PLOS Genetics: miR-218 inhibitions Invasion et métastase du cancer gastrique en ciblant les Robo1 Receptor

Résumé

Les microARN jouent un rôle clé dans la métastase de la tumeur. Ici, nous décrivons la régulation et la fonction de miR-218 dans le cancer gastrique (GC) métastase. l'expression de miR-218 diminue en même temps que l'expression de l'un de ses gènes de l'hôte, Slit3 en GC métastatique. Cependant, Robo1, l'un de plusieurs récepteurs Slit, est régulée négativement par miR-218, établissant ainsi une boucle de rétroaction négative. MiR-218 a diminué les niveaux d'éliminer la répression Robo1, ce qui active la voie à fente Robo1 par l'interaction entre Robo1 et Slit2, ce qui déclenche des métastases tumorales. La restauration de miR-218 supprime l'expression de Robo1 et inhibe l'invasion des cellules tumorales et les métastases in vitro
et in vivo
. Pris ensemble, nos résultats décrivent un circuit de régulation Slit-miR-218-Robo1 dont la perturbation peut contribuer à GC métastase. Ciblage miR-218 peut fournir une stratégie pour bloquer les métastases tumorales.

Auteur Résumé

Les microARN ont été identifiés comme jouant un rôle important dans les métastases de la tumeur, mais leur impact sur GC métastase a été mal exploré. Nous avons découvert miR-218, qui fonctionne comme un suppresseur de métastases de la tumeur et est en corrélation avec le stade clinique, les métastases des ganglions lymphatiques et le pronostic chez les patients atteints GC. Nos résultats montrent que miR-218 fait partie d'un circuit de régulation impliquant la voie Slit-Robo1. Dans les cellules tumorales métastatiques, miR-218 a été réprimée avec Slit3, l'un de ses gènes de l'hôte. Pendant ce temps, Robo1, l'un de plusieurs récepteurs à fente, est régulée à la hausse en réponse à la diminution de miR-218, qui à son tour induit une régulation positive réactive de la filière à fente Robo1 par le biais d'une interaction avec Slit2, facilitant ainsi la migration des cellules tumorales et l'invasion. Ces résultats ne fournissent pas seulement de nouvelles connaissances sur les mécanismes métastatiques en GC, mais aussi fournir des preuves pour un nouveau mode de régulation miARN médiée par la signalisation du récepteur

Citation:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) miR-218 Inhibe Invasion et métastase du cancer gastrique en ciblant le récepteur Robo1. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Editeur: Bruce E. Clurman, cancer de Fred Hutchinson Research Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 15 Juillet 2009; Accepté 10 Février 2010; Publié: 12 Mars, 2010

Droit d'auteur: © 2010 Tie et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 30670970, n ° 30873026, n ° 30672369, n ° 30530780) et le Programme de recherche de base nationale de Chine (No.2010CB529300). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Les progrès dans les approches diagnostiques et thérapeutiques ont conduit à d'excellentes attentes pour la survie à long terme pour le cancer gastrique précoce (GC). Cependant, le pronostic pour GC avancé avec une vaste invasion et les métastases reste faible [1]. Afin de métastaser, les cellules tumorales doivent passer par une série d'événements séquentiels et sélectifs, y compris le détachement, la migration, l'invasion locale, l'angiogenèse, intravasculaire, la survie dans le système circulatoire, extravasation et repousse dans les différents organes. Dans la cascade métastatique, l'invasion de la GC dans le tissu environnant est une première étape cruciale [2] - [4]. Cependant, les mécanismes d'invasion ont pas encore été complètement élucidé.

Un grand nombre d'acides microribonucleic (microARN ou miARN) ont été récemment impliqué dans le cancer métastatique [5], y compris miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520c, et miR-205 dans le cancer du sein [6] - [11]; miR-224 et miR-21 dans le cancer de la prostate [12], [13]; miR-29c dans les carcinomes du nasopharynx [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7, et miR-452 dans les carcinomes urothéliales [15]; miR-182 dans le mélanome [16]; miR-92b et miR-09.09 * dans les tumeurs cérébrales [17]; et miR-21 dans le cancer colorectal [18]. Cependant, très peu miARN connus pour être impliqués dans la GC métastase ont été rapportés. miARN sont d'origine naturelle, courtes, des molécules d'ARN non-codants qui régulent négativement l'expression des gènes [19]. Chez les mammifères, les miARN matures sont générés à partir pri-miARN et pré-miARN par traitement séquentiel par Drosha et Dicer et se retrouvent dans de nombreux organismes. Ils se composent de 21-24 nucléotides, intégrer dans les complexes de silencieux ARN induisant, et jumeler avec des régions non traduites 3 '(3'-UTR) des ARNs spécifiques cible de messagers (ARNm) afin de supprimer la traduction ou induisent la dégradation des ARNm cibles [20 ]. De nouvelles preuves ont révélé que les miARN jouent un rôle clé dans divers processus biologiques, y compris la différenciation cellulaire, la prolifération, l'apoptose, la résistance au stress, le métabolisme des lipides, la tumorigenèse et les métastases [21] - [23]. Une meilleure compréhension des changements dans l'expression des miARN pendant l'invasion de GC peut conduire à une meilleure compréhension du développement du GC, ainsi que des améliorations possibles dans le diagnostic et le traitement du GC avancé.

Dans la présente étude, nous avons établi de haut (MKN28-M et SGC7901-M) et de faibles lignées de cellules invasives (MKN28-NM et SGC7901-NM) à l'aide d'un test transwell répétitif in vitro
. Nous avons ensuite examiné le profil global d'expression des miARN dans chaque sous-lignée cellulaire en utilisant une puce miRNA pour identifier miARN exprimés différentiellement liés à l'invasion de GC humaine. Au total, 45 miARN ont été montrés à être différentiellement exprimé dans invasive vs cellules GC non-invasives. Parmi ceux-ci, miR-218, un miARN régulés à la baisse de manière significative dans des cellules hautement invasives, a montré une corrélation étroite avec GC tumorigenèse et les métastases chez les patients. Plus récemment, une diminution de miR-218 a été rapporté dans plusieurs types de tumeurs solides, y compris le cancer de la prostate, le GC, le cancer du poumon et le carcinome du col [24] - [27], mais cette diminution miARN-218 était simplement la présélection comme étant l'un des dizaines de miARN d'intérêt potentiels dans les cancers décrits ci-dessus. Aucune autre étude n'a été réalisée pour évaluer l'importance de miR-218 dans les métastases de la tumeur. Ici, nous avons constaté que la diminution de l'expression de miR-218 a été corrélée avec un stade avancé clinique, métastases ganglionnaires, et de mauvais pronostic chez les patients, et ré-expression de miR-218 dans les cellules métastatiques est capable d'inhiber la migration, l'invasion et la formation de métastases à la fois in vitro
et in vivo
. L'utilisation d'une recherche bioinformatique pour miR-218 cibles, nous avons identifié le récepteur Robo1 comme cible fonctionnelle de miR-218, et nous avons confirmé que l'interaction entre miR-218 et Robo1 était crucial pour la motilité des cellules de GC en démontrant qu'il y avait une corrélation inverse entre miR -218 et Robo1 dans les lignées cellulaires du GC, ainsi que chez les patients atteints de GC. En outre, nous avons découvert une boucle de rétroaction négative impliquant intrigante Slit, miR-218, et Robo1, dans lequel miR-218 peut être dérivé de l'un des deux gènes situés dans les introns de deux membres distincts de la famille des protéines Slit. En outre, les membres de cette famille sont des ligands du récepteur Robo1. Nous avons démontré que l'expression des deux gènes précurseurs de miARN (miR-218-1 et miR-218-2) en corrélation avec l'expression des gènes de l'hôte (Slit2 et Slit3, respectivement) et que la maturité miR-218 est principalement dérivé du miR précurseur -218-2, avec une réduction concomitante de l'hôte Slit3 mais pas dans les cellules de Slit2 GC métastatiques. Ainsi, la régulation positive de Robo1 en réponse à la diminution de miR-218 a induit une régulation positive de la voie réactive à fente Robo1 par son interaction avec Slit2, ce qui facilite l'invasion des cellules tumorales et des métastases. Nos résultats ne fournissent pas seulement de nouvelles connaissances sur les mécanismes métastatiques en GC, mais ils ont également révélé un nouveau mécanisme régulateur de la signalisation du récepteur.

Résultats

Création et caractérisation de lignées cellulaires avec différentes invasive et métastatique potentiels

Pour établir les modèles GC de métastases, nous avons créé lignées de cellules invasives et non invasives des lignées de cellules GC humaines SGC7901 et MKN28 en utilisant l'approche répétée transwell (figure 1A, voir Matériels et Méthodes). En bref, un dosage d'invasion répétée a été effectuée et les cellules qui ont échoué à envahir les membranes et les cellules qui ont la capacité de migrer à travers la membrane revêtue de collagène dans tous les tours de sélection ont été séparés. Après dix tours de sélection, nous avons obtenu des sous-lignées de cellules invasives (MKN28-M et SGC7901-M) et non-invasives (MKN28-NM et SGC7901-NM). Les propriétés métastatiques de chaque sous-lignée cellulaire ont été ensuite caractérisés in vitro
et in vivo
. Comme cela est représenté sur la figure 1B et 1C, la capacité de migration des cellules MKN28-M était d'environ 4 fois supérieure à celle des cellules MKN28-NM. De même, le potentiel invasif était environ 5 fois supérieure pour les cellules MKN28-M par rapport aux cellules MKN28-NM. Dans les in vivo
études, la métastase des cellules tumorales a été observée chez des souris nues. Comme cela est représenté sur la figure 1D et 1E, presque aucune cellule GC métastatiques ont été détectées dans les poumons ou le foie de la souris nude à 10 semaines après l'injection de cellules MKN28-NM, alors que la plupart des souris injectées avec des cellules MKN28-M affichées poumon évident foie ou métastases. Des résultats similaires ont été observés pour SGC7901-M et des cellules SGC7901-NM (données non présentées). Aucune différence significative dans la prolifération cellulaire ou la distribution du cycle cellulaire ont été observées chez ces lignées cellulaires (Texte S1, les figures S1 et S2).

Identification des miARN liées métastases par hybridation basée sur la baie

pour identifier les miARN potentiellement impliqués dans l'invasion par GC, nous avons examiné l'expression globale des miARN dans chaque sous-lignée cellulaire en utilisant la matrice de microARN (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Danemark), qui se compose de 847 sondes de capture pour les miARN humains matures. Les résultats des puces à ADN a révélé que l'expression de miARN 124 significativement différente entre la variante hautement invasive MKN28-M et la sous-lignée cellulaire non invasive MKN28 NM. Parmi ceux-ci, 83 ont été régulée à la hausse et 41 ont été downregulated. Par rapport à SGC7901-NM, 62 miARN ont été exprimés de manière différentielle dans la cellule sous-lignée SGC7901-M, dont 47 et 15 miARN-régulée régulés à la hausse. Au total, 11 miARN ont été trouvés pour être régulés à la hausse et 34 miARN ont été downregulated dans les deux cellules MKN28-M et SGC7901-M par rapport à celles des lignées non-invasives correspondants (tableau S1).

Sur les 45 différentiellement miARN réglementés, miR-218 a été l'un de ceux qui affichaient différentiel significativement l'expression. miR-218 a été rapporté pour être régulée à la baisse dans le cancer du col [25], CG [26], le cancer du poumon [27] et le cancer de la prostate [28], ce qui indique l'implication possible à la fois dans la tumeur et la transformation oncogénique des métastases. Cependant, miRNA-218 est seulement l'un des nombreux miARN d'intérêt potentiels dans les cancers. Dans ce travail, miR-218 a été étudiée beaucoup plus en détail. Pour valider les résultats de puces à ADN, nous avons évalué l'expression de miR-218 dans les lignées cellulaires de GC mentionnés précédemment et dans la lignée immortelle de cellules épithéliales gastriques GES en utilisant qRT-PCR [29]. expression miR-218 a été significativement diminuée dans les cellules MKN28-M et SGC7901-M et a été plus faible dans les quatre lignées de cellules GC par rapport aux gastriques humaines cellules épithéliales immortalisées GES (Figure 2A). En outre, nous avons comparé miR-218 expression dans la tumeur primaire de GC contre les ganglions métastatiques chez 10 patients de stade III /IV GC en utilisant qRT-PCR. Comme le montre la figure 2B, mature miR-218 étaient significativement diminué dans 7 des 10 ganglions métastatiques, indiquant que miR-218 peut jouer un rôle causal dans GC métastase.

Diminution de miR-218 expression dans GC a été associée à un stade avancé clinique, métastases ganglionnaires, et de mauvais pronostic du patient

Pour déterminer les implications potentielles de clinicopathologiques modifié miR-218 expression, nous avons étudié les niveaux de miR-218 expression dans 40 tissus GC (T) et la muqueuse non tumorale (N) par qRT-PCR. Le terme -ΔCt a été utilisé pour décrire le niveau de miR-218 expression. En accord avec les données ci-dessus, les résultats ont vérifié que le niveau miR-218 expression dans GC (-13,81 ± 0,15, moyenne ± SE) tissus était significativement plus faible que dans la muqueuse non néoplasique (-11,62 ± 0,15, moyenne ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, jumelé t
-test) (figure 3A). Les corrélations entre le niveau d'expression de miR-218 et les caractéristiques clinicopathologiques de GC sont résumées dans le tableau 1. Les associations statistiquement significatives entre le niveau d'expression de miR-218 et le stade clinique et entre le niveau d'expression de miR-218 et GC métastases ont été observées dans cette étude. L'expression médiane de miR-218 était -14,25 ± 0,17 dans les 22 cas de stade avancé (stade III et IV) de la maladie, alors que l'expression médiane était de -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney test) dans les 18 cas avec un stade précoce (stades I et II) la maladie. Dans les 29 cas de GC avec métastases ganglionnaires, l'expression médiane de miR-218 était -14,09 ± 0,16, ce qui était significativement plus faible que l'expression médiane (-13,07 ± 0,24) dans les 11 cas de GC non métastatiques ( P
= 0,0036). L'expression de miR-218 chez les patients atteints de GC ne sont pas corrélés avec l'âge, le sexe, la taille de la tumeur ou la différenciation cellulaire. En outre, nous avons examiné si le niveau d'expression de miR-218 est associée à la survie chez les patients atteints de GC. Les patients ont ensuite été divisés en une faible expression (n = 20) et des groupes d'expression élevés (n = 20) sur la base de miR-218 niveaux supérieurs ou inférieurs à la moyenne (-13,81) (figure 3B). la survie de Kaplan-Meier analyses ont révélé que les patients dont les tumeurs primaires affiché une faible expression de miR-218 avaient un temps plus court de la médiane de survie. Le taux de survie à trois ans des patients avec une faible expression de miR-218 était de 30%, ce qui est nettement inférieur au taux de survie chez les patients souffrant d'hypertension miR-218 expression (65%; P
= 0,0012, log- test de rang;. Figure 3C)

L'expression ectopique de miR-218 inhibe l'invasion des cellules tumorales et les métastases in vitro
et in vivo

Pour étudier le rôle de miR-218 en GC métastase, cellules MKN28-M ont été transfectées avec pGenesil-1-miR-218 ou un vecteur de contrôle exprimant un miARN non spécifique, cel-miR-67, en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Les cellules ont ensuite été sélectionnées avec 400 mg /L de G418 pour générer des cellules stables MKN28-M-218 et miR-MKN28-M-miR-contrôle. Nous avons constaté que l'expression ectopique de miR-218 a entraîné une réduction d'environ trois fois la migration et l'invasivité. Pour déterminer si la perte de miR-218 permettrait de promouvoir la migration ou l'invasion des cellules cancéreuses, nous taire miR-218 avec un inhibiteur d'oligonucléotide antisens dans la lignée cellulaire MKN28-NM, résultant en une période de trois à quatre fois plus dans la migration cellulaire et l'invasivité (figure 4A et 4B). Pour tester si l'inhibition de l'invasion tumorale par miR-218 est causée par l'altération de la capacité invasive des cellules tumorales, nous avons exclu les effets de miR-218 sur la distribution de la prolifération et le cycle cellulaire des cellules cancéreuses gastriques. La surexpression de miR-218 n'a pas d'incidence sur la prolifération et la distribution du cycle cellulaire des cellules MKN28-M in vitro
(figure S5A et S5D). Pour étudier plus l'inhibition de la vivo
métastases tumorales dans par miR-218, nous avons implanté MKN28-M-miR-218 cellules qui ont été de manière stable exprimant miR-218 ou de contrôle des cellules dans des souris nues par la veine caudale latérale. Du poumon et des métastases hépatiques de la CG a été observée chez les souris injectées avec des cellules MKN28-M-miR-contrôle. En revanche, quelques tumeurs métastatiques ont été détectés chez des souris injectées avec MKN28-M-miR-218 cellules (Figure 4C). En outre, on observe simultanément la croissance des tumeurs primaires et l'incidence des métastases à distance chez les souris nude par injection sous-cutanée MKN28-M-miR-218 ou des cellules de contrôle. Les résultats ont montré des métastases pulmonaires ou hépatiques était manifeste dans trois des 10 souris injectées avec des cellules MKN28-M-miR-contrôle; en contraste frappant, aucune métastase n'a été trouvée chez des souris injectées avec MKN28-M-miR-218 cellules (Figure S5E). Ces résultats sont cohérents avec les données obtenues à partir d'essais de queue de la veine qui évaluent les métastases du cancer et indiquer que miR-218 a la capacité de supprimer les métastases sans affecter la prolifération cellulaire.

Robo1 était une cible fonctionnelle directe de miR-218 en GC métastase

pour évaluer dans quelle mesure un niveau de miR-218 faible expression contribue à l'invasion et les métastases du GC, nous avons cherché les cibles réglementaires potentielles de miR-218 en utilisant des outils de prévision, y compris MIRANDA, PicTar et TargetScan. Bien que des centaines de cibles différentes ont été prévues, les gènes impliqués dans la migration ou invasion peuvent être les objectifs pertinents en ce qui concerne les fonctions biologiques de miR-218. Nous avons ensuite procédé à une classification fonctionnelle des objectifs prévus en utilisant le programme DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Parmi ces gènes, Robo1 est considéré comme une activité de proto-oncogène et ports migration promotion [30] - [35]. Mertsch et al.
Démontré que Robo1 facilite la migration des cellules de gliome médiée par Slit2 [36]. Schmid et al., A trouvé que la migration des cellules tumorales du sein est induite par l'interaction Slit2-Robo1 in vitro
[37]. Ces résultats suggèrent que Robo1 peut être une cible pour miR-218. Pour tester davantage notre hypothèse, nous avons analysé l'expression de miR-218 et Robo1 en GES et non-invasive (MKN28-NM et SGC7901-NM) et invasive (MKN28-M et SGC7901-M) cellules de GC. Les résultats ont montré une corrélation négative entre les niveaux de miR-218 et Robo1 ARNm dans ces cellules (Figure S3A). De plus, nous avons observé que Robo1 ARNm (Figure S3B) et de protéines (Figure 5B2) niveaux ont diminué lors de miR-218 a été exprimée par pGenesil-1-miR-218 dans les cellules MKN28-M (figure 5B1). L'inverse a été observée pour l'expression Robo1 quand miR-218 a été renversé dans les cellules MKN28-NM (Figure 5C1 et 5C2 Figure). La relation inverse entre miR-218 et l'expression Robo1 a été confirmée par immunohistochimie (Texte S1) dans 40 cas de cancer de l'estomac, dans les tissus normaux adjacents appariés qui ont également été utilisés dans les études clinicopathologiques, et dans 29 métastases appariés. Les résultats montrent que Robo1 a été régulée positivement dans GC, en particulier dans GC métastatique (figure S4), dans laquelle miR-218 a une expression relativement faible.

Pour obtenir d'autres preuves directes que Robo1 est une cible de miR-218 , nous avons étudié le site de liaison de miR-218 dans l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm Robo1 (figure 5A). Nous avons construit un reporter de la luciférase (Luc-Robo1) dans laquelle les nucléotides de la Robo1 3'-UTR complémentaire de miR-218 (nt 971-978) ont été insérés dans le miRNA expression vecteur rapporteur PMIR-RAPPORT [38]. De même, nous avons également généré à la fois un journaliste mutant (Luc-Robo1-mu), dans lequel les six premiers nucléotides dans les miR-218 semences région des sites complémentaires ont été supprimés, et un journaliste de contrôle, qui contenait un fragment non-connexe de l'ADNc (Luc-Ctrl). miR-218-expression des plasmides ont été co-transfectées avec Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, ou Luc-Ctrl dans les cellules MKN28-M. Les essais ont montré que l'activité de la luciférase dans les cellules Luc-Robo1-transfectées a été significativement diminué par rapport à l'activité de la luciférase dans les cellules témoins mutantes et négatives ( P
< 0,05), ce qui suggère que miR-218 a réduit la activité luciférase de Luc-Robo1 mais n'a eu aucun effet sur Luc-Robo1-mu (Figure 5D). Par conséquent, nous avons conclu que le fragment inséré de Robo1 (nt 971 -
978) a été la cible de miR-218

Robo1 a été montré pour être surexprimé dans les cellules cancéreuses et est. connu pour favoriser l'angiogénèse tumorale et des métastases par l'intermédiaire d'une interaction avec la fente [39], [40]. Pour tester si Robo1 est fonctionnellement régulée par miR-218, nous avons généré un produit d'assemblage d'expression de Robo1 contenant uniquement un fragment du site de liaison de miR-218 prédite et Robo1 vecteur d'expression mutant dépourvu complètement l'extrémité 3 'UTR. Nous avons également fait l'Robo1 siRNA. MKN28-M-miR-218 cellules, exprimés de manière stable miR-218 ectopique, ont été transitoirement transfectées avec le Robo1 construire ou de la construction mutante (sans site de liaison de miR-218) et des cellules MKN28-M ont été transfectées avec Robo1 ARNsi ou négative siRNA contrôle. MKN28-M-miR-218 transfectées avec la construction mutante Robo1 montré une augmentation de 3,8 fois de la capacité d'invasion par rapport aux cellules transfectées avec la construction Robo1. Ces résultats indiquent que l'introduction de l'ADNc mutant Robo1 qui manquait le site de liaison de miR-218 dans les cellules miR-218 surexprimant inverser l'effet de la suppression de miR-218 médiée par l'invasion cellulaire. Cependant, l'effet de Robo1 a été réprimée par miR-218 en présence de l'extrémité 3 'UTR Robo1 contenant les sites de liaison de miR-218. Knockdown de Robo1 par siRNA dans les cellules MKN28-M inhibe l'invasion des cellules, qui est tombé à des niveaux similaires à ceux observés après la transfection avec le vecteur miR-218 exprimant (Figure 5E et 5F). Ces observations suggèrent que miR-218 inhibe directement l'invasion des cellules à médiation par Robo1.

Slit2, mais pas Slit3, peut interagir avec Robo1, enrichi par l'absence de miR-218, pour favoriser l'invasion GC

Deux types de miARN existent: intergénique et intronique. Les premières sont situées dans des régions non codantes entre les gènes et leurs pri-miARN correspondants sont généralement transcrit à partir de leurs propres promoteurs de l'ARN polymerase II. Ces derniers sont situés dans les introns des gènes de l'hôte, ainsi que leur biogenèse est contrôlé par les promoteurs du gène de l'hôte [41], [42]. miR-218 est un miARN intronique. Code Deux gènes matures miR-218, miR-218-1 et miR-218-2, qui sont situés dans l'intron 15 de Slit2 et intron 14 de Slit3, respectivement (figure 6A). L'emplacement intronique des deux miR-218 gènes nous a incités à se demander si miR-218-1 et miR-218-2 sont transcrits en même temps que leurs ARNm de gènes hôtes. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé la qRT-PCR pour étudier l'expression du précurseur de miR-218-1, le miR-218-2 précurseur, mature miR-218, l'ARNm Slit2 et Slit3 ARNm dans les tissus GC utilisés dans la survie une analyse. L'analyse statistique du coefficient de corrélation des résultats qRT-PCR a révélé une corrélation positive significative entre les niveaux de Slit2 ARNm et miR-218-1 et entre les niveaux de Slit3 ARNm et miR-218-2 (figure 6B et 6C). Ces résultats indiquent que le miR-218 gènes codant pour miR-218-1 et miR-218-2, sont transcrites en même temps que les gènes de l'hôte, et Slit2 Slit3, respectivement. Une corrélation positive significative entre les niveaux de miR-218 et miR-218-2 (Figure 6D) a été observée dans GC; Cependant, aucune corrélation n'a été observée entre les niveaux de miR-218 et miR-218-1 (Figure 6E). Ces résultats indiquent que la régulation négative de miR-218 GC est favorisée par une diminution de miR-218-2, mais pas dans miR-218-1. Conformément à cette conclusion, l'expression Slit3 a été significativement réduite dans GC (-22,43 ± 0,21, moyenne ± SE) par rapport au tissu gastrique normale (-20,79 ± 0,23, moyenne ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, jumelé t
-test) (Figure 6F), alors que l'expression Slit2 n'a pas été significativement différent ( P
= 0,0772, jumelé t
-test) ( Figure 6G). En résumé, les résultats expérimentaux suggèrent que la régulation à la hausse significative du gène Robo1 en réponse à la suppression de miR-218 peut induire une régulation à la hausse subséquente de la filière à fente Robo1 par son interaction avec Slit2, ce qui facilite la migration des cellules de tumeur et l'invasion.

Discussion

pour étudier une maladie, il est essentiel de construire un modèle idéal. Dans la présente étude, nous avons isolé les sous-populations de cellules invasives et non invasives de lignées de cellules GC humaines établies en utilisant l'approche répétée Transwell, qui a été appliquée avec succès dans de nombreuses études portant sur les métastases tumorales [43] - [48]. Les résultats de l'examen métastatique in vitro
et in vivo
montré que les lignées cellulaires établies avaient des capacités invasives et métastatiques distinctes. Ici, nous avons criblé non seulement des lignées cellulaires dérivées de lignées de cellules GC à haut potentiel invasif, mais aussi ceux qui ont un faible potentiel invasif. A l'exception de leurs capacités métastatiques, les lignées cellulaires choisies étaient tous deux assez similaires, car ils partagent le même bagage génétique. Etant donné que la principale différence entre les deux types de sous-chaînes est la capacité métastatique, les gènes qui diffèrent entre eux devraient une bonne corrélation avec les métastases. En outre, notre méthode est capable de distinguer les étapes d'invasion de métastases et permet l'étude des étapes spécifiques de la métastase, qui ne peuvent être évalués dans le modèle d'animaux vivants.

Récemment, miARN ont été signalés à promouvoir [49] , [50] ou de supprimer [51] - [54] métastases tumorales, offrant une nouvelle perspective sur le processus métastatique. Néanmoins, le rôle des miARN dans GC métastase fait défaut. Dans ce rapport, nous avons exploré et obtenu pour les 45 premiers temps miARN liés métastase en GC basé sur un modèle cellulaire de métastases bien établie. La constatation que miR-218 a été downregulated en GC métastatique est intrigante, comme une diminution de miR-218 niveaux ont été signalés dans plusieurs types de tumeurs solides [24] - [27], [55], ce qui indique que la perte de miR-218 peut un événement commun dans la tumorigenèse. Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur l'effet de miR-218 sur GC métastase et a démontré que miR-218 agit comme un suppresseur de tumeur dans GC métastase. Restauration de miR-218 migration cellulaire réduite et invasion in vitro et
tumeur métastase in vivo
. Pour obtenir des lignées cellulaires stables qui surexprimé miR-218, nous avons des cellules transfectées MKN28-M avec miR-218 plasmides et sélectionnées par G418. Nous avons sélectionné douze colonies de cellules dans le groupe miR-218 transfectées et trouvé 10 des 12 colonies exposées remarquablement uniforme, stable et d'expression de haut niveau de miR-218. En outre, trois lignées cellulaires monoclonaux choisis au hasard présentaient une réduction similaire dans ablility invasive. Cependant, les stratégies de transfection du plasmide donnent souvent lieu à l'efficacité d'intégration plus faible par rapport à l'expression virale conduisant à la possibilité de sélection stochastique des rares variants fonctionnellement hétérogènes en vrac provenant de la population initiale. Par conséquent, l'utilisation future des systèmes d'expression viraux devrait créer une population de départ plus impartiale pour tester notre hypothèse.

Dans le cadre de nos recherches sur la façon dont la perte de miR-218 affecte GC métastase, nous avons démontré que Robo1 était une critique cible en aval de miR-218. Il est connu que Robo est un récepteur pour le guidage axonal et Slit est conservée chez les animaux allant de mouches des fruits pour les mammifères. Chez les mammifères, trois Slit (Slit1-3) et quatre Robo (Robo1-4) gènes ont été décrits [56], [57]. Les interactions Slit-Robo transmettent des signaux de médiation des signaux répulsifs sur les axones et les cônes de croissance au cours du développement neuronal et participent à la cellule et monocytes chimiotaxie T [58] - [64]. Comme pour les autres voies de développement, l'expression aberrante du Slit -
gènes Robo a été observée dans une variété de types de tumeurs [65] - [68]. Par exemple, dans des échantillons de tissu de carcinome du sein, Robo1 a été démontré que, pour être surexprimé, et il a été démontré pour induire la migration des lignées cellulaires de cancer du sein [37]. la signalisation Slit2-Robo1 facilite la migration cellulaire de gliome [36] et est impliqué dans l'angiogenèse, en augmentant la densité des microvaisseaux et la masse de la tumeur dans un modèle de xénogreffe de tumeur [30]. Wang et al.
A démontré que l'expression excessive de Robo1 dans de nouveaux vaisseaux sanguins dans les tumeurs induit une néovascularisation du cancer et de la croissance par l'intermédiaire d'une interaction entre Robo1 et son ligand, Slit2. Ils ont également identifié phosphoinositide-3-kinase (PI-3K) comme un effecteur en aval de la signalisation Slit2 /Robo1. Cela donne à penser qu'il existe une cascade Slit-Robo1-PI-3K qui pourrait conduire à la génération de phospho-3,4,5-triphosphate et l'activation subséquente des petites GTPases qui interviennent dans le mouvement cellulaire et le remodelage du cytosquelette d'actine [30] , [35]. En revanche, d'autres études ont fait valoir que la régulation négative de Robo1 causée par des suppressions ou des modifications épigénétiques peuvent jouer un rôle dans la progression tumorale [69] - [73]. Nous proposons qu'il existe un motif d'expression spécifique de tissus pour les gènes Slit-Robo.

Dans la présente étude, nous avons constaté que Robo1 a souvent été exprimée à des niveaux élevés dans les cellules invasives et à de faibles niveaux dans les cellules non-invasives , alors que miR-218 affiche le motif d'expression opposée. Lorsque nous avons transfecté le vecteur miR-218-expression et oligonucléotides inhibiteurs dans des cellules MKN28-M et MKN28-NM, respectivement, un motif d'expression inverse a été observée entre miR-218 et Robo1, qui est, si miR-218 expression était élevé, Robo1 expression était faible et vice versa. Ce résultat a été confirmé dans des échantillons cliniques et dans des essais d'activité de luciférase. Nous avons également remarqué que l'induction de l'expression de Robo1 par la construction mutant Robo1 sans le site de liaison miR-218 pourrait inverser la suppression miR-218-médiation de l'invasion des cellules tumorales. En revanche, Robo1 knockdown de l'expression génique par ARNi a eu un effet sur la réduction de l'invasion tumorale cellulaire similaire à celui de la restauration de miR-218, bien que seul Robo1 effet de choc a démontré un effet faible. Ce pourrait être parce que Robo1 est pas la seule cible de miR-218 qui est pertinente pour les métastases tumorales. Ces résultats indiquent que l'effet de suppression de l'invasion de miR-218 est au moins partiellement médiatisée par une diminution de l'expression Robo1. Ceci est également la première étude pour démontrer que le gène Robo1 associé à une tumeur est régulée négativement par miR-218 par l'intermédiaire d'un site cible spécifique (nt 971-978) à l'intérieur de l'extrémité 3 'UTR. Le récepteur Robo1 est crucial pour la réponse à des signaux extracellulaires et les changements phénotypiques cellulaires; par conséquent, une réglementation stricte du récepteur Robo1 par miR-218 peut faciliter plus robuste transduction de signal. Anticorps monoclonal anti-Robo1 a été rapportée comme étant un traitement efficace des cancers exprimant Robo1 [30], [33]. Dans la présente étude, nous avons trouvé un nouvel inhibiteur de Robo1, miR-218, qui peut potentiellement être utilisé pour traiter certains types de cancer.

Comme mentionné ci-dessus, Slit1, Slit2 et Slit3 comprennent la famille Slit de les protéines. Bien que les gènes se chevauchent, leurs modes et fonctions expression sont distinctes. Les deux premières protéines sont connues pour être impliquées dans le guidage axonal et la migration cellulaire [37], [74], tandis que Slit3 est impliqué dans le développement des organes et des systèmes d'organes, y compris le diaphragme et le rein [75]. En accord avec ces données, nous avons constaté que Slit2, mais pas Slit3, interagi avec Robo1 de promouvoir l'invasion GC.

De plus, nous avons démontré que les miR-218 gènes codant ont été localisés et transcrits conjointement avec des gènes Slit , qui étaient des ligands Robo1, créant ainsi une boucle de rétroaction négative qui régule la signalisation Slit /Robo1. Barik Sailen a démontré qu'un miARN intronique, miR-338, les gènes qui sont fonctionnellement antagonistes à son produit de gène hôte réduit au silence, ce qui crée ainsi une boucle de rétroaction positive qui facilite le rôle physiologique du gène de l'hôte [76].

• PLOS ONE: Vascular CXCR4 Expression - un roman anti-angiogénique cible dans le cancer gastrique
• PLOS ONE: Silencing de Claudin-11 est associée à une invasivité des cellules de cancer gastrique