma non di Slit2 in cellule metastatiche GC. Così, upregulation di Robo1 in risposta alla diminuzione miR-218 induce una upregulation reattiva della via a fessura Robo1 attraverso la sua interazione con Slit2, facilitando così l'invasione delle cellule tumorali e metastasi. I nostri risultati non solo forniscono nuove informazioni sui meccanismi metastatici in GC, ma hanno anche rivelato un meccanismo di regolazione romanzo di segnalazione del recettore.

Risultati

Costituzione e caratterizzazione di sottolinee cellulari con differenti invasiva e metastatica potenzialità

Per stabilire i modelli GC metastasi, abbiamo creato sottolinee cellulari invasive e non invasive delle linee cellulari umane GC SGC7901 e MKN28 utilizzando l'approccio transwell ripetuta (Figura 1A, vedi Materiali e Metodi). Brevemente, un saggio di invasione ripetitiva è stato eseguito, e quelle cellule che non hanno invadere le membrane e le cellule che avevano la capacità di migrare attraverso la membrana di collagene rivestite in tutti i turni di selezione sono stati separati. Dopo dieci giri di selezione, abbiamo ottenuto sottolinee cellulari invasive (MKN28-M e SGC7901-M) e non invasive (MKN28-nm e SGC7901-NM). Le proprietà metastatiche di ogni linea d'azione delle cellule sono stati poi caratterizzati in vitro
e in vivo
. Come mostrato in figura 1B e 1C, capacità migrazione di cellule MKN28-M era circa 4 volte superiore a quella delle cellule MKN28-NM. Allo stesso modo, il potenziale invasivo era di circa 5 volte maggiore per le cellule MKN28-M rispetto alle cellule MKN28-NM. Negli in vivo
studi, le metastasi delle cellule tumorali è stata osservata in topi nudi. Come mostrato in Figura 1D e 1E, quasi non le cellule di GC metastatiche sono stati rilevati nei polmoni o fegato dei topi nudi a 10 settimane dopo l'iniezione di cellule MKN28-NM, mentre la maggior parte dei topi iniettati con cellule MKN28-M visualizzato evidente polmone o fegato metastasi. sono stati osservati risultati simili per SGC7901-M e cellule SGC7901-NM (dati non mostrati). Non sono state osservate differenze significative nella proliferazione cellulare o la distribuzione del ciclo cellulare tra questi sottolinee cellulari (Testo S1, Figure S1 e S2).

Identificazione di miRNA metastasi legati da basata su array di ibridazione

per identificare miRNA potenzialmente coinvolti in GC invasione, abbiamo esaminato l'espressione miRNA globale in ogni Subline cella utilizzando la matrice microRNA (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Danimarca), che consiste di 847 sonde di cattura per miRNA umani maturi. I risultati microarray hanno rivelato che l'espressione dei miRNA 124 significativamente diversa tra la variante altamente invasiva MKN28-M e la non-invasivo Subline cellule MKN28-NM. Di questi, 83 sono stati upregulated e 41 sono stati smorzati. Rispetto al SGC7901-NM, 62 miRNA sono stati differenziale espressi nella linea d'azione delle cellule SGC7901-M, tra cui 47 downregulated e 15 miRNA upregulated. In totale, 11 miRNA sono stati trovati ad essere upregulated e 34 miRNA sono stati inibiti in entrambe le cellule MKN28-M e SGC7901-M rispetto a quelli nei sottolinee non invasive corrispondenti (Tabella S1).

di 45 differenziale miRNA regolamentati, miR-218 è stato uno di quelli che ha visualizzato differenziale in modo significativo l'espressione. miR-218 è stato segnalato per essere downregulated in cancro del collo dell'utero [25], GC [26], il cancro del polmone [27] e il cancro alla prostata [28], che indica possibile coinvolgimento in entrambe trasformazione e tumore oncogenica metastasi. Tuttavia, miRNA-218 era solo una delle tante possibili miRNA di interesse nei tumori. In questo lavoro, miR-218 è stato studiato in modo molto più dettagliato. Per convalidare i risultati di microarray, abbiamo valutato l'espressione di miR-218 nei sottolinee cellulari GC precedentemente menzionati e nella linea di cellule epiteliali gastriche immortale GES mediante qRT-PCR [29]. miR-218 era significativamente diminuita in cellule MKN28-M e SGC7901-M e era inferiore in tutte e quattro sottolinee cellulari GC rispetto alle cellule immortalizzate umane gastriche epiteliali GES (Figura 2A). Inoltre, abbiamo confrontato miR-218 espressione nella primaria del tumore GC contro i linfonodi metastatici in 10 pazienti con stadio III /IV GC utilizzando qRT-PCR. Come mostrato nella Figura 2B, maturare miR-218 livelli sono risultati significativamente diminuiti in 7 su 10 linfonodi metastatici, indicando che miR-218 può giocare un ruolo causale nella GC metastasi.

Diminuzione miR-218 espressione in GC è stato associato con stadio avanzato clinica, metastasi linfonodali, e prognosi infausta paziente

Per determinare le possibili implicazioni clinico-patologici di alterato miR-218 espressione, abbiamo studiato i livelli di espressione di miR-218 in 40 tessuti GC (T) e non tumorali mucosa (N) mediante qRT-PCR. Il termine -ΔCt è stato utilizzato per descrivere il livello di espressione di miR-218. In accordo con i dati di cui sopra, i risultati hanno verificato che il livello di espressione di miR-218 in GC (-13,81 ± 0,15, media ± SE) tessuti è risultata significativamente più bassa di quella nella mucosa non neoplastica (-11,62 ± 0,15, media ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, in coppia t
-test) (Figura 3A). Le correlazioni tra il livello di espressione di miR-218 e le caratteristiche clinico-patologici di GC sono riassunti nella tabella sono stati osservati 1. Le associazioni statisticamente significative tra il livello di espressione di miR-218 e stadio clinico e tra il livello di espressione di miR-218 e GC metastasi in questo studio. L'espressione mediano di miR-218 è stato -14,25 ± 0,17 nei 22 casi con stadio avanzato (stadio III e IV), la malattia, mentre l'espressione mediana è stata di -13,27 ± 0.20 ( P = 0,0010
, Mann-Whitney test) nei 18 casi con stadio precoce (stadio i e II) la malattia. Nei 29 casi di GC con metastasi linfonodali, l'espressione mediana di miR-218 è stato -14,09 ± 0,16, che era significativamente più basso che l'espressione mediana (-13,07 ± 0,24) nei 11 casi GC non metastatico ( P = 0,0036
). L'espressione del miR-218 in pazienti CG non era correlata con l'età, il sesso, le dimensioni del tumore, o di differenziazione cellulare. Inoltre, abbiamo esaminato se il livello di espressione di miR-218 è stato associato con la sopravvivenza nei pazienti con GC. I pazienti sono stati successivamente suddivisi in bassa espressione (n = 20) e gruppi elevata espressione (n = 20) a base di miR-218 livelli superiore o inferiore alla media (-13,81) (Figura 3B). Kaplan-Meier di sopravvivenza analisi hanno rivelato che i pazienti i cui tumori primari visualizzata bassa espressione di miR-218 ha avuto un tempo mediano di sopravvivenza più breve. Il tasso di sopravvivenza a tre anni dei pazienti con bassa espressione di miR-218 è stata del 30%, che è stato significativamente inferiore al tasso di sopravvivenza nei pazienti con alta miR-218, l'espressione (65%; P = 0,0012
, log- rank test;. Figura 3C)

L'espressione ectopica di miR-218 ha inibito l'invasione delle cellule tumorali e metastasi in vitro
e in vivo

Per studiare il ruolo di miR-218 in GC metastasi, le cellule MKN28-M sono state trasfettate con pGenesil-1-miR-218 o un vettore di controllo che esprime un miRNA non specifico, cel-miR-67, utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Le cellule sono state quindi selezionate con 400 mg /L G418 per generare cellule stabili MKN28-M-miR-218 e MKN28-M-miR-controllo. Abbiamo scoperto che l'espressione ectopica di miR-218 ha comportato una riduzione di circa tre volte nella migrazione e l'invasività. Per determinare se la perdita di miR-218 favorirebbe la migrazione o l'invasione delle cellule tumorali, abbiamo tacere miR-218 con un inibitore oligonucleotidi antisenso nella linea cellulare MKN28-NM, con un conseguente aumento da tre a quattro volte nella migrazione delle cellule e invasività (Figura 4A e 4B). Per verificare se l'inibizione di invasione tumorale da miR-218 è causata da compromettere la capacità invasiva delle cellule tumorali, abbiamo escluso l'effetto di miR-218 sulla proliferazione e la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule di cancro gastrico. Over-espressione di miR-218 non ha influenzato la proliferazione e la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule MKN28-m in vitro
(Figura S5A e S5D). Per indagare ulteriormente l'inibizione di in vivo
tumore metastasi da miR-218, abbiamo impiantato MKN28-M-miR-218 cellule che sono state stabilmente esprimono miR-218 o il controllo cellule in topi nudi attraverso la vena della coda laterale. Polmone e metastasi epatiche di GC era evidente nei topi iniettati con cellule MKN28-M-miR-controllo. Al contrario, alcuni tumori metastatici sono stati rilevati nei topi iniettati con MKN28-M-miR-218 cellule (Figura 4C). Inoltre, abbiamo osservato simultaneamente la crescita dei tumori primari e l'incidenza di metastasi a distanza in topi nudi iniettati per via sottocutanea con MKN28-M-miR-218 celle o cellule di controllo. I risultati hanno mostrato polmone o fegato di metastasi era evidente in 3 su 10 topi iniettati con le cellule MKN28-M-miR-controllo; in netto contrasto, nessuna metastasi sono stati trovati in topi iniettati con MKN28-M-miR-218 cellule (Figura S5E). Questi risultati sono coerenti con i dati ottenuti da saggi di coda vena che valutano metastasi del cancro e indicare che miR-218 ha la capacità di sopprimere le metastasi senza influenzare la proliferazione cellulare.

Robo1 era un obiettivo funzionale diretta di miR-218 in GC metastasi

per valutare come un basso livello di miR-218 espressione contribuisce alla invasione e metastasi del GC, abbiamo cercato i potenziali obiettivi di regolamentazione del miR-218 che utilizzano strumenti di previsione, tra cui Miranda, PicTar, e TargetScan. Anche se centinaia di target differenti sono stati previsti, i geni coinvolti nella migrazione o l'invasione possono essere gli obiettivi rilevanti rispetto alle funzioni biologiche di miR-218. Abbiamo quindi effettuato una classificazione funzionale degli obiettivi previsti utilizzando il programma DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Di questi geni, Robo1 è considerato come attività proto-oncogene e porti la migrazione di promozione [30] - [35]. Mertsch et al.
Dimostrato che Robo1 facilita la migrazione delle cellule di glioma mediata da Slit2 [36]. Schmid et al.
Trovato che la migrazione delle cellule tumorali del seno è indotta dall'interazione Slit2-Robo1 in vitro
[37]. Questi risultati suggeriscono che Robo1 può essere un obiettivo per miR-218. Per testare ulteriormente la nostra ipotesi, abbiamo analizzato l'espressione di miR-218 e Robo1 in GES e non invasivo (MKN28-NM e SGC7901-NM) e invasiva (MKN28-M e SGC7901-M), le cellule GC. I risultati hanno mostrato una correlazione negativa tra i livelli di miR-218 e Robo1 mRNA in queste cellule (Figura S3A). Inoltre, abbiamo osservato che Robo1 mRNA (Figura S3B) e di proteine ​​(Figura 5B2) i livelli sono diminuite quando la miR-218 è stata espressa da pGenesil-1-miR-218 in cellule MKN28-M (Figura 5B1). Il contrario è stato osservato per l'espressione Robo1 quando miR-218 è stato abbattuto in cellule MKN28-NM (Figura 5C1 e Figura 5C2). La relazione inversa tra miR-218 e di espressione Robo1 è stata ulteriormente confermata mediante immunoistochimica (Testo S1) in 40 casi di cancro gastrico, in abbinati tessuti normali adiacenti che sono stati utilizzati anche in studi clinico-patologici, e in 29 metastasi abbinati. I risultati mostrano che Robo1 era upregulated in GC, soprattutto in GC metastatico (figura S4), in cui miR-218 ha una relativamente bassa espressione.

Per ottenere un'ulteriore prova diretta che Robo1 è un bersaglio di miR-218 , abbiamo studiato il sito di legame di miR-218 nel 3'-UTR di Robo1 mRNA (Figura 5A). Abbiamo costruito un reporter luciferasi (Luc-Robo1) in cui i nucleotidi del Robo1 3'-UTR complementare al miR-218 (nt 971-978) sono stati inseriti nella PMIR-REPORT miRNA espressione giornalista vettore [38]. Di conseguenza, abbiamo anche generato sia un giornalista mutante (Luc-Robo1-mu), in cui sono stati eliminati i primi sei nucleotidi nel seme-regione siti complementari miR-218, e un reporter di controllo, che conteneva un frammento non correlata di cDNA (Luc-Ctrl). miR-218-espressione plasmidi sono stati co-trasfettate con Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, o Luc-Ctrl in cellule MKN28-M. I saggi hanno mostrato che l'attività luciferasi nelle cellule Luc-Robo1 transfettate era significativamente diminuito rispetto all'attività luciferasi nelle cellule di controllo mutanti e negativi ( P
< 0,05), suggerendo che miR-218 ha ridotto il l'attività luciferasi di Luc-Robo1 ma non ha avuto effetto su Luc-Robo1-mu (Figura 5D). Pertanto, abbiamo concluso che il frammento inserito di Robo1 (nt 971 -
978). È stato il bersaglio di miR-218

Robo1 ha dimostrato di essere troppo espresso in cellule tumorali ed è conosciuto per promuovere l'angiogenesi tumorale e metastasi tramite una interazione con fessura [39], [40]. Per verificare se Robo1 è funzionalmente regolato da miR-218, abbiamo generato un costrutto espressione Robo1 che contiene solo un frammento del predetto miR-218 sito di legame e di espressione Robo1 mutante vettore del tutto privo della 3'-UTR. Abbiamo anche fatto il Robo1 siRNA. MKN28-M-miR-218 cellule, che stabilmente espressi miR-218 ectopicamente, sono state trasfettate con il costrutto Robo1 o il costrutto mutante (senza miR-218 sito di legame), e le cellule MKN28-M sono state trasfettate con Robo1 siRNA o di un siRNA controllo negativo. MKN28-M-miR-218 cellule trasfettate con il costrutto mutante Robo1 hanno mostrato un aumento di 3,8 volte della capacità di invasione rispetto alle cellule trasfettate con il costrutto Robo1. Questi risultati indicano che l'introduzione di mutanti Robo1 cDNA che mancava il sito di legame miR-218 nelle cellule miR-218-sovraesprimono invertito l'effetto di soppressione miR-218-mediata di invasione delle cellule. Tuttavia, l'effetto di Robo1 stata repressa da miR-218 in presenza del Robo1 3'-UTR contenente i siti di legame miR-218. Knockdown di Robo1 da siRNA in cellule MKN28-M ha inibito l'invasione delle cellule, che è sceso a livelli simili a quelli osservati dopo trasfezione con il vettore miR-218 che esprimono (Figura 5E e 5F). Queste osservazioni suggeriscono che miR-218 sopprime direttamente Robo1 mediata invasione delle cellule.

Slit2, ma non Slit3, può interagire con Robo1, arricchito dalla assenza di miR-218, per promuovere l'invasione GC

Due tipi di miRNA esistono: intergenico e intronic. I primi si trovano a non codificante regioni tra i geni e le loro corrispondenti pri-miRNA sono generalmente trascritti dai loro promotori dalla RNA polimerasi II. Questi ultimi si trovano all'interno introni di geni ospitanti, e la loro biogenesi è controllata dai promotori dei geni host [41], [42]. miR-218 è un miRNA intronico. codice due geni per mature miR-218, miR-218-1 e miR-218-2, che si trovano all'interno di introni 15 di Slit2 e introni 14 della Slit3, rispettivamente (figura 6A). La posizione intronic dei due miR-218 geni ci ha spinto a chiedere se miR-218-1 e miR-218-2 sono trascritti insieme con i loro geni mRNA ospitanti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo utilizzato qRT-PCR per esaminare l'espressione del miR-218-1 precursore, il precursore miR-218-2, maturo miR-218, Slit2 mRNA, e Slit3 mRNA nei tessuti GC utilizzati per la sopravvivenza analisi. L'analisi statistica del coefficiente di correlazione dei risultati qRT-PCR ha rivelato una significativa correlazione positiva tra i livelli di mRNA Slit2 e miR-218-1 e tra i livelli di mRNA Slit3 e miR-218-2 (Figura 6B e 6C). Questi risultati indicano che il miR-218 codifica i geni, miR-218-1 e miR-218-2, vengono trascritti insieme ai loro geni ospitanti, rispettivamente Slit2 e Slit3,. Una significativa correlazione positiva tra i livelli di miR-218 e miR-218-2 (Figura 6D) è stato visto in GC; tuttavia, tale correlazione è stata osservata tra i livelli di miR-218 e miR-218-1 (Figura 6E). Questi risultati indicano che sottoregolazione di miR-218 in GC è promosso da una diminuzione del miR-218-2, ma non in miR-218-1. Coerentemente con questa conclusione, l'espressione Slit3 è risultata significativamente ridotta nel GC (-22,43 ± 0,21, media ± SE) rispetto al tessuto gastrico normale (-20,79 ± 0,23, media ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7.67, in coppia t
-test) (Figura 6F), mentre l'espressione Slit2 non era significativamente differente ( P
= 0,0772, in coppia t
-test) ( Figura 6G). In sintesi, i nostri risultati sperimentali suggeriscono che la significativa upregulation del gene Robo1 in risposta alla rimozione di miR-218 può indurre una successiva sovraregolazione della via fessura-Robo1 attraverso la sua interazione con Slit2, facilitando la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione.

Discussione

per studiare una malattia, è fondamentale per la costruzione di un modello ideale. Nel presente studio, abbiamo isolato sottopopolazioni di cellule invasive e non invasive da linee cellulari umane GC stabiliti utilizzando l'approccio ripetuto transwell, che è stato applicato con successo in molti studi che hanno valutato tumore metastasi [43] - [48]. I risultati degli esami metastatico in vitro
e in vivo
ha mostrato che le sottolinee cellulari stabilizzate avevano le capacità invasive e metastatiche distinte. Qui, abbiamo proiettato non solo sottolinee cellulari derivate da linee cellulari GC ad alto invasivo potenziale, ma anche quelli con un basso potenziale invasivo. Con l'eccezione delle loro capacità metastatiche, le sottolinee cellulari selezionati erano entrambi molto simili, dal momento che condividono lo stesso background genetico. Poiché la principale differenza tra i due tipi di sublines è la capacità metastatica, i geni che differiscono tra loro dovrebbe correlano bene con metastasi. Inoltre, il nostro metodo è in grado di distinguere le fasi di invasione da metastasi e consente lo studio di interventi specifici in metastasi, che non possono essere valutati nel modello live-animale.

Di recente, sono stati segnalati miRNA per promuovere [49] , [50] o sopprimere [51] - [54] tumore metastasi, fornendo una nuova prospettiva sul processo metastatico. Tuttavia, il ruolo dei miRNA nel GC metastasi è carente. In questo rapporto, abbiamo esplorato e ottenuto per la prima volta 45 miRNA metastasi legati a GC sulla base di un modello cellulare di metastasi ben consolidata. La constatazione che miR-218 è stato downregulated in GC metastatico è intrigante, come è diminuito miR-218 livelli sono stati segnalati in diversi tipi di tumori solidi [24] - [27], [55], che indica che la perdita di miR-218 può essere un evento comune nella tumorigenesi. Nel presente studio, ci siamo concentrati sugli effetti della miR-218 sul GC metastasi e hanno dimostrato che miR-218 agisce come un soppressore del tumore in GC metastasi. Restauro di miR-218 la migrazione delle cellule ridotta e l'invasione in vitro
e tumore metastasi in vivo
. Per ottenere linee cellulari stabili che over-espresso miR-218, abbiamo trasfettato cellule MKN28-M con miR-218 plasmidi e proiettato dal G418. Abbiamo scelto dodici colonie di cellule nel gruppo miR-218-trasfettate e abbiamo trovato 10 su 12 colonie esposto notevolmente uniforme, stabile e l'espressione di alto livello di miR-218. Inoltre, tre linee di cellule monoclonali scelti a caso hanno mostrato simile riduzione ablility invasiva. Tuttavia, le strategie di trasfezione plasmidi spesso sfociano in minore efficienza di integrazione rispetto al espressione virale che porta alla possibilità di selezione stocastico di varianti rare funzionalmente eterogenee da parte della popolazione di massa iniziale. Quindi il futuro utilizzo di sistemi di espressione virale dovrebbe creare una popolazione di partenza più imparziale per testare la nostra ipotesi.

Come parte della nostra ricerca su come la perdita di miR-218 influisce GC metastasi, abbiamo dimostrato che Robo1 era una critica bersaglio a valle del miR-218. E 'noto che Robo è un recettore guida degli assoni per fessura ed è conservato negli animali che vanno da moscerini ai mammiferi. Nei mammiferi, tre fessura (Slit1-3) e quattro Robo (Robo1-4) geni sono stati descritti [56], [57]. Le interazioni Slit-Robo trasmettono segnali che mediano spunti repulsive su assoni e coni di crescita neuronale durante lo sviluppo e partecipa nella cella e monociti chemiotassi T [58] - [64]. Come per gli altri percorsi di sviluppo, espressione aberrante della fessura -
Robo geni è stata osservata in una varietà di tipi di tumore [65] - [68]. Per esempio, in campioni di tessuto di carcinoma mammario, Robo1 ha dimostrato di essere sovraespressi, ed è stato dimostrato di indurre la migrazione di linee cellulari di cancro al seno [37]. Slit2-Robo1 segnalazione facilita glioma cellule migrazione [36] ed è coinvolto nell'angiogenesi aumentando la densità dei microvasi e massa tumorale in un modello di tumore xenotrapianto [30]. Wang et al.
Dimostrato che l'espressione eccessiva di Robo1 in nuovi vasi sanguigni nei tumori induce neovascolarizzazione cancro e di crescita attraverso una interazione tra Robo1 e il suo ligando, Slit2. Essi hanno inoltre identificato phosphoinositide-3-chinasi (PI-3K) come effettori a valle di segnalazione Slit2 /Robo1. Ciò suggerisce che esiste una cascata fessura-Robo1-PI-3K che potrebbe portare alla generazione di fosfoinositolo-3,4,5-trifosfato e la successiva attivazione di piccole GTPasi che mediano movimento cellulare e rimodellamento del citoscheletro actina [30] , [35]. Al contrario, altri studi hanno sostenuto che la sottoregolazione di Robo1 causata da soppressioni o modifiche epigenetiche possono giocare un ruolo nella progressione tumorale [69] - [73]. Proponiamo che esiste un modello di espressione tessuto-specifica per i geni Slit-Robo.

In questo studio, abbiamo scoperto che Robo1 è stata spesso espressa ad alti livelli nelle cellule invasive e a bassi livelli in cellule non-invasive , mentre miR-218 appare il pattern di espressione opposto. Quando abbiamo trasfettato il vettore di miR-218-espressione e di oligonucleotidi che inibiscono in cellule MKN28-M e MKN28-NM, rispettivamente, è stato osservato un pattern di espressione inversa tra miR-218 e Robo1, cioè, se miR-218 espressione era alta, Robo1 espressione era basso e viceversa. Questo risultato è stato confermato anche in campioni clinici e nelle prove di attività luciferasi. Abbiamo anche notato che l'induzione di espressione di Robo1 dal costrutto mutante Robo1 senza il sito miR-218 legame potrebbe invertire la soppressione miR-218-mediata di invasione delle cellule tumorali. Al contrario, l'abbattimento di Robo1 espressione genica da RNAi ha avuto un effetto sulla riduzione invasione delle cellule tumorali simile a quello del restauro di miR-218, anche se Robo1 atterramento da solo ha dimostrato un debole effetto. Questo potrebbe essere perché Robo1 non è l'unico bersaglio di miR-218 che è rilevante per metastasi tumorali. Questi risultati indicano che l'effetto di soppressione invasione miR-218 è almeno parzialmente mediato da una diminuzione dell'espressione Robo1. Questo è anche il primo studio a dimostrare che il Robo1 gene associata a tumore è regolata negativamente da miR-218 tramite uno specifico sito di destinazione (nt 971-978) all'interno del 3'-UTR. Il recettore Robo1 è cruciale per la risposta ai segnali extracellulari e modifiche fenotipiche cellulari; Pertanto, stretta regolazione del recettore Robo1 da miR-218 può facilitare più robusto trasduzione del segnale. Anti-Robo1 anticorpo monoclonale è stato segnalato per essere un trattamento efficace per i tumori che esprimono Robo1 [30], [33]. Nel presente studio, abbiamo trovato un nuovo inibitore della Robo1, miR-218, che potrebbe potenzialmente essere usato per trattare alcuni tipi di cancro.

Come accennato in precedenza, Slit1, Slit2, e Slit3 comprendono la famiglia di fessura proteine. Anche se i geni si sovrappongono, i loro pattern di espressione e le funzioni sono distinte. I primi due proteine ​​sono noti per essere coinvolti nella guida degli assoni e migrazione cellulare [37], [74], mentre Slit3 è coinvolta nello sviluppo di organi e sistemi di organi, tra il diaframma e il rene [75]. In accordo con questi dati, abbiamo scoperto che Slit2, ma non Slit3, ha interagito con Robo1 per promuovere l'invasione GC.

Inoltre, abbiamo dimostrato che i miR-218 geni che codificano erano situate in e trascritti insieme con i geni della fessura , che erano ligandi Robo1, creando così un ciclo di feedback negativo che regola la segnalazione fessura /Robo1. Sailen Barik ha dimostrato che un intronic miRNA, miR-338, i geni che sono funzionalmente antagonista al suo prodotto genico ospite tacere, creando così un ciclo di feedback positivo che aiuta nel ruolo fisiologico del gene host [76].

• PLoS ONE: Vascular CXCR4 espressione - un bersaglio romanzo antiangiogenica nel cancro gastrico
• PLoS ONE: silenziamento del Claudin-11 è associata ad un aumento invasività delle cellule cancro gastrico