PLoS Genetics: MiR-218 Estää ja metastaasit mahasyövän kohdistamalla ROBO1 Reseptori

tiivistelmä

MikroRNA avainasemassa tuumorimetastaasissa. Tässä kuvaamme sääntelyä ja toiminta miR-218 mahasyövän (GC) etäpesäke. miR-218 ilmentyminen on vähentynyt sekä ilmentymisen yksi sen isännän geenejä, Slit3 metastaaseja GC. Kuitenkin ROBO1, yksi monista viiltämällä reseptorien, säätelee negatiivisesti miR-218, jolloin syntyy negatiivinen kierre. Vähentynyt miR-218 tasoilla poistaa ROBO1 tukahduttaminen, joka aktivoi Laserin-ROBO1 reitti läpi vuorovaikutusta ROBO1 ja Slit2, mikä puolestaan ​​johtaa kasvaimen etäpesäke. Palauttaminen miR-218 estää ROBO1 ilmaisun ja estää kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden in vitro
ja in vivo
. Yhdessä tuloksemme kuvaavat viiltämällä-miR-218-ROBO1 sääntelyn piiriin joiden häiriöt saattavat edistää GC etäpesäkkeitä. Targeting miR-218 voi tarjota strategia estää kasvainmetastaasit.

Author Yhteenveto

MikroRNA on todettu tärkeässä osassa tuumorimetastaasissa, mutta niiden vaikutus GC etäpesäkkeitä on huonosti tutkittu. Olemme havainneet miR-218, joka toimii vaimentimen kasvaimen etäpesäke ja korreloi kliiniseen vaiheeseen, imusolmukkeiden etäpesäkkeiden, ja ennusteen potilailla, joilla on GC. Tuloksemme osoittavat, että miR-218 on osa sääntelyn piirin, johon Laserin-ROBO1 reitin. Metastaattisen kasvainsoluja, miR-218 tukahtui yhdessä Slit3, yksi sen isännän geenejä. Samaan aikaan ROBO1, yksi monista viiltämällä reseptorien määrä lisääntyy vastauksena väheneminen miR-218, joka puolestaan ​​indusoi reaktiivista ylössäätely Laserin-ROBO1 reitin kautta vuorovaikutuksessa Slit2, mikä helpottaa kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota. Tällaiset havainnot eivät ainoastaan ​​tarjoa uusia oivalluksia metastaattisen mekanismien GC mutta myös näyttöä uudenlainen miRNA-välitteinen sääntelyyn tilassa reseptorin signalointi.

Citation: Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et ai. (2010) MiR-218 Estää ja metastaasit mahasyövän kohdistamalla ROBO1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000879

Editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2009; Hyväksytty: 10 helmikuu 2010; Julkaistu: 12 maaliskuu 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30670970, No. 30873026, No. 30672369, nro 30530780) ja National Basic Research Program of China (No.2010CB529300). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

edistysaskeleet diagnostisia ja hoitomenetelmiä ovat johtaneet erinomaisen odotukset pitkän aikavälin selviytymisen aikaisin mahalaukun syöpä (GC). Kuitenkin ennuste kehittynyt GC laajat invaasiota ja etäpesäkkeiden edelleen huono [1]. Jotta etäispesäkkeitä, kasvainsolujen saa läpäistä sarja peräkkäisiä ja selektiivinen tapahtumia, kuten irtoaminen, maahanmuutto, paikallinen invaasio, angiogeneesi, intravasation, selviytyminen verenkiertoelimistön, ekstravasaatio, ja regrowth eri elimissä. Vuonna metastaattinen cascade, hyökkäys GC ympäröivään kudokseen on ratkaiseva varhaisen vaiheen [2] - [4]. Kuitenkin mekanismit invaasion ei ole vielä täysin selvitetty.

Suuri määrä microribonucleic happojen (MikroRNA tai miRNA) on äskettäin liitetty syövän etäpesäkkeiden [5], mukaan lukien miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520c, ja miR-205 rintasyövässä [6] - [11]; miR-224 ja miR-21 eturauhassyövässä [12], [13]; miR-29c nenänielun karsinoomat [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7, ja miR-452 urothelial karsinoomia [15]; miR-182 in melanooma [16]; miR-92b ja miR-9/9 * in aivokasvaimia [17]; ja miR-21 kolorektaalisyövässä [18]. Kuitenkin vain harvat miRNA tiedetään olevan osallisena GC etäpesäkkeitä on raportoitu. miRNA ovat luonnossa esiintyviä, lyhyt, ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka negatiivisesti säädellä geeniekspressiota [19]. Nisäkkäillä, kypsä miRNA syntyvät pri-miRNA ja pre-miRNA kautta juokseva käsittely Drosha ja Dicer ja ovat monissa organismeissa. Ne koostuvat 21-24 nukleotidin, integroida RNA-asiakkuutta hiljentämisen komplekseja, ja pariutumaan 3'alueet (3'-UTR) erityisten kohde- RNA: iden (mRNA: t) tukahduttaa käännös tai aiheuttaa hajoamista kohde mRNA: iden [20 ]. Kehittyvät tulokset ovat osoittaneet, että miRNA avainasemassa erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, stressinsietokyky, rasva-aineenvaihdunta, kasvaimen kehittymisen, ja etäpesäkkeiden [21] - [23]. Parempi ymmärrys muutosten miRNA ilmaisun aikana GC invaasion voi johtaa ymmärtämään paremmin GC kehitystä sekä mahdollisia parannuksia diagnosointiin ja hoitoon kehittynyt GC.

Tässä tutkimuksessa, loimme korkea (MKN28-M ja SGC7901-M) ja alhainen invasiivisia solujen alilinjat (MKN28-NM ja SGC7901-NM) käyttäen toistuvan siirtokuoppaan määritys in vitro
. Sitten tutkittiin maailmanlaajuisen miRNA ilmaisun profiilin jokaisessa solussa alilinja käyttäen miRNA microarray tunnistaa ilmentyvät eri miRNA liittyen ihmisten GC hyökkäystä. Kaikkiaan 45 miRNA osoitettiin ilmentyä erilailla invasiivisia vs. ei-invasiivisen GC-soluja. Näistä miR-218, joka on merkittävästi vaimentua miRNA erittäin invasiivisia soluja, osoitettiin läheisesti korreloivan GC kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden potilailla. Viime aikoina, lasku miR-218 on raportoitu useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä, GC, keuhkosyöpä, ja kohdunkaulan karsinooman [24] - [27], mutta tämä väheneminen miRNA-218 on yksinkertaisesti seulottiin pois sillä on yksi kymmeniä mahdollisia miRNA kiinnostusta syöpien kuvattu edellä. Ei vielä ole tehty sen merkityksen arvioimiseksi miR-218 tuumorimetastaasissa. Tässä olemme havainneet, että vähentynyt miR-218 ilmentyminen korreloi kehittynyt kliiniseen vaiheeseen, imusolmuke etäpesäke, ja huonon ennusteen potilailla, ja uudelleen ilmentäminen miR-218 metastasoitunutta soluissa kykeni estämään muuttoliikettä, invaasiota ja etäpesäkkeiden muodostumista molemmat in vitro
ja in vivo
. Käyttämällä bioinformatiikka etsiä miR-218 tavoitteita, me poimi reseptorin ROBO1 kuin miR-218: n toiminnallinen tavoite, ja varmistimme, että vuorovaikutus miR-218 ja ROBO1 oli ratkaisevaa GC soluliikkuvuus osoittaakseen, että oli käänteinen korrelaatio miR -218 ja ROBO1 GC solulinjoissa sekä GC potilailla. Lisäksi olemme havainneet, kiehtova negatiivinen silmukka, johon viiltämällä, miR-218, ja ROBO1, jossa miR-218 voi olla peräisin joko kaksi geeniä sijaitsevat intronit kaksi erillistä jäsentä Laserin proteiinin perheen. Lisäksi tämän perheen jäseniä ovat ligandeja ROBO1 reseptorin. Olemme osoittaneet, että ilmaus kahden miRNA esiaste geenejä (miR-218-1 ja miR-218-2) korreloi ilmentymistä isäntägeenejä (Slit2 ja Slit3, vastaavasti) ja että kypsä miR-218 oli peräisin pääasiassa miR -218-2 esiaste, jossa on samanaikainen vähentäminen vastaanottavan Slit3 mutta ei Slit2 metastaattisessa GC-soluissa. Siten säätelyä ROBO1 vastauksena väheneminen miR-218 indusoi reaktiivinen ylössäätely Laserin-ROBO1 reitin kautta sen vaikutuksen Slit2, mikä helpottaa kasvainsolujen invaasion ja metastaasin. Meidän havainnot eivät ainoastaan ​​tarjoa uusia oivalluksia metastaattisen mekanismeja GC, mutta ne myös paljasti uutta sääntelyä mekanismi reseptorin signalointi.

Tulokset

perustaminen ja luonnehdinta solun alilinjat eri invasiivisen ja metastaattisen potentiaalit

Muodosta GC etäpesäke malleja, loimme invasiivisia ja ei-invasiivisia solu alalinjoja ihmisen GC solulinjoissa SGC7901 ja MKN28 käyttämällä toistuvia transwell lähestymistapa (kuvio 1A, katso materiaalit ja menetelmät). Lyhyesti, toistuva invaasiomääritys suoritettiin, ja ne solut, jotka eivät hyökätä kalvot ja solut, jotka oli kyky kulkeutua kollageenipäällysteisiin kalvo kaikissa valintakierroksen erotettiin. Kymmenen valintakierroksen saimme invasiivisia (MKN28-M ja SGC7901-M) ja ei-invasiivisia solujen alalinjoja (MKN28-NM ja SGC7901-NM). Metastaattista ominaisuuksia kunkin solun alalinjan sitten ominaista in vitro
ja in vivo
. Kuten kuviossa 1B ja 1C, muuttoliike kyky MKN28-M-soluissa oli noin 4 kertaa suurempi kuin MKN28-NM soluissa. Samoin invasiivisia potentiaali oli noin 5 kertaa suurempi MKN28-M-soluissa verrattuna MKN28-NM soluissa. in vivo
tutkimuksissa, kasvainsolujen etäpesäkkeitä havaittiin nude-hiirissä. Kuten kuviossa 1D ja 1E, lähes metastaattinen GC-soluja havaittiin keuhkoissa tai maksa nude-hiiriin 10 viikkoa injektion jälkeen MKN28-NM-soluja, kun taas suurin osa hiiriä, joihin injektoitiin MKN28-M-solut ilmeiseen keuhkojen tai maksan etäpesäkkeitä. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin SGC7901-M ja SGC7901-NM-soluja (tietoja ei esitetty). Mitään merkittäviä eroja solujen lisääntymisen tai solusyklin jakautuminen havaittiin näiden joukosta solu alilinjat (Text S1, kuviot S1 ja S2).

tunnistaminen etäpesäkkeiden liittyvien miRNA by array-pohjainen hybridisaatio

tunnistaa miRNA mahdollisesti mukana GC invaasio, tutkimme globaali miRNA ilmentymistä jokaisessa solussa alilinja käyttäen microRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Tanska), joka koostuu 847 sieppauskoettimien ihmisen kypsää miRNA. Microarray tulokset osoittivat, että ilmentyminen 124 miRNA vaihteli huomattavasti erittäin invasiivisia muunnos MKN28-M ja ei-invasiivisia cell alalinja MKN28-NM. Näistä 83 oli upregulated ja 41 olivat vaimentua. Verrattuna SGC7901-NM, 62 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut SGC7901-M-solun alalinja, mukaan lukien 47 vaimentua ja 15 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA. Kaikkiaan 11 miRNA havaittiin voimistuvan ja 34 miRNA oli vaimentua sekä MKN28-M ja SGC7901-M-soluja verrattuna vastaavaan ei-invasiivisia alalinjoja (taulukko S1).

45 differentiaalisesti säännelty miRNA, miR-218 oli yksi niistä, jotka osoittivat merkittävästi differentiaalikaavojen. miR-218 on raportoitu vaimentua kohdunkaulan syövän [25], GC [26], keuhkosyöpä [27] ja eturauhassyövän [28], mikä viittaa mahdolliseen osallistumiseen sekä onkogeeninen transformaatio ja kasvainmetastaasin. Kuitenkin miRNA-218 oli vain yksi monista mahdollisista miRNA kiinnostusta syöpiä. Tässä työssä miR-218 on tutkittu paljon yksityiskohtaisemmin. Validoida microarray tuloksia, arvioimme miR-218 ilmentymistä GC solussa alilinjat aiemmin mainittu ja kuolematon mahalaukun epiteelisolujen linja GES käyttämällä qRT-PCR [29]. miR-218-ekspressio väheni merkitsevästi MKN28-M ja SGC7901-M-soluissa ja oli pienempi kaikissa neljässä GC solujen alalinjoja verrattuna kuolemattomiksi ihmisen mahalaukun epiteeli- GES solut (kuvio 2A). Lisäksi vertasimme miR-218 ilmentymisen ensisijaisen GC kasvain vs. metastaattinen imusolmukkeiden 10 potilailla, joilla on vaiheen III /IV GC käyttäen qRT-PCR. Kuten kuvassa 2B, kypsä miR-218-tasot olivat merkitsevästi vähentyneet 7 10 metastaattisen imusolmukkeiden, mikä osoittaa, että miR-218 voi olla syy rooli GC etäpesäkkeitä.

Vähentynyt miR-218 ilmentyminen GC liittyi kehittynyt kliiniseen vaiheeseen, imusolmuke etäpesäke, ja huono potilaan ennusteeseen

Voit selvittää mahdolliset kliinis vaikutuksia muuttunut miR-218 ilmaisua, tutkimme ekspressiotasot miR-218 40 GC kudoksissa (T) ja ei-kasvain limakalvon (N) by qRT-PCR. Termi -ΔCt on käytetty kuvaamaan ekspressiotaso miR-218. Yhdenmukainen nämä tiedot tulokset varmisti, että miR-218 ekspressiotaso GC (-13,81 ± 0,15, keskiarvo ± SE) kudoksiin oli merkittävästi pienempi kuin ei-neoplastisten limakalvon (-11,62 ± 0,15, keskiarvo ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, pariksi t
-testi) (kuvio 3A). Korrelaatiot miR-218 ekspressiotaso ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia GC on esitetty taulukossa 1. Tilastollisesti merkitseviä välillä miR-218 ekspressiotaso ja kliinisessä vaiheessa ja välillä miR-218 ekspressiotaso ja GC etäpesäkkeiden havaittiin tässä tutkimuksessa. Mediaani ilmentyminen miR-218 oli -14,25 ± 0,17 22 tapauksissa pitkälle (vaihe III ja IV) sairaus, kun taas mediaani ilmaisu oli -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney testi) on 18 tapauksissa alkuvaiheen (vaiheet I ja II) tauti. Vuonna 29 tapauksessa GC kanssa imusolmuke etäpesäke, mediaani ilmaus miR-218 oli -14,09 ± 0,16, mikä oli huomattavasti pienempi kuin mediaani lauseke (-13,07 ± 0,24) on 11 ei-metastasoituneen GC tapauksissa ( P
= 0,0036). Ekspression miR-218 GC potilailla ei korreloinut ikä, sukupuoli, kasvaimen koko tai solujen erilaistumista. Lisäksi tutkimme, onko taso miR-218 ilmentyminen liittyi eloonjäämisen potilailla GC. Potilaat sittemmin jaettu heikkoa ilmentymistä (n = 20), ja korkea ekspressio ryhmät (n = 20), joka perustuu miR-218 tasoa suurempi tai pienempi kuin keskimääräinen (-13,81) (kuvio 3B). Kaplan-Meier selviytymisen analyysit paljastivat, että potilailla, joiden ensisijainen kasvaimet näkyvät alhainen ilmentyminen miR-218 oli lyhyempi keskimääräinen eloonjäämisaika. Kolmen vuoden eloonjäämisaste potilaiden, joilla on alhainen miR-218 ilmentyminen oli 30%, mikä oli huomattavasti alhaisempi kuin eloonjäämisaste potilailla, joilla on korkea miR-218 lauseke (65%; P
= 0,0012, log rank-testi, kuvio 3C).

ektooppinen ilmentyminen miR-218 esti kasvainsolujen invaasion ja etäpesäkkeen in vitro
ja in vivo

tutkia rooli miR-218 GC etäpesäkkeitä, MKN28-M-solut transfektoitiin pGenesil-1-miR-218 tai kontrollina ilmentävä vektori epäspesifistä miRNA, cel-miR-67, käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Sitten solut valitaan 400 mg /l G418: aa tuottaa MKN28-M-miR-218 ja MKN28-M-miR-ohjaus stabiili soluissa. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-218 johti noin kolminkertaiseksi väheneminen muuttoliikettä ja invasiivisuus. Voit selvittää, onko menetys miR-218 edistäisi siirtymistä tai invaasion syöpäsolujen, me vaiennetaan miR-218 antisenseoligonukleotidi estäjän MKN28-NM solulinja, jolloin kolmen tai neljän-kertainen solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus (kuvio 4A ja 4B). Testata, jos tuumorin invaasiota miR-218 johtuu heikentäen invasiivinen kyky kasvainsolujen, me ulkopuolelle vaikutus miR-218 proliferaatioon ja solusyklin jakautumisen mahalaukun syövän soluja. Yli-ilmentyminen miR-218 ei vaikuttanut leviämisen ja solusyklin jakautumista MKN28-M-solut in vitro
(kuvio S5a ja S5d). Jotta voitaisiin edelleen tutkia inhibitio in vivo
kasvaimen etäpesäke mukaan miR-218, me istutetaan MKN28-M-miR-218-soluja, jotka oli stabiilisti ilmentävät miR-218 tai kontrolli-soluja nude-hiirissä siten, että sivusuunnassa häntälaskimoon. Keuhkojen ja maksan etäpesäke GC näkyi hiirillä ruiskutetaan MKN28-M-miR-ohjaus soluissa. Sen sijaan, muutaman etäpesäkkeitä havaittiin hiiriä, joihin injektoitiin MKN28-M-miR-218-soluja (kuvio 4C). Lisäksi olemme samanaikaisesti havaittiin kasvun primäärikasvaimissa ja ilmaantuvuus etäpesäkkeiden nude-hiirissä injektoitiin subkutaanisesti MKN28-M-miR-218-solut tai kontrollisolut. Tulokset osoittivat keuhkojen tai maksan etäpesäke näkyi 3 10 injektoidut hiiret MKN28-M-miR-ohjaus soluissa; jyrkässä ristiriidassa, ei etäpesäke havaittiin hiirillä ruiskutetaan MKN28-M-miR-218-solut (kuvio S5E). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​saatuja tietoja häntälaskimosta määrityksiä, jotka arvioivat syöpäsolujen leviämiseen ja osoittavat, että miR-218 on kyky tukahduttaa etäpesäkkeiden vaikuttamatta solujen lisääntymisen.

ROBO1 oli välitön toiminnallinen tavoite miR-218 GC etäpesäke

arvioida miten alhainen miR-218 lauseke edistää hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden GC, etsittiin mahdollisten sääntelyn tavoitteiden miR-218 käyttäen ennustelaitteet, myös Miranda PicTar, ja TargetScan. Vaikka satoja erilaisia ​​tavoitteita ennustettiin, ne osallistuvat geenit kulkeutumista tai invaasio saattaa olla asianomaisen tavoitteet suhteessa biologisiin toimintoihin miR-218. Suoritimme sitten toiminnallinen luokitus ennustetun tavoitteet käyttäen DAVID ohjelmaa (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Näistä geeneistä, ROBO1 pidetään esikasvaintekijän ja satamien muuttoliike edistävää toimintaa [30] - [35]. Mertsch et al.
Osoittaneet ROBO1 helpottaa glioomasolulinjaa muuttoliikettä välittyy Slit2 [36]. Schmid et al.
Havaittu, että rintatuumorista migraatiota indusoi Slit2-ROBO1 vuorovaikutus in vitro
[37]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ROBO1 voi olla kohde miR-218. Edelleen testata hypoteesia, olemme analysoineet ilmentymisen miR-218 ja ROBO1 in GES ja ei-invasiivisia (MKN28-NM ja SGC7901-NM) ja invasiivisia (MKN28-M ja SGC7901-M) GC soluja. Tulokset osoittivat negatiivista korrelaatiota välisiä miR-218 ja ROBO1 mRNA näissä soluissa (kuvio S3A). Lisäksi havaitsimme, että ROBO1 mRNA (kuva S3B) ja proteiini (kuvio 5B2) tasot laskivat, kun miR-218 ilmaistiin pGenesil-1-miR-218 MKN28-M-soluissa (kuvio 5B1). Päinvastainen tarkkailtiin ROBO1 ilme, kun miR-218, joka pudotettiin vuonna MKN28-NM-solut (kuvio 5C1 ja Kuva 5C2). Käänteinen suhde miR-218 ja ROBO1 ilmentyminen varmistettiin lisäksi immunohistokemiallinen (Teksti S1) 40 tapauksessa mahalaukun syövän, in Hyväksytty viereisten normaaleissa kudoksissa, että käytettiin myös kliinis tutkimuksiin ja 29 Hyväksytty etäpesäkkeitä. Tulokset osoittavat, että ROBO1 oli yläreguloituja GC, etenkin metastaattisen GC (kuvio S4), jossa miR-218 on suhteellisen alhainen ilme.

Voit hankkia uusia suoria todisteita siitä, että ROBO1 on tavoite miR-218 olemme tutkineet sitoutumiskohdan miR-218 3'-UTR ROBO1 mRNA: ta (kuvio 5A). Rakensimme lusiferaasireportteri- (Luc-ROBO1), jossa nukleotidit ROBO1 3'-UTR komplementaarinen miR-218 (nt 971-978) insertoitiin pMIR-REPORT miRNA ilmentymisen toimittaja vektori [38]. Vastaavasti myös syntyy sekä mutantti reportteri (Luc-ROBO1-mu), jossa ensimmäisen kuuden nukleotidin miR-218 siemen-alue täydentävien alueiden poistettiin, ja ohjaus reportteri, joka sisälsi ei-liittyvä fragmentti cDNA (Luc-Ctrl). miR-218-ilmentymisplasmideja kotransfektoitiin Luc-ROBO1, Luc-ROBO1-MU, tai Luc-Ctrl osaksi MKN28-M-soluissa. Analyysit osoittivat, että lusiferaasin aktiivisuus Luc-ROBO1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi vähentynyt verrattuna lusiferaasiaktiivisuuden mutantti ja negatiivisen kontrollin soluissa ( P
< 0,05), viitaten siihen, että miR-218 vähensi lusiferaasiaktiivisuus Luc-ROBO1 mutta ei ollut vaikutusta Luc-ROBO1-mU (kuvio 5D). Siksi päädyimme siihen, että lisätään fragmentti ROBO1 (nt 971 -
978) oli kohteena miR-218.

ROBO1 on osoitettu olevan yli-ilmentynyt syöpäsoluissa ja on tiedetään edistävän kasvaimen angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden kautta vuorovaikutuksen viiltämällä [39], [40]. Testata, onko ROBO1 on toiminnallisesti säätelee miR-218, olemme tuottaneet ROBO1 ekspressiorakenne, joka sisältää vain fragmentin ennustettu miR-218 sitoutumiskohdan ja ROBO1 mutantti ekspressiovektori puuttuvat kokonaan 3'-UTR. Olemme myös tehneet ROBO1 siRNA. MKN28-M-miR-218-soluja, jotka pysyvästi ilmensivät miR-218 ektooppisesti, transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa ROBO1 konstrukti tai mutantti-rakenne (ei miR-218 sitoutumiskohta), ja MKN28-M-solut transfektoitiin ROBO1 siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. MKN28-M-miR-218-solut, jotka oli transfektoitu ROBO1 mutantti-rakenne osoitti 3,8-kertaisen lisäyksen invaasio kyky verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ROBO1 konstruktilla. Nämä tulokset osoittavat, että käyttöönotto mutantti ROBO1 cDNA, josta puuttui miR-218 sitoutumiskohta osaksi miR-218-yli-ilmentävät solut päinvastainen vaikutus miR-218-välitteisen suppression soluinvaasion. Kuitenkin vaikutus ROBO1 on tukahduttaa miR-218 läsnä ollessa ROBO1 3'-UTR sisälsi miR-218 sitoutumiskohtia. Knockdovvn ROBO1 siRNA in MKN28-M-soluissa esti soluinvaasiota, joka laski tasolle samanlaisia ​​kuin transfektion jälkeen MIR-218-ilmentävällä vektorilla (kuvio 5E ja 5F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-218 suoraan estää ROBO1 välittämiä solun invaasiota.

Slit2, mutta ei Slit3, voivat olla vuorovaikutuksessa ROBO1, rikastuttanut puuttuminen miR-218, edistää GC hyökkäystä

kahdenlaista miRNA olemassa: geenien välinen ja introni. Entinen sijaitsevat ei-koodaavat geenien välillä, ja niitä vastaavat pri-miRNA yleensä transkriboidaan omasta promoottorit RNA polymeraasi II. Jälkimmäiset sijaitsevat intronit isäntägeenejä, ja niiden biogeneesin ohjataan isäntä geenin promoottorit [41], [42]. miR-218 on introni- miRNA. Kaksi geeniä koodi kypsän miR-218, miR-218-1 ja miR-218-2, jotka sijaitsevat intronin 15 Slit2 ja intronin 14 Slit3, vastaavasti (kuva 6A). Introniset sijainti kahden miR-218-geenien sai meidät kysyä miR-218-1 ja miR-218-2 transkriboidaan yhdessä vastaanottavan geenin mRNA: iden. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme qRT-PCR tutkia ilmentymisen miR-218-1 esiaste, MIR-218-2 esiaste, kypsä miR-218, Slit2 mRNA, ja Slit3 mRNA: n GC kudoksissa käytetään eloonjäämisen analyysi. Tilastollinen analyysi korrelaatiokerroin qRT-PCR tulokset osoittivat merkittävä positiivinen korrelaatio tasojen Slit2 mRNA ja miR-218-1, ja tasojen välillä Slit3 mRNA ja miR-218-2 (kuvio 6B ja 6C). Nämä tulokset osoittavat, että miR-218 koodaus geenit, miR-218-1 ja miR-218-2, kopioidaan yhdessä niiden isäntägeenejä, Slit2 ja Slit3, vastaavasti. Merkittävä positiivinen korrelaatio välisiä miR-218 ja miR-218-2 (kuvio 6D) nähtiin GC; kuitenkaan ei tällaista korrelaatiota ei nähty välisiä miR-218 ja miR-218-1 (kuvio 6E). Nämä tulokset osoittavat, että downregulation miR-218 GC edistetään väheneminen miR-218-2, mutta ei miR-218-1. Tätä päätelmää, Slit3 ilmentyminen väheni merkittävästi GC (-22,43 ± 0,21, keskiarvo ± SE) verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksesta (-20,79 ± 0,23, keskiarvo ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, pariksi t
-testi) (kuvio 6F), kun taas Slit2 ilme ei ollut merkitsevää eroa ( P
= 0,0772, pariksi t
-testi) ( Kuva 6G). Yhteenvetona meidän kokeellisia tulokset viittaavat siihen, että merkittävä ylössäätely ROBO1 geenin vastauksena poistamiseen miR-218 voi aiheuttaa myöhemmin ylössäätely Laserin-ROBO1 reitin kautta vuorovaikutuksessa Slit2, helpottaa kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota.

keskustelu

tutkia sairaus, on tärkeää rakentaa ihanteellinen malli. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme eristetty invasiivisia ja ei-invasiivisia solualapopulaatioiden vakiintuneista ihmisen GC solulinjoissa käyttämällä toistuvia siirtokuoppaan lähestymistapaa, jota on onnistuneesti sovellettu monissa tutkimuksissa tutkinnassa tuumorietäpesäke [43] - [48]. Tulokset metastaattisen tarkastelun in vitro
ja in vivo
osoitti, että vakiintuneista solu- alilinjat oli selvä invasiivisen ja metastaattisen valmiuksia. Täällä me seulotaan paitsi solu alilinjat peräisin GC solulinjoista korkean invasiivisia potentiaalin, mutta myös heikosti-invasiivisen potentiaali. Lukuun ottamatta metastasoituneeseen kykyjä, valittu solu alilinjat olivat molemmat melko samanlaisia, koska niillä on sama geneettinen tausta. Koska merkittävä ero näiden kahden alilinjat on metastaattinen kyky, geenit, jotka eroavat niiden välillä pitäisi korreloivat hyvin etäpesäkkeitä. Lisäksi meidän menetelmä pystyy erottamaan invaasion vaiheittain etäpesäke ja mahdollistaa tutkimuksen erityisiä vaiheita etäpesäkkeitä, joita ei voida arvioida live-eläinmallissa.

Äskettäin miRNA on raportoitu edistämiseksi [49] , [50] tai tukahduttaa [51] - [54] tuumorimetastaasit, joka tarjoaa uuden näkökulman metastaattinen prosessi. Kuitenkin rooli miRNA GC etäpesäke puuttuu. Tässä raportissa, selvitimme ja saatiin ensimmäistä kertaa 45 etäpesäke liittyviä miRNA GC perustuu vakiintunut etäpesäke solumallin. Havainto, että miR-218 säädeltiin vähentävästi metastaattisessa GC on kiehtova, koska vähentynyt miR-218 tasoja on raportoitu useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [24] - [27], [55], mikä osoittaa, että menetys miR-218 voi oltava yhteinen tapahtuma kasvaimien syntyyn. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet vaikutusta miR-218 GC etäpesäkkeitä ja osoittivat, että miR-218 toimii tuumorisuppressori GC etäpesäkkeitä. Palauttaminen miR-218 vähensi solumigraation ja invaasiota in vitro
ja tuumorietäpesäke in vivo
. Saadakseen stabiileja solulinjoja, että yli-ilmentynyt miR-218, transfektoimme MKN28-M solujen miR-218 plasmidit ja seulottiin G418. Valitsimme kaksitoista solun siirtomaiden miR-218-transfektoiduissa ryhmä ja löysi 10 ulos 12 pesäkettä näytteillä hämmästyttävän samanlaiset, vakaa ja korkean tason ilmentymisen miR-218. Lisäksi kolme satunnaisesti valittua monoklonaalisia solulinjoja näytteillä samanlainen väheneminen invasiivisia ablility. Kuitenkin plasmidin strategioihin usein johtaa alhaisempiin integraation hyötysuhde kuin viruksen ekspressio johtaa mahdollisuuteen stokastisen valinta harvinaisten toiminnallisesti heterogeeninen variantteja alkuperäisestä suurin väestöstä. Siksi tulevaa käyttöä virusilmentämisjärjestelmät tulisi luoda entistä puolueeton lähtöpopulaationa testata hypoteesia.

Osana tutkimusta siitä, miten menetys miR-218 vaikuttaa GC etäpesäke, osoitimme, että ROBO1 oli kriittinen alavirtaan tavoite miR-218. On tunnettua, että Robo on aksoniohjauksen reseptoria viiltämällä ja säilyy eläimissä vaihtelevat hedelmäkärpästutkimus nisäkkäisiin. Nisäkkäillä kolme viiltämällä (Slit1-3) ja neljä Robo (Robo1-4) geenejä on kuvattu [56], [57]. Rako-Robo vuorovaikutukset välittävät signaaleja välittävä vastenmielinen vihjeiden päälle axons ja kasvukartioilla aikana hermoston kehittymistä ja osallistumaan T-solujen ja monosyyttien kemotaksista [58] - [64]. Kuten muidenkin kehitykseen reittejä, poikkeava ilmentyminen Laserin -
Robo geenejä on havaittu erilaisissa kasvaintyypeissä [65] - [68]. Esimerkiksi rintasyöpä kudosnäytteistä, ROBO1 on osoitettu olevan yli-ilmentynyt, ja se on osoitettu indusoivan migraation rintasyövän solulinjat [37]. Slit2-ROBO1 signalointi helpottaa glioomasolulinjaa muuttoliike [36] ja osallistuu angiogeneesiin lisäämällä mikroverisuonitiheys ja tuumorimassaa -tuumoriksenografti malli [30]. Wang et al.
Osoittivat, että yli-ilmentyminen ROBO1 uusien verisuonten kasvaimissa aiheuttaa syöpää, uudissuonittuminen ja kasvun kautta vuorovaikutusta ROBO1 ja sen ligandin, Slit2. Se on myös havainnut fosfoinositidi-3-kinaasi (PI-3K) kuin alavirtavaikuttajainhibiittorit Slit2 /ROBO1 signalointi. Tämä viittaa siihen, että on olemassa viiltämällä-ROBO1-PI-3K cascade, joka voisi johtaa sukupolven phosphoinositol-3,4,5-trifosfaatti ja myöhemmin aktivoinnin pieniä GTPaaseja, jotka välittävät solujen liikkumista ja remontin aktiinisytoskeletonin [30] , [35]. Sen sijaan muut tutkimukset ovat väittäneet, että downregulation ROBO1 aiheuttamat poistot tai epigeneettisellä muutokset voivat olla rooli syövän etenemistä [69] - [73]. Ehdotamme, että kudosspesifisiä ekspressiokuviota olemassa Laserin-Robo geenejä.

Nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että ROBO1 usein ilmentyy korkeilla tasoilla invasiivisia soluissa ja alhaisilla tasoilla ei-invasiivisia soluja , kun taas miR-218 näkyy päinvastainen ilme kuvio. Kun transfektoitiin miR-218-ekspressiovektoriin ja estämällä oligonukleotidit MKN28-M ja MKN28-NM-soluissa, vastaavasti, käänteinen ilmentymiskuvio välillä havaittiin miR-218 ja ROBO1, eli jos miR-218 ilmentyminen oli korkea, ROBO1 ilme oli alhainen ja päinvastoin. Tämä tulos vahvistettiin lisäksi kliinisissä näytteissä ja lusiferaasiaktiivisuudessa määrityksissä. Olemme myös huomanneet, että induktio ilmentymisen ROBO1 jonka ROBO1 mutantti konstruktio ilman miR-218 sitoutumiskohta voi kääntää miR-218-välitteisen suppression kasvainsolun invaasiota. Sen sijaan knockdovvn ROBO1 geeniekspression RNAi ollut vaikutusta vähentämiseen kasvainsolun invaasiota samanlainen kuin palauttaminen miR-218, vaikka ROBO1 knockdown yksin osoitti heikko vaikutus. Tämä voi johtua siitä ROBO1 ei ole ainoa kohde miR-218, jolla on merkitystä kasvaimen etäpesäkkeiden. Nämä havainnot osoittavat, että hyökkäys suppression vaikutusta miR-218 on ainakin osittain välittyy lasku ROBO1 ilmaisua. Tämä on myös ensimmäinen tutkimus osoittaa, että kasvaimeen liittyvän geenin ROBO1 säätelee negatiivisesti miR-218 kautta tiettyyn kohdepaikkaan (nt 971-978) sisällä 3'-UTR. ROBO1 reseptori on ratkaiseva vaste solunulkoiseen signaaleja ja solujen fenotyyppiset muutokset; siksi, tiukka sääntely ROBO1 reseptorin miR-218 voivat helpottaa vakaampi signaalitransduktion. Anti-ROBO1 monoklonaalinen vasta-aine on raportoitu olevan tehokas hoito ROBO1 ilmentävien syöpien [30], [33]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme löytäneet uuden estäjä ROBO1, miR-218, joka voidaan mahdollisesti käyttää hoitoon joidenkin syöpien.

Kuten edellä on mainittu, Slit1, Slit2, ja Slit3 käsittävät Laserin perheen proteiineja. Vaikka geenit menevät päällekkäin, niiden ilmaisua malleja ja toiminnot ovat erillisiä. Entinen kaksi proteiinien tiedetään olevan osallisena aksoniohjauksen ja solumigraatio [37], [74], kun taas Slit3 on mukana kehittämässä elinten ja elinjärjestelmien, kuten kalvon ja munuaisten [75]. Suostumuksella nämä tiedot, huomasimme, että Slit2, mutta ei Slit3, vuorovaikutuksessa ROBO1 edistämiseksi GC hyökkäystä.

Lisäksi osoitimme, että miR-218 koodaavat geenit sijaitsevat ja transkriboidaan yhdessä viiltämällä geenien , jotka olivat ROBO1 ligandeja, mikä luo negatiivista palautetta silmukka, joka säätelee viiltämällä /ROBO1 signalointi. Sailen Barik osoitti, että introni- miRNA, miR-338, vaiennetaan geenejä, jotka ovat toiminnallisesti antagonistisia sen isäntä geenituote, mikä luo positiivista palautetta silmukka, joka auttaa fysiologinen rooli isännän geenistä [76].

• PLoS ONE: Vascular CXCR4 Expression - Novel antiangiogeenisesti Target mahasyövän?
• PLoS ONE: vaiennettu Claudin-11 liittyy lisääntynyt invasiivisuus mahasyövän Cells