PLoS Genetics: miR-218 inhibe la invasión y metástasis de cáncer gástrico mediante la focalización Robo1 Receptor

Extracto

Los microARN desempeñan un papel clave en la metástasis tumoral. A continuación, describimos la regulación y función de miR-218 en la metástasis de cáncer gástrico (CG). la expresión de miR-218 se disminuye junto con la expresión de uno de sus genes del huésped, SLIT3 en GC metastásico. Sin embargo, Robo1, uno de los varios receptores de hendidura, está regulada negativamente por el miR-218, estableciendo así un bucle de retroalimentación negativa. Disminución de los niveles de miR-218 eliminan la represión Robo1, que activa la vía de hendidura Robo1 a través de la interacción entre Robo1 y Slit2, desencadenando así la metástasis tumoral. La restauración de miR-218 suprime la expresión Robo1 e inhibe la invasión de células tumorales y la metástasis in vitro
y in vivo
. Tomados en conjunto, nuestros resultados describen un circuito de regulación de hendidura-miR-218-Robo1 cuya interrupción puede contribuir a la metástasis GC. Orientación de miR-218 puede proporcionar una estrategia para bloquear la metástasis tumoral.

Autor Resumen

Los microARN se han identificado como jugando un papel importante en la metástasis tumoral, pero su impacto en la metástasis GC ha sido poco explorado. Hemos descubierto miR-218, que funciona como un supresor de la metástasis del tumor y se correlaciona con el estadio clínico, la metástasis de los ganglios linfáticos, y el pronóstico en pacientes con GC. Nuestros resultados muestran que el miR-218 es parte de un circuito de regulación relativo a la vía de hendidura Robo1. En las células tumorales metastásicas, miR-218 fue suprimida junto con SLIT3, uno de sus genes de acogida. Mientras tanto, Robo1, uno de los varios receptores de corte largo, está regulada positivamente en respuesta a la disminución de miR-218, que a su vez indujo una regulación al alza reactiva de la vía de hendidura Robo1 a través de una interacción con Slit2, facilitando así la migración de células tumorales y la invasión. Tales resultados no sólo proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos metastásicos en GC, sino también proporcionan evidencia de un modo de regulación miARN mediada por la novela de la señalización del receptor

Visto:. Tie J, Pan Y, Zhao L, K Wu, Liu J, Sun S, et al. (2010) miR-218 inhibe la invasión y metástasis de cáncer gástrico por dirigirse al receptor Robo1. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Estados Unidos de América

Recibido: 15 Julio, 2009; Aceptado: 10 Febrero 2010; Publicado: 12 Marzo 2010

Derechos de Autor © 2010 Lazo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30670970, Nº 30873026, Nº 30672369, Nº 30530780) y el Programa Nacional de Investigación básica de China (No.2010CB529300). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Los avances en las técnicas diagnósticas y terapéuticas han dado lugar a excelentes expectativas para la supervivencia a largo plazo para el cáncer gástrico temprano (GC). Sin embargo, el pronóstico para GC avanzada con extensa invasión y metástasis sigue siendo pobre [1]. Con el fin de hacer metástasis, las células tumorales deben pasar a través de una serie de eventos secuenciales y selectivos, incluyendo el desprendimiento, la migración, invasión local, la angiogénesis, la intravasación, la supervivencia en el sistema circulatorio, la extravasación, y el nuevo crecimiento en diferentes órganos. En la cascada metastásica, la invasión de GC en el tejido circundante es un paso temprano fundamental [2] - [4]. Sin embargo, los mecanismos de invasión aún no han sido completamente aclarada.

Un gran número de ácidos microribonucleic (microRNAs o miRNAs) han sido recientemente implicados en la metástasis del cáncer [5], incluyendo el miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520c, y miR-205 en el cáncer de mama [6] - [11]; miR-224 y miR-21 en el cáncer de próstata [12], [13]; miR-29c en los carcinomas nasofaríngeos [14]; miR-10a, miR-222, miR-125 ter, MIR-7, y miR-452 en los carcinomas uroteliales [15]; miR-182 en el melanoma [16]; miR-92b y miR-9/9 * en los tumores cerebrales [17]; y miR-21 en el cáncer colorrectal [18]. Sin embargo, se han notificado muy pocos miRNAs conocidos por estar implicados en la metástasis GC. miRNAs son de origen natural, moléculas cortas, no codificantes de ARN que regulan negativamente la expresión de genes [19]. En los mamíferos, madurez miRNAs se generan a partir pri-miRNAs y pre-miRNAs a través de un procesamiento secuencial por Drosha y Dicer y se encuentran en muchos organismos. Se componen de 21-24 nucleótidos, integrarse en los complejos de silenciamiento de ARN inductor, y emparejar con las regiones 3 'no traducidas (3'-UTR) de los ARN específicos mensajero diana (ARNm) para suprimir la traducción o inducir la degradación de los mRNAs diana [20 ]. Nuevas pruebas ha puesto de manifiesto que miRNAs juegan un papel clave en diversos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, la apoptosis, la resistencia al estrés, metabolismo de las grasas, la tumorigénesis y metástasis [21] - [23]. Una mejor comprensión de los cambios en la expresión de los genes miARN durante la invasión GC puede conducir a una mejor comprensión del desarrollo GC, así como las posibles mejoras en el diagnóstico y tratamiento de la CG avanzado.

En el presente estudio, hemos establecido altos (MKN28-M y SGC7901-M) y sublíneas bajas invasivas celulares (MKN28-NM y SGC7901-NM) utilizando un ensayo transwell repetitivo in vitro
. A continuación, examinó el perfil global de la expresión de los genes miARN en cada sublínea celular utilizando un microarray para identificar los genes miARN miRNAs expresados ​​diferencialmente relacionados con la invasión GC humana. En total, se han demostrado que se expresa diferencialmente en células invasiva vs GC no invasivos 45 miRNAs. Entre ellos, miR-218, un miARN downregulated significativamente en las células altamente invasivos, ha demostrado estar estrechamente correlacionado con la tumorigénesis GC y la metástasis en pacientes. Más recientemente, una disminución de miR-218 se ha informado en varios tipos de tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata, GC, cáncer de pulmón y el carcinoma cervical [24] - [27], pero esta disminución de los genes miARN-218 fue simplemente proyectada fuera como una de las docenas de posibles miRNAs de interés de los cánceres descritos anteriormente. No hay más estudios se han realizado para evaluar la importancia de miR-218 en la metástasis tumoral. Aquí, hemos encontrado que la disminución de la expresión de miR-218 se correlacionó con la etapa avanzada clínica, metástasis de ganglios linfáticos, y de mal pronóstico en los pacientes, y la re-expresión de miR-218 en células metastásicas fue capaz de inhibir la migración, invasión y la formación de metástasis ambos in vitro
y in vivo
. Usando una búsqueda bioinformática para miR-218 objetivos, hemos identificado el receptor de Robo1 como objetivo funcional de miR-218, y se confirmó que la interacción entre el miR-218 y Robo1 fue crucial para la motilidad celular GC mediante la demostración de la existencia de una correlación inversa entre el miR -218 y Robo1 en líneas celulares de GC, así como en pacientes GC. Además, hemos descubierto un bucle de retroalimentación negativa que implica intrigante de corte largo, miR-218, y Robo1, en el que miR-218 se puede derivar de cualquiera de los dos genes localizados en los intrones de dos miembros diferentes de la familia de proteínas de hendidura. Además, los miembros de esta familia son ligandos del receptor Robo1. Hemos demostrado que la expresión de los dos genes miARN precursores (miR-218-1 y miR-218-2) se correlacionaron con la expresión de los genes del huésped (Slit2 y SLIT3, respectivamente) y que la madurez de miR-218 se deriva principalmente del MIR -218-2 precursor, con una reducción concomitante de anfitrión SLIT3 pero no de Slit2 en células GC metastásicos. Por lo tanto, la regulación positiva de Robo1 en respuesta a la disminución de miR-218 indujo una regulación al alza reactiva de la vía de hendidura Robo1 a través de su interacción con Slit2, facilitando así la invasión de células tumorales y la metástasis. Nuestros resultados no sólo proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos metastásicos en GC, pero también revelaron un novedoso mecanismo de regulación de la señalización del receptor.

Resultados

Establecimiento y caracterización de sublíneas celulares con diferentes invasivo y metastásico potenciales

Para establecer los modelos de GC metástasis, creamos sublíneas de células invasivas y no invasivas de las líneas celulares humanas GC SGC7901 y MKN28 utilizando el enfoque transwell repetida (Figura 1A, véase Materiales y Métodos). Brevemente, se realizó un ensayo de invasión repetitivo, y aquellas células que no lograron invadir las membranas y células que tenían la capacidad de migrar a través de la membrana recubierta de colágeno en todas las rondas de selección se separaron. Después de diez rondas de selección, se obtuvieron sublíneas de células invasoras (MKN28-M y SGC7901-M) y no invasivos (MKN28-NM y SGC7901-NM). Las propiedades metastásicas de cada sublínea celular se caracterizan entonces in vitro
y in vivo
. Como se muestra en la Figura 1B y 1C, la capacidad de migración de las células MKN28-M fue de aproximadamente 4 veces mayor que la de las células MKN28-NM. Del mismo modo, el potencial invasivo era aproximadamente 5 veces mayor para las células MKN28-M en comparación con células MKN28-NM. En los in vivo
estudios, se observó metástasis de células tumorales en ratones desnudos. Como se muestra en la figura 1D y 1E, casi no se detectaron células GC metastásicos en los pulmones o el hígado de ratones desnudos a las 10 semanas después de la inyección de las células MKN28-nm, mientras que la mayoría de los ratones inyectados con células MKN28-M se muestra pulmón o el hígado obvio metástasis. Se observaron resultados similares para SGC7901-M y las células SGC7901-nM (datos no mostrados). No se observaron diferencias significativas en la proliferación celular o la distribución del ciclo celular entre estos sublíneas celulares (Texto S1, S1 y S2,).

Identificación de miRNAs relacionados con metástasis de matriz basada en la hibridación

para identificar miRNAs potencialmente implicados en la invasión de GC, se analizó la expresión de los genes miARN global en cada sublínea celular usando la matriz de micro ARN (versión 10.0, Exiqon, Vedbaek, Dinamarca), que consta de 847 sondas de captura para miRNAs humanos maduros. Los resultados de los microarrays revelaron que la expresión de 124 miRNAs difirió significativamente entre la variante altamente invasiva MKN28-M y la sublínea de células no invasiva MKN28-NM. De estos, 83 fueron upregulated y 41 se downregulated. En comparación con SGC7901-NM, 62 miRNAs se expresaron diferencialmente en la sublínea celular SGC7901-M, incluyendo 47 y 15 downregulated miRNAs upregulated. En total, se encontraron 11 miRNAs que se upregulated y 34 miRNAs fueron regulados a la baja tanto en las células MKN28-M y SGC7901-M en comparación con los de las sublíneas no invasivos correspondientes (Tabla S1).

De los 45 diferencialmente miRNAs regulados, miR-218 fue uno de los que está representada diferencial significativamente la expresión. miR-218 se ha informado de que se downregulated en el cáncer cervical [25], GC [26], cáncer de pulmón [27] y el cáncer de próstata [28], lo que indica la posible participación tanto en la transformación y el tumor oncogénico metástasis. Sin embargo, los genes miARN-218 fue sólo una de las muchas posibles miRNAs de interés en los cánceres. En este trabajo, el miR-218 se ha investigado con mucho más detalle. Para validar los resultados de microarrays, se evaluó la expresión de miR-218 en las sublíneas de células GC mencionados anteriormente y en la línea celular epitelial gástrica inmortal GES mediante qRT-PCR [29]. expresión de miR-218 se redujo significativamente en las células MKN28-M y SGC7901-M y fue menor en los cuatro sublíneas de células GC en comparación con células inmortalizadas humanos gástricos epiteliales GES (Figura 2A). Además, se comparó la expresión de miR-218 en el tumor primario GC frente a los ganglios linfáticos metastásicos en 10 pacientes con estadio III /IV GC usando QRT-PCR. Como se muestra en la Figura 2B, madurar los niveles de miR-218 se redujo significativamente en 7 de los 10 ganglios linfáticos metastásicos, lo que indica que el miR-218 puede desempeñar un papel causal en la metástasis del GC.

Disminución de miR-218 expresión en GC se asoció con la etapa avanzada clínica, metástasis en los ganglios linfáticos, y el mal pronóstico del paciente

Para determinar las posibles implicaciones clínico-patológicas de la expresión alterada de miR-218, se investigaron los niveles de expresión de miR-218 en 40 tejidos GC (T) y mucosa no tumoral (N) de QRT-PCR. El término -ΔCt se utiliza para describir el nivel de expresión de miR-218. En consonancia con los datos anteriores, los resultados verificaron que el nivel de expresión de miR-218 en GC (-13,81 ± 0,15, con una media ± SE) tejidos fue significativamente menor que en la mucosa no neoplásica (-11,62 ± 0,15, con una media ± DE) ( P Hotel < 0,0001, t = 10,62, a la par t-test
) (Figura 3A). Las correlaciones entre el nivel de expresión de miR-218 y las características clínico-patológicas de GC se resumen en la Tabla 1. Se observaron asociaciones estadísticamente significativas entre el nivel de expresión de miR-218 y el estadio clínico y entre el nivel de expresión de miR-218 y la metástasis GC en este estudio. La mediana de expresión de miR-218 fue -14,25 ± 0,17 en los 22 casos con estadio avanzado (estadio III y IV) la enfermedad, mientras que la expresión media fue de -13,27 ± 0,20 ( P = 0,0010
, Mann-Whitney prueba) en los 18 casos con estadio temprano (estadios I y II de la enfermedad). En los 29 casos de GC con metástasis en los ganglios linfáticos, la mediana de expresión de miR-218 fue -14,09 ± 0,16, que fue significativamente inferior a la mediana de expresión (-13,07 ± 0,24) en los casos de CG 11 no metastásicos ( P = 0,0036
). La expresión de miR-218 en pacientes con cáncer gástrico no se correlacionó con la edad, el sexo, el tamaño del tumor, o la diferenciación celular. Por otra parte, se examinó si el nivel de expresión de miR-218 se asoció con la supervivencia en pacientes con CG. Los pacientes se dividieron posteriormente en baja expresión (n = 20) y los grupos de alto de expresión (n = 20) sobre la base de miR-218 niveles mayores o menores que la media (-13,81) (Figura 3B). Los análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los pacientes cuyos tumores primarios que se muestra una baja expresión de miR-218 tenían una mediana de supervivencia más corta. La tasa de supervivencia de tres años de los pacientes con baja expresión de miR-218 fue de 30%, que fue significativamente más baja que la tasa de supervivencia en pacientes con alta expresión de miR-218 (65%; P = 0,0012
, log rank test;. Figura 3C)

La expresión ectópica de miR-218 inhibe la invasión de células tumorales y la metástasis
e in vitro in vivo

Para estudiar el papel de miR-218 en la metástasis GC, células MKN28-M fueron transfectadas con pGenesil-1-miR-218 o un vector control que expresa un miARN no específica, cel-miR-67, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU. ). a continuación, se seleccionaron las células con 400 mg /l de G418 para generar células estables MKN28-M-miR-218 y miR-de control-M MKN28. Se encontró que la expresión ectópica de miR-218 dio lugar a una reducción de aproximadamente tres veces en la migración y capacidad de invasión. Para determinar si la pérdida de miR-218 promovería la migración o invasión de las células cancerosas, silenciamos miR-218 con un inhibidor oligonucleótido antisentido en la línea celular MKN28-NM, lo que resulta en un aumento de tres a cuatro veces en la migración celular y la invasividad (Figura 4A y 4B). Para probar si la inhibición de la invasión tumoral por miR-218 es causado por alterar la capacidad invasiva de las células tumorales, se excluyeron el efecto de miR-218 en la proliferación y el ciclo celular distribución de células de cáncer gástrico. La sobreexpresión de miR-218 no afectó a la proliferación y la distribución del ciclo celular de las células MKN28-M in vitro gratis (Figura S5A y S5D). Para investigar más a fondo la inhibición de in vivo
metástasis tumoral por el miR-218, se implantó células MKN28-M-miR-218 que se expresan de forma estable células de miR-218 o de control en ratones desnudos a través de la vena lateral de la cola. De pulmón y metástasis hepática de GC fue evidente en los ratones inyectados con células-miR-M de control MKN28. Por el contrario, se detectaron pocos tumores metastásicos en ratones inyectados con MKN28-M-miR-218 células (Figura 4C). Asimismo, se observó simultáneamente el crecimiento de los tumores primarios y la incidencia de metástasis a distancia en los ratones desnudos inyectados por vía subcutánea con MKN28-M-miR-218 células o células de control. Los resultados mostraron pulmón o el hígado metástasis fue evidente en 3 de cada 10 ratones inyectados con células-miR-de control MKN28 M; en contraste, no se encontraron metástasis en ratones inyectados con MKN28-M-miR-218 células (Figura S5E). Estos resultados son consistentes con los datos obtenidos a partir de ensayos vena de la cola que evalúan la metástasis del cáncer e indican que miR-218 tiene la capacidad de suprimir la metástasis sin afectar a la proliferación celular.

Robo1 era un objetivo funcional directa de miR-218 en GC metástasis

para evaluar cómo un bajo nivel de expresión de miR-218 contribuye a la invasión y la metástasis de GC, se realizaron búsquedas de los posibles objetivos de regulación de miR-218 utilizando herramientas de predicción, incluyendo Miranda, PicTar, y TargetScan. Aunque se predijo cientos de diferentes objetivos, los genes implicados en la migración o invasión pueden ser los objetivos pertinentes con respecto a las funciones biológicas de miR-218. A continuación, realiza una clasificación funcional de los objetivos previsto utilizando el programa de DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). De estos genes, Robo1 es considerado como una actividad proto-oncogén y puertos migración promotoras [30] - [35]. Mertsch et al.
Demostró que Robo1 facilita la migración de células de glioma mediada por Slit2 [36]. Schmid et al.
Encontró que la migración de células de tumor de mama es inducida por la interacción Slit2-Robo1 in vitro
[37]. Estos hallazgos sugieren que Robo1 puede ser un objetivo para el miR-218. A fin de probar nuestra hipótesis, analizamos la expresión de miR-218 y Robo1 en GES y no invasiva (MKN28-NM y SGC7901-NM) e invasivo (MKN28-M y SGC7901-M) células GC. Los resultados mostraron una correlación negativa entre los niveles de miR-218 y ARNm Robo1 en estas células (Figura S3 A). Por otra parte, se observó que los niveles de mRNA Robo1 (Figura S3 B) y proteínas (Figura 5B2) fueron menores cuando el miR-218 fue expresada por pGenesil-1-miR-218 en células MKN28-M (Figura 5B1). Se observó la inversa para la expresión Robo1 cuando miR-218 fue derribado en células MKN28-NM (Figura 5C1 y 5C2 figura). La relación inversa entre el miR-218 y expresión Robo1 fue confirmado por inmunohistoquímica (Texto S1) en 40 casos de cáncer gástrico, en los tejidos normales adyacentes coincidentes que también se utilizaron en los estudios clínico-patológicos, y en 29 metástasis emparejados. Los resultados muestran que Robo1 se reguló en GC, especialmente en GC metastásico (Figura S4), en el que el miR-218 tiene una expresión relativamente baja.

Para obtener más evidencia directa de que Robo1 es un objetivo de miR-218 , se investigó el sitio de unión de miR-218 en la 3'-UTR de Robo1 ARNm (Figura 5A). Se construyó un indicador de luciferasa (Luc-Robo1) en el que los nucleótidos de la Robo1 3'-UTR complementario a miR-218 (nt 971-978) se insertaron en el PMIR-INFORME miRNA reportero de expresión vector [38]. En consecuencia, también generamos tanto un reportero mutante (Luc-Robo1-mu), en la que se han eliminado los primeros seis nucleótidos de los miR-218 sitios complementarios de semillas de cada región, y un reportero de control, que contenía un fragmento no relacionado de ADNc (Luc-Ctrl). miR-218-expresión plásmidos fueron co-transfectadas con Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, o Ctrl-Luc en células MKN28-M. Los ensayos mostraron que la actividad de la luciferasa en las células transfectadas-Luc-Robo1 significativamente se disminuyó en comparación con la actividad de luciferasa en las células de control mutantes y negativos ( P
< 0,05), sugiriendo que miR-218 redujo la la actividad luciferasa de Luc-Robo1 pero no tuvo efecto sobre Luc-Robo1-mu (Figura 5D). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el fragmento insertado de Robo1 (nt 971 -
978). Era el objetivo de miR-218

Robo1 se ha demostrado que se sobre-expresado en las células cancerosas y es conocido para promover la angiogénesis tumoral y la metástasis a través de una interacción con la raja [39], [40]. Para probar si Robo1 está regulada funcionalmente por miR-218, que generó un constructo de expresión Robo1 que contiene sólo un fragmento del sitio de unión de miR-218 predichos y vector de expresión mutante Robo1 carecen totalmente la 3'-UTR. También hicimos la Robo1 siRNA. células MKN28-M-miR-218, que de manera estable expresan miR-218 ectópica, se transfectaron transitoriamente con el Robo1 constructo o el constructo mutante (sin sitio de unión de miR-218), y las células MKN28-M se transfectaron con Robo1 siRNA o una siRNA control negativo. MKN28-M-miR-218 células transfectadas con el constructo mutante Robo1 mostraron un aumento de 3,8 veces en la capacidad de invasión en comparación con las células transfectadas con el constructo Robo1. Estos resultados indican que la introducción de mutante Robo1 de ADNc que carecía del sitio de unión de miR-218 en las células miR-218 que sobreexpresan invirtió el efecto de la supresión mediada por miR-218 de la invasión de células. Sin embargo, el efecto de Robo1 fue reprimida por miR-218 en presencia de la Robo1 3'-UTR que contiene los sitios de unión de miR-218. Desmontables de Robo1 de siRNA en células MKN28-M inhibe la invasión de células, que cayó a niveles similares a los observados después de la transfección con el vector de miR-218 que expresan (Figura 5E y 5F). Estas observaciones sugieren que el miR-218 suprime directamente la invasión de células mediada por Robo1.

Slit2, pero no SLIT3, puede interactuar con Robo1, enriquecida por la ausencia de miR-218, para promover la invasión GC

existen dos tipos de miRNAs: intergénicas y intronic. Los primeros se encuentran en las regiones no codificantes entre los genes, y sus correspondientes pri-miRNAs generalmente se transcribe a partir de sus propios promotores de la ARN polimerasa II. Estos últimos se encuentran dentro de los intrones de genes del huésped, y su biogénesis es controlada por los promotores de genes de acogida [41], [42]. miR-218 es un miARN intrónica. código de dos genes para madura de miR-218, miR-218-1 y miR-218-2, que se encuentra dentro del intrón 15 del Slit2 y el intrón 14 del SLIT3, respectivamente (Figura 6A). La ubicación intrónica de los dos genes miR-218 nos llevó a preguntar si miR-218-1 y miR-218-2 se transcriben junto con sus ARNm de genes de acogida. Para probar esta hipótesis, se utilizó QRT-PCR para examinar la expresión del precursor de miR-218 a 1, el precursor de miR-218-2, Maduro miR-218, mRNA Slit2, y mRNA SLIT3 en los tejidos GC utilizados en la supervivencia análisis. El análisis estadístico del coeficiente de correlación de los resultados QRT-PCR reveló una correlación positiva significativa entre los niveles de ARNm Slit2 y miR-218-1 y entre los niveles de ARNm SLIT3 y miR-218-2 (Figura 6B y 6C). Estos resultados indican que el miR-218 genes de codificación, miR-218-1 y miR-218-2, se transcriben junto con sus genes del huésped, Slit2 y SLIT3, respectivamente. Una correlación positiva significativa entre los niveles de miR-218 y miR-218-2 (Figura 6D) se observó en GC; Sin embargo, no hay tal se observó correlación entre los niveles de miR-218 y miR-218-1 (Figura 6E). Estos resultados indican que la regulación a la baja de miR-218 en GC es promovida por una disminución en el miR-218-2, pero no en el miR-218-1. En consonancia con esta conclusión, la expresión SLIT3 se redujo significativamente en GC (-22,43 ± 0,21, media ± SE) en comparación con el tejido gástrico normal (-20,79 ± 0,23, con una media ± DE), ( P Hotel < 0,0001, t = 7,67, emparejado t-test
) (Figura 6F), mientras que la expresión Slit2 no fue significativamente diferente ( P = 0,0772
, emparejado t-test
) ( Figura 6G). En resumen, nuestros resultados experimentales sugieren que la regulación al alza significativa del gen Robo1 en respuesta a la eliminación de miR-218 puede inducir una regulación por incremento posterior de la vía de hendidura Robo1 a través de su interacción con Slit2, facilitando la migración de células tumorales y la invasión.

Discusión

para estudiar una enfermedad, es vital para construir un modelo ideal. En el presente estudio, hemos aislado subpoblaciones de células invasivas y no invasivas de líneas celulares GC humanos establecidos utilizando el enfoque repetido transwell, que ha sido aplicado con éxito en muchos estudios investigar la metástasis del tumor [43] - [48]. Los resultados del examen metastásico in vitro
y in vivo
mostró que las sublíneas celulares establecidas tenían capacidades invasivas y metastásicas distintas. Aquí, hemos examinado no sólo sublíneas de células derivadas de líneas celulares de GC con un potencial de alto invasiva, sino también aquellos con bajo potencial invasivo. Con la excepción de sus capacidades metastásicas, las sublíneas de células seleccionadas eran bastante similares, ya que comparten los mismos antecedentes genéticos. Dado que la principal diferencia entre los dos tipos de sublíneas es la capacidad metastásica, los genes que difieren entre ellos deben correlacionan bien con la metástasis. Por otra parte, nuestro método es capaz de distinguir las fases de invasión de metástasis y permite el estudio de los pasos específicos en la metástasis, que no pueden ser evaluadas en el modelo con animales vivos.

Recientemente, se ha informado de miRNAs para promover [49] , [50] o suprimir [51] - [54] metástasis tumoral, que proporciona una nueva perspectiva sobre el proceso metastásico. No obstante, el papel de los miRNAs en la metástasis del GC es insuficiente. En este informe, hemos explorado y se obtuvo por primera vez 45 miRNAs relacionados con metástasis en GC basados ​​en un modelo celular metástasis bien establecida. El hallazgo de que miR-218 se downregulated en GC metastásico es intrigante, como la disminución de los niveles de miR-218 se han reportado en varios tipos de tumores sólidos [24] - [27], [55], lo que indica que la pérdida de miR-218 puede ser un evento común en la tumorigénesis. En el presente estudio, se centró en el efecto de miR-218 en la metástasis GC y demostró que el miR-218 actúa como un supresor de tumores en la metástasis del GC. Restauración de miR-218 menor migración celular y la invasión in vitro Opiniones y metástasis tumoral in vivo
. Para obtener líneas celulares estables que sobre-expresan el miR-218, transfectadas las células MKN28-M con el miR-218 plásmidos y seleccionará de G418. Se seleccionaron doce colonias de células transfectadas en el grupo-miR-218 y encontramos 10 de los 12 colonias exhibido notablemente uniforme, estable y alto nivel de expresión de miR-218. Por otra parte, tres líneas de células monoclonales elegidos al azar mostraron reducción similar en ablility invasivo. Sin embargo, las estrategias de transfección de plásmidos a menudo resultan en una menor eficiencia de la integración comparación con la expresión viral que lleva a la posibilidad de selección estocástico de raras variantes funcionalmente heterogéneas de la población mayor inicial. Por lo tanto el uso futuro de los sistemas de expresión viral debe crear una población inicial más imparcial para probar nuestra hipótesis
.

Como parte de nuestra investigación sobre cómo la pérdida de miR-218 afecta GC metástasis, hemos demostrado que Robo1 era una crítica abajo objetivo de miR-218. Se sabe que Robo es un receptor de guía de axones de hendidura y se conserva en los animales que van de moscas de la fruta a los mamíferos. En los mamíferos, tres de hendidura (Slit1-3) y cuatro genes Robo (Robo1-4) se han descrito [56], [57]. Las interacciones de hendidura-Robo transmiten señales que median señales repulsivas en los axones y los conos de crecimiento durante el desarrollo neuronal y participa en la célula y monocitos quimiotaxis T [58] - [64]. En cuanto a otras vías de desarrollo, la expresión aberrante de la ranura -
Robo genes se ha observado en una variedad de tipos de tumores [65] - [68]. Por ejemplo, en muestras de tejido de carcinoma de mama, Robo1 se ha demostrado que se expresa sobre-, y se ha demostrado para inducir la migración de las líneas celulares de cáncer de mama [37]. señalización Slit2-Robo1 facilita la migración de células de glioma [36] y está implicado en la angiogénesis mediante el aumento de la densidad de microvasos y la masa tumoral en un modelo de xenoinjerto de tumor [30]. Wang et al.
Demostró que la expresión excesiva de Robo1 en nuevos vasos sanguíneos en los tumores induce la neovascularización y el crecimiento del cáncer a través de una interacción entre Robo1 y su ligando, Slit2. También identificaron phosphoinositide-3-cinasa (PI-3K) como un efector aguas abajo de la señalización de Slit2 /Robo1. Esto sugiere que existe una cascada de hendidura Robo1-PI-3K que podría conducir a la generación de fosfoinositol-3,4,5-trifosfato y la posterior activación de las pequeñas GTPasas que median el movimiento celular y la remodelación del citoesqueleto de actina [30] , [35]. Por el contrario, otros estudios han argumentado que la regulación a la baja de Robo1 causada por supresiones o modificaciones epigenéticas pueden desempeñar un papel en la progresión tumoral [69] - [73]. Proponemos que existe un patrón de expresión específica de tejido de los genes de hendidura-Robo.

En el presente estudio, se encontró que Robo1 se expresa a menudo en altos niveles en las células invasoras y en niveles bajos en las células no invasivas , mientras que el miR-218 muestra el patrón de expresión opuesta. Cuando transfectadas el vector de miR-218-expresión y oligonucleótidos que inhiben en células MKN28-M y MKN28-nm, respectivamente, se observó un patrón de expresión inversa entre miR-218 y Robo1, es decir, si miR-218 expresión era alta, Robo1 expresión fue baja y viceversa. Este resultado fue confirmado en muestras clínicas y en los ensayos de actividad de luciferasa. También hay que destacar que la inducción de la expresión de Robo1 por la construcción de mutantes Robo1 sin el sitio de unión de miR-218 podría revertir mediada por la supresión de miR-218 de la invasión de células tumorales. Por el contrario, desmontables de Robo1 la expresión de genes de RNAi tuvo un efecto en la reducción de invasión de células tumorales similar a la de la restauración de miR-218, aunque Robo1 desmontables solo demostró un efecto débil. Esto podría deberse a que Robo1 no es el único objetivo de miR-218 que es relevante para la metástasis tumoral. Estos resultados indican que el efecto de supresión de la invasión de miR-218 está al menos parcialmente mediada por una disminución en la expresión Robo1. Este es también el primer estudio para mostrar que el Robo1 gen asociado a un tumor se regula negativamente por miR-218 a través de un sitio diana específico (nt 971 a 978) dentro de la 3'-UTR. El receptor Robo1 es crucial para la respuesta a señales extracelulares y los cambios fenotípicos celulares; Por lo tanto, la regulación estricta del receptor Robo1 por el miR-218 puede facilitar más robusto transducción de señales. anticuerpo monoclonal Anti-Robo1 se ha informado a ser un tratamiento eficaz para los cánceres que expresan ROBO1 [30], [33]. En el presente estudio, hemos encontrado un nuevo inhibidor de la Robo1, miR-218, que potencialmente puede ser utilizado para tratar algunos tipos de cáncer.

Como se mencionó anteriormente, Slit1, Slit2, y SLIT3 comprenden la familia de hendidura de proteínas. Aunque los genes se solapan, sus patrones de expresión y las funciones son diferentes. Se sabe que los antiguos dos proteínas estar involucrado en la guía axonal y la migración de células [37], [74], mientras que SLIT3 está involucrado en el desarrollo de los órganos y sistemas de órganos, incluyendo el diafragma y el riñón [75]. De acuerdo con estos datos, se encontró que Slit2, pero no SLIT3, interactuó con Robo1 para promover la invasión GC.

Además, hemos demostrado que los miR-218 de codificación de genes se encuentran en y transcritas junto con genes de hendidura , que eran ligandos ROBO1, creando así un bucle de retroalimentación negativa que regula la señalización de hendidura /Robo1. Sailen Barik demostró que un miARN intrónica, miR-338, los genes que son funcionalmente antagónico a su producto génico de acogida silenciada, creando así un bucle de retroalimentación positiva que ayuda a la función fisiológica del gen de acogida [76].

• PLOS ONE: Expresión vascular CXCR4 - un nuevo blanco antiangiogénico en cáncer gástrico
• PLOS ONE: El silenciamiento de Claudín-11 se asocia con mayor invasividad de las células de cáncer gástrico