PLoS Genetics: MiR-218 Remt Invasie en uitzaaiing van maagkanker door Gericht op de Robo1 Receptor

Abstract

MicroRNAs spelen een belangrijke rol in de tumor metastase. Hier beschrijven we de regulatie en functie van miR-218 bij maagkanker (GC) metastase. miR-218 expressie is verminderd met de expressie van een van zijn gastheer genen, Slit3 in metastatische GC. Echter, Robo1, een van de vele split-receptoren, negatief gereguleerd door miR-218, waardoor de oprichting van een negatieve feedback loop. Verminderde miR-218 levels te elimineren Robo1 repressie, waarbij de split-Robo1 pathway activeert door de interactie tussen Robo1 en Slit2, dus triggering tumor metastase. De restauratie van miR-218 onderdrukt Robo1 expressie en remt de tumorcel invasie en metastase In vitro Kopen en In vivo
. Bij elkaar genomen, onze resultaten beschrijven een split-miR-218-Robo1 regulerende circuit waarvan de verstoring kan bijdragen aan GC metastase. Targeting miR-218 kan een strategie voor het blokkeren van de tumor metastase te bieden.

Auteur Samenvatting

zijn MicroRNAs geïdentificeerd als het spelen een belangrijke rol in de tumor metastase, maar hun impact op de GC metastase is slecht onderzocht. We hebben ontdekt miR-218, die fungeert als een suppressor van tumormetastase en gecorreleerd met klinische, lymfeknoop metastase en prognose bij patiënten met GC. Onze resultaten tonen aan dat miR-218 is onderdeel van een regulerende circuit met de slit-Robo1 route. In metastatische tumorcellen werd miR-218 onderdrukt met Slit3, een van zijn gastheer genen. Ondertussen Robo1, één van verscheidene receptoren Slit wordt opgereguleerd in reactie op de daling van miR-218, dat op zijn beurt een reactieve opregulatie van de slit-Robo1 route geïnduceerd door een samenspel met Slit2, waardoor het gemakkelijker tumorcel migratie en invasie. Dergelijke bevindingen bieden niet alleen nieuwe inzichten in de metastatische mechanismen in GC, maar ook het bewijs leveren voor een nieuw-miRNA gemedieerde regulerende functie van de receptor signalering

Visum:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Zon S, et al. (2010) MiR-218 Remt Invasie en uitzaaiing van maagkanker door Gericht op de Robo1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 juli 2009; Aanvaard: 10 februari 2010; Gepubliceerd: 12 maart 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 30670970, nr 30873026, nr 30672369, nr 30530780) en de Nationale Basic Research Program van China (No.2010CB529300). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

De vooruitgang in diagnostische en therapeutische benaderingen tot uitstekende verwachtingen voor de lange termijn overleving van vroege maagkanker (GC). Echter, de prognose voor geavanceerde GC met uitgebreide invasie en metastase blijft een slechte [1]. Om te metastaseren, moet tumorcellen door een reeks sequentiële en selectieve events onthechting, migratie, lokale invasie, angiogenese, intravasation, overleving in de bloedsomloop, extravasatie en hergroei in verschillende organen passen. In de metastatische cascade, invasie van GC in het omringende weefsel is een belangrijke eerste stap [2] - [4]. De mechanismen van invasie nog niet volledig opgehelderd.

Een groot aantal microribonucleic zuren (microRNA of miRNAs) zijn onlangs betrokken bij kanker metastase [5], met inbegrip van miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520C en miR-205 bij borstkanker [6] - [11]; miR-224 en miR-21 bij prostaatkanker [12], [13]; miR-29c in nasofaryngeale carcinomen [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7, en miR-452 in urothelial carcinomen [15]; miR-182 in melanoom [16]; miR-92b en miR-9/9 * bij hersentumoren [17]; en miR-21 in darmkanker [18]. Echter zeer weinig bekend miRNAs betrokken bij metastase GC gerapporteerd. miRNAs in de natuur voor korte niet-coderende RNA moleculen die negatief genexpressie [19] te reguleren. Bij zoogdieren, zijn volwassen miRNAs gegenereerd uit pri-miRNAs en pre-miRNAs via sequentiële verwerking door Drosha en Dicer en zijn te vinden in veel organismen. Ze bestaan ​​uit 21-24 nucleotiden, te integreren in-RNA-inducerende silencing complexen, en paren met de 3 'onvertaalde gebieden (3'-UTR) specifieke doelgroep messenger RNA (mRNA) te vertalen onderdrukken of degradatie van het doelwit mRNA te induceren [20 ]. Opkomende bewijs is gebleken dat miRNAs een belangrijke rol spelen in verschillende biologische processen, zoals celdifferentiatie, proliferatie, apoptose, stressbestendigheid, vetmetabolisme, tumorvorming en metastase [21] - [23]. Een beter begrip van de veranderingen in miRNA expressie tijdens GC invasie kunnen leiden tot een beter begrip van GC ontwikkeling, alsmede mogelijke verbeteringen in de diagnose en behandeling van gevorderde GC.

In de onderhavige studie hebben we vastgesteld high (MKN28-M en SGC7901-M) en lage invasieve cel sublijnen (MKN28-NM en SGC7901-NM) met behulp van een zich herhalend transwell assay in vitro
. Vervolgens hebben we gekeken naar de mondiale miRNA expressie profiel in elke cel sublijn met behulp van een miRNA microarray om differentieel tot expressie miRNAs die verband houden met de menselijke GC invasie identificeren. In totaal werden 45 miRNAs aangetoond dat verschillend tot expressie gebracht in invasieve versus niet-invasieve GC cellen. Onder deze, miR-218, een significant neerwaarts gereguleerd miRNA in zeer invasieve cellen, bleek nauw gecorreleerd met GC ontstaan ​​van tumoren en uitzaaiingen bij patiënten. Meer recent is een afname van miR-218 gerapporteerd bij verschillende soorten vaste tumoren, zoals prostaatkanker, GC, longkanker en cervixcarcinoom [24] - [27], maar deze afname in miRNA-218 werd alleen uitgezeefd als een van de tientallen potentiële miRNAs van belang in de hierboven beschreven kankers. Geen verdere studies uitgevoerd om de betekenis van miR-218 in tumormetastase beoordelen. Hier hebben wij gevonden dat verlaagde miR-218 expressie is gecorreleerd met geavanceerde klinische stadium, lymfeknoop metastase en slechte prognose bij patiënten, en re-expressie van miR 218 in metastatische cellen kon remmen migratie, invasie en metastasering zowel in vitro Kopen en in vivo
. Met behulp van een bio-informatica zoektocht naar miR-218 targets, vastgesteld wat we de receptor Robo1 als functionele doel miR-218's, en we bevestigd dat de interactie tussen miR-218 en Robo1 was van cruciaal belang voor GC cel beweeglijkheid door aan te tonen dat er een omgekeerde correlatie tussen miR -218 en Robo1 in GC cellijnen en bij GC patiënten. Verder ontdekten we een intrigerende tegenkoppellus waarbij Slit, miR-218 en Robo1, waarbij miR-218 kan worden afgeleid uit een van de twee genen in de introns van twee verschillende leden van de slit eiwitfamilie. Daarnaast, de leden van deze familie zijn liganden van de Robo1 receptor. We hebben aangetoond dat expressie van de twee miRNA precursor genen (miR-218-1 en miR-218-2) gecorreleerd met de expressie van de gastheer genen (Slit2 en Slit3, respectievelijk) en dat de volwassen miR-218 hoofdzakelijk is afgeleid van de miR -218-2 voorloper, met een gelijktijdige verlaging van de gastheer Slit3, maar niet die van Slit2 in metastatische GC cellen. Aldus opregulatie van Robo1 in reactie op de daling van miR-218 leidde tot een reactief opregulatie van de slit-Robo1 weg door de interactie met Slit2, waardoor het gemakkelijker tumorcel invasie en metastase. Onze bevindingen bieden niet alleen nieuwe inzichten in de mechanismen metastatische GC, maar bleek ook een nieuw regulatiemechanisme van receptorsignalering.

Resultaten

Vaststelling en karakterisering van cel sublijnen met verschillende invasieve en metastatische potentials

Om de GC metastase modellen, creëerden we invasieve en niet-invasieve cel sublijnen uit de menselijke GC cellijnen SGC7901 en MKN28 met behulp van de herhaalde transwell aanpak (Figuur 1A, zie materialen en methoden). Kort samengevat, werd een herhaalde invasie assay uitgevoerd en die cellen die niet de membranen en cellen die het vermogen om te migreren door de met collageen beklede membraan in elke selectieronden werden gescheiden had binnenvallen. Na tien selectieronden, verkregen we invasieve (MKN28-M en SGC7901-M) en niet-invasieve cellen sublijnen (MKN28-NM en SGC7901-NM). De metastatische eigenschappen van elke cel deellijn werden vervolgens gekarakteriseerd In vitro Kopen en In vivo
. Zoals getoond in Figuur 1B en 1C, migratievermogen van MKN28-M-cellen ongeveer 4-maal groter dan die van MKN28-NM cellen. Ook de invasiepotentieel ongeveer groter voor MKN28-M cellen 5-voudig in vergelijking met MKN28-NM cellen. In de In vivo
studies werd tumorcel metastase waargenomen in naakt muizen. Zoals getoond in figuur 1D en 1E, bijna geen metastatische GC cellen werden gedetecteerd in de longen of lever van naakt muizen op 10 weken na injectie van MKN28-NM cellen, terwijl de meeste van de muizen geïnjecteerd met MKN28-M cellen weergegeven duidelijk long of lever metastasen. Soortgelijke resultaten werden waargenomen voor SGC7901-M en SGC7901 NM-cellen (gegevens niet getoond). Geen significante verschillen in celproliferatie of celcyclus verdeling werden waargenomen bij deze mobiele sublijnen (Text S1, S2 en S1 figuren).

Identificatie van metastase gerelateerde miRNAs door array-hybridisatie

om miRNAs mogelijk betrokken zijn bij invasie GC identificeren, onderzochten we globaal miRNA expressie in elke cel sublijn met de microRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Denemarken), dat bestaat uit 847 capture probes voor rijp humaan miRNAs. De microarray resultaten bleek dat de expressie van 124 miRNAs significant tussen de zeer invasieve variant MKN28-M en de niet-invasieve cellen sublijn MKN28-NM. Hiervan werden opgereguleerd 83 en 41 werden gedownreguleerd. Vergeleken met SGC7901-NM, werden 62 miRNAs differentieel tot expressie in de SGC7901-M cel sublijn, met inbegrip van 47 neerwaarts gereguleerd en 15 opgereguleerd miRNAs. In totaal werden 11 miRNAs opgereguleerd en 34 miRNAs werden neerwaarts gereguleerd in zowel MKN28-M en M SGC7901-cellen vergeleken met die van het overeenkomstige niet-invasieve sublijnen (tabel S1).

Van de 45 differentieel gereguleerde miRNAs, miR-218 was een van degenen die aanzienlijk weergegeven differentiële expressie. miR-218 is gerapporteerd dat downgereguleerd in cervicale kanker [25], GC [26], longkanker [27] en prostaatkanker [28], wijzend op mogelijke betrokkenheid bij het oncogene transformatie en tumormetastase. Echter, miRNA-218 slechts een van de vele mogelijke miRNAs plaats in kankers. In dit werk, heeft miR-218 is onderzocht in veel meer detail. Om de microarray resultaten te valideren, onderzochten we miR-218 uitdrukking in het GC cel sublijnen eerder vermeld en in de onsterfelijke maag epitheel cellijn GES behulp qRT-PCR [29]. miR-218 expressie was significant verminderd bij MKN28-M en SGC7901-M cellen en was lager in alle vier de GC cel sublijnen in vergelijking met vereeuwigd menselijke maag-epitheliale GES-cellen (Figuur 2A). Verder vergeleken we miR-218 expressie in de primaire tumor GC vs. metastatische lymfeknopen bij 10 patiënten met stadium III /IV GC behulp qRT-PCR. Zoals weergegeven in figuur 2B, volwassen miR-218 levels waren significant gedaald in 7 van de 10 metastatische lymfeklieren, wat aangeeft dat miR-218 een oorzakelijke rol spelen bij GC metastase.

Verminderde miR-218 expressie in GC was geassocieerd met geavanceerde klinische stadium, lymfeknoop metastase en slechte prognose voor patiënten

Om het potentieel klinisch-pathologische gevolgen van gewijzigde miR-218 expressie te bepalen, onderzochten we de expressie van miR-218 in 40 GC weefsels (T) en non-tumor mucosa (N) van qRT-PCR. De term -ΔCt werd gebruikt om het expressieniveau van miR-218 beschreven. In overeenstemming met de bovenstaande gegevens, de resultaten bevestigd dat de miR-218 expressie niveau in GC (-13,81 ± 0,15, gemiddelde ± SE) weefsels was significant lager dan die in niet-neoplastische slijmvlies (-11,62 ± 0,15, gemiddelde ± SE) ( P Restaurant < 0,0001, t = 10,62, gekoppeld t
-test) (Figuur 3A). Correlaties tussen miR-218 expressieniveau en clinicopathologic kenmerken van GC zijn samengevat in tabel in deze studie 1. Statistisch significante associaties tussen miR-218 expressieniveau en klinische fase en tussen miR-218 expressieniveau en GC metastase waargenomen. De mediane expressie van miR-218 was -14,25 ± 0,17 in de 22 gevallen met een vergevorderd stadium (stadium III en IV) ziekte, terwijl de mediane expressie was -13,27 ± 0.20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney test) in de 18 gevallen met een vroeg stadium (stadium I en II) ziekte. In het 29 geval van GC met lymfeknoop metastase, de mediane expressie van miR-218 was -14,09 ± 0,16, die aanzienlijk lager dan de mediaan expressie (-13,07 ± 0,24) in de 11 niet-metastatische GC gevallen (was P
= 0,0036). De expressie van miR-218 in GC patiënten niet correleren met leeftijd, geslacht, tumorgrootte of celdifferentiatie. Daarnaast werd gekeken of het niveau van miR-218 expressie is geassocieerd met overleving bij patiënten met GC. De patiënten werden vervolgens verdeeld in lage expressie (n = 20) en hoge expressie groepen (n = 20) op basis van miR-218 concentratie van meer of minder dan het gemiddelde (-13,81) (Figuur 3B). Kaplan-Meier survival analyses is gebleken dat patiënten bij wie de primaire tumoren weergegeven lage expressie van miR-218 had een kortere mediane overleving tijd. De drie-jaarsoverleving van patiënten met lage miR-218 expressie was 30%, wat aanzienlijk lager is dan de overleving bij patiënten met hoge miR-218 expressie (65% was; P
= 0,0012, log rank test;. Figuur 3C)

Ectopische expressie van miR-218 geremd tumorcel invasie en metastase in vitro Kopen en in vivo

Om te onderzoeken de rol van miR-218 in GC metastase werden MKN28-M cellen getransfecteerd met pGenesil-1-miR-218 of een controle vector die een niet-specifieke miRNA, cel-miR-67, met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). De cellen werden vervolgens geselecteerd met 400 mg /l G418 aan MKN28-M-miR-218 en MKN28-M-miR-control stabiele cellen te maken. We vonden dat ectopische expressie van miR-218 leidde tot een ongeveer drievoudige verlaging van migratie en invasiviteit. Te bepalen of het verlies van miR-218 de migratie en invasie van kankercellen zou bevorderen, we zwijgen miR-218 met een antisense oligonucleotide remmer in de MKN28-NM cellijn, waardoor een drie- tot viervoudige toename in celmigratie en invasiviteit (figuur 4A en 4B). Om te testen of remming van tumorinvasie van miR-218 wordt veroorzaakt door afbreuk het invasieve vermogen van tumorcellen, exclusief het effect van miR-218 op de proliferatie en celcyclusverdeling van maagkanker cellen. Overexpressie van miR-218 had geen invloed op de verspreiding en de celcyclus verdeling van MKN28-M cellen In vitro
(figuur S5A en S5D). Om verder te onderzoeken van de remming van de In vivo
tumormetastase door miR-218, we geïmplanteerd MKN28-M-miR-218 cellen die stabiel werden tot expressie miR-218 of de controle cellen in naakt muizen via de laterale staartader. Long- en levermetastasen van GC bleek bij muizen geïnjecteerd met MKN28-M-miR-controlecellen. Daarentegen werden weinig metastatische tumoren waargenomen bij muizen geïnjecteerd met MKN28-M-miR-218-cellen (Figuur 4C). Verder hebben we waargenomen gelijktijdig de groei van primaire tumoren en de incidentie van metastasen in naakt muizen subcutaan geïnjecteerd met MKN28-M-miR-218-cellen en controlecellen. De resultaten toonden long- of levermetastasen bleek bij 3 van 10 muizen geïnjecteerd met MKN28-M-miR-controlecellen; in schril contrast, werden er geen uitzaaiingen gevonden in muizen geïnjecteerd met MKN28-M-miR-218-cellen (Figuur S5E). Deze resultaten zijn consistent met gegevens verkregen van staartader assays die kanker metastase te beoordelen en geven aan dat miR-218 heeft de mogelijkheid om metastase te onderdrukken zonder dat celproliferatie.

Robo1 een rechtstreeks functioneel doelwit van miR-218 in GC metastase

om te beoordelen hoe een laag niveau van miR-218 expressie bijdraagt ​​aan de invasie en uitzaaiing van GC, hebben we gezocht naar de mogelijke regelgeving doelwitten van miR-218 met behulp van voorspelling instrumenten, waaronder Miranda, PicTar en TargetScan. Hoewel honderden verschillende doelwitten werden voorspeld, kunnen die genen die betrokken zijn bij migratie en invasie belangrijkste doelstellingen met betrekking tot de biologische functies van miR-218. Vervolgens hebben we voerden een functionele indeling van de voorspelde targets met behulp van de DAVID-programma (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Van deze genen wordt Robo1 beschouwd als een proto-oncogen en havens migratie bevorderende activiteit [30] - [35]. Mertsch et al.
Aangetoond dat Robo1 vergemakkelijkt glioma celmigratie gemedieerd door Slit2 [36]. Schmid et al., Vond dat de borst tumorcel migratie wordt geïnduceerd door de Slit2-Robo1 interactie in vitro
[37]. Deze bevindingen suggereren dat Robo1 doelwit voor miR-218 kan zijn. Om onze hypothese verder te testen, analyseerden we de expressie van miR-218 en Robo1 in GES en in niet-invasieve (MKN28-NM en SGC7901-NM) en invasieve (MKN28-M en SGC7901-M) GC cellen. De resultaten toonden een negatieve correlatie tussen het niveau van miR-218 en Robo1 mRNA in deze cellen (Figuur S3A). Verder hebben we geconstateerd dat Robo1 mRNA (figuur S3B) en eiwit (Figuur 5B2) niveaus werden verlaagd toen miR-218 in MKN28-M-cellen (Figuur 5B1) van pGenesil-1-miR-218 werd uitgedrukt. Het omgekeerde werd waargenomen voor Robo1 expressie als miR-218 in MKN28-NM-cellen (Figuur 5C1 en figuur 5C2) werd geklopt. De omgekeerde relatie tussen miR-218 en Robo1 expressie werd verder bevestigd door immunohistochemie (Text S1) in 40 gevallen van maagkanker, in gelijke aangrenzende normale weefsels die ook werden gebruikt in klinische en studies, en 29 aangepast metastasen. De resultaten tonen dat Robo1 werd opgereguleerd in GC, vooral in metastatische GC (figuur S4), waarbij miR-218 een relatief lage expressie.

Om verder direct bewijs dat Robo1 is een doel van miR-218 te verkrijgen onderzochten we de bindingsplaats van miR-218 in de 3'-UTR van Robo1 mRNA (Figuur 5A). Construeerden wij een luciferase reporter (Luc-Robo1) waarin de nucleotiden van het 3'-UTR Robo1 complementair aan miR-218 (nt 971-978) werden in de PMIR-REPORT miRNA expressie reporter vector [38] geplaatst. Dienovereenkomstig, genereerden we ook zowel een mutant reporter (Luc-Robo1-mu), waarbij de eerste zes nucleotiden in miR-218 seed-regio aanvullende locaties zijn verwijderd, en een controle-reporter, die een niet-verwante fragment van cDNA aanwezig (Luc-Ctrl). miR-218-expressieplasmiden werden gecotransfecteerd met Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu of Luc-Ctrl in MKN28-M cellen. De tests toonden aan dat de luciferase activiteit in de Luc-Robo1-getransfecteerde cellen was significant gedaald ten opzichte van de luciferase activiteit in de mutant en de negatieve controle cellen ( P Restaurant < 0,05), wat suggereert dat miR-218 verminderde de luciferaseactiviteit van Luc-Robo1 maar had geen effect op Luc-Robo1-mu (figuur 5D). We concluderen dat het ingevoegde fragment van Robo1 (nt 971 -
978). Het doelwit van miR-218

Robo1 is aangetoond dat overexpressie in kankercellen en bekend tumorangiogenese en metastase bevorderen via een interactie met Slit [39], [40]. Testen of Robo1 functioneel geregeld door miR-218, genereerden wij een Robo1 expressieconstruct die slechts een fragment van de voorspelde miR-218-bindingsplaats en Robo1 mutant expressievector geheel zonder het 3'-UTR. Wij hebben ook de Robo1 siRNA. MKN28-M-miR-218 cellen die stabiel tot expressie miR-218 ectopisch, werden tijdelijk getransfecteerd met de Robo1 construct of mutant construct (zonder miR-218-bindingsplaats) en MKN28-M-cellen werden getransfecteerd met Robo1 siRNA of negatieve controle siRNA. MKN28-M-miR-218 cellen getransfecteerd met het construct Robo1 mutant vertoonde een 3,8-voudige toename van invasie vermogen vergeleken met cellen getransfecteerd met het construct Robo1. Deze resultaten geven aan dat invoering van mutante Robo1 cDNA dat miR-218 bindingsplaats ontbrak in de miR-218-cellen tot overexpressie keerde de effecten van miR-218-gemedieerde onderdrukking van celinvasie. Het effect van Robo1 werd onderdrukt door miR-218 in aanwezigheid van de Robo1 3'-UTR die de miR-218-bindingsplaatsen. Knockdown van Robo1 door siRNA in MKN28-M cellen geremd cel invasie, die daalde tot een niveau vergelijkbaar met die waargenomen na transfectie met de miR-218 expressie vector (figuur 5E en 5F). Deze waarnemingen suggereren dat miR-218 direct onderdrukt Robo1-bemiddelde invasie.

Slit2, maar niet Slit3, kunnen interageren met Robo1, verrijkt door de afwezigheid van miR-218 te bevorderen GC inval

Twee types van miRNAs bestaan: intergenische en intronic. De voormalige zijn gevestigd in niet-coderende gebieden tussen genen, en de bijbehorende pri-miRNAs zijn over het algemeen afgeschreven van hun eigen promoters door RNA-polymerase II. Deze zo in de introns van ontvangende genen en hun biogenese wordt bestuurd door de host genpromotors [41], [42]. miR-218 is een intronic miRNA. Twee genen coderen voor de rijpere miR-218, miR-218-1 en miR-218-2, die gevestigd zijn op intron 15 van Slit2 en intron 14 van Slit3, respectievelijk (figuur 6A). De intronic locatie van de twee miR-218 genen voor ons aanleiding om te vragen of miR-218-1 en miR-218-2 samen worden getranscribeerd met hun gastheer gen mRNA's. Om deze hypothese te testen, hebben we gebruik gemaakt qRT-PCR om de expressie van de miR-218-1 voorloper te onderzoeken, de miR-218-2 voorloper, volwassen miR-218, Slit2 mRNA en Slit3 mRNA in het GC weefsels worden gebruikt in de survival analyse. Statistische analyse van de correlatiecoëfficiënt van de qRT-PCR resultaten bleek een significant positieve correlatie tussen de niveaus van Slit2 mRNA en miR-218-1 en tussen de niveaus van Slit3 mRNA en miR-218-2 (figuur 6B en 6C). Deze resultaten geven aan dat de miR-218 coderende genen, miR-218-1 en miR-218-2, samen getranscribeerd met hun gastheer genen, Slit2 en Slit3 respectievelijk. Een significante positieve correlatie tussen de niveaus van miR-218 en miR-218-2 (figuur 6D) werd waargenomen in GC; werd echter geen dergelijke correlatie te zien tussen de niveaus van miR-218 en miR-218-1 (figuur 6E). Deze resultaten geven aan dat downregulatie van miR-218 in GC wordt bevorderd door een afname van miR-218-2, maar niet in miR-218-1. In overeenstemming met deze conclusie, werd Slit3 expressie significant verminderd in GC (-22,43 ± 0,21, gemiddelde ± SE) in vergelijking met de normale maag weefsel (-20,79 ± 0,23, gemiddelde ± SE), ( P Restaurant < 0,0001, t = 7,67, gekoppeld t
-test) (figuur 6F), terwijl Slit2 expressie was niet significant verschillend ( P
= 0,0772, gekoppeld t
-test) ( Figuur 6G). Samenvattend onze experimentele resultaten suggereren dat aanzienlijke opwaartse regulatie van de Robo1 gen in reactie op het verwijderen van miR-218 een volgende opregulatie van de slit-Robo1 enzym kan induceren door de interactie met Slit2 vergemakkelijken tumorcel migratie en invasie.

Discussie

om een ​​ziekte te bestuderen, is het essentieel om een ​​ideaal model te bouwen. In deze studie, die we invasieve en niet-invasieve cel subpopulaties van gevestigde menselijke cellijnen GC met de herhaalde transwell benadering, die met succes in vele studies toegepast onderzoek tumormetastase [43] - [48]. De resultaten van het onderzoek metastatische In vitro Kopen en In vivo
bleek dat de gevestigde cel sublijnen hadden verschillende invasieve en metastatische mogelijkheden. Hier hebben we gescreend niet alleen cel sublijnen afgeleid van GC cellijnen met high-invasieve potentieel, maar ook mensen met een laag-invasieve potentieel. Met uitzondering van hun metastatische vermogen, de geselecteerde cel sublijnen allebei zeer vergelijkbaar, aangezien ze dezelfde genetische achtergrond. Aangezien het belangrijkste verschil tussen de twee soorten sublijnen metastatische vermogen, moet de genen die verschillen ze goed correleert met metastase. Bovendien onze methode kan invasie stadia onderscheiden van metastase en maakt het bestuderen van specifieke stappen in metastase, die niet in de live-diermodellen worden beoordeeld.

Onlangs zijn miRNAs gemeld bevorderen [49] , [50] of te onderdrukken [51] - [54] tumor metastase, het verstrekken van een nieuw perspectief op de metastatische proces. Toch is de rol van miRNAs in GC metastase ontbreekt. In dit rapport, we verkend en verkregen voor de eerste keer 45-metastase gerelateerde miRNAs in GC gebaseerd op een gevestigde metastase cel model. De bevinding dat miR-218 werd neerwaarts gereguleerd in metastatische GC is intrigerend, een verminderde miR-218 niveaus werden gerapporteerd in verschillende soorten vaste tumoren [24] - [27], [55], wat aangeeft dat het verlies van miR-218 kan zijn een veel voorkomende gebeurtenis in het ontstaan ​​van tumoren. In deze studie hebben we ons gericht op de effecten van miR-218 van GC en metastase aangetoond dat miR-218 werkt als een tumor suppressor in GC metastase. Restauratie van miR-218 verminderde celmigratie en invasie In vitro Kopen en tumor metastase In vivo
. Om stabiele cellijnen die overexpressie miR-218, we getransfecteerde MKN28-M cellen met miR-218 plasmiden en gescreend door G418 te verkrijgen. Wij selecteerden twaalf cel kolonies in de miR-218-getransfecteerde groep en vonden 10 van de 12 kolonies vertoonden opmerkelijk uniform, stabiel en hoog niveau expressie van miR-218. Voorts drie willekeurig gekozen monoklonale cellijnen vertoonden vergelijkbare vermindering invasieve ablility. Echter plasmide transfectie strategieën vaak resulteren in lagere efficiëntie integratie opzichte van viraal expressiesysteem leiden tot de mogelijkheid van stochastische zeldzamere functioneel heterogene varianten van de oorspronkelijke massapopulatie. Derhalve het toekomstige gebruik van virale expressiesystemen zouden een onpartijdige uitgangspopulatie onze hypothese te testen maken.

Als onderdeel van een onderzoek naar hoe verlies van miR-218 beïnvloedt GC metastase, hebben we aangetoond dat Robo1 een kritische stroomafwaarts doelwit van miR-218. Het is bekend dat Robo is een axon begeleiding receptor voor split en is geconserveerd bij dieren, variërend van fruit vliegt naar zoogdieren. Bij zoogdieren zijn drie spleet (Slit1-3) en vier Robo (Robo1-4) genen beschreven [56], [57]. De Slit-Robo interacties brengen signalen bemiddelen weerzinwekkend signalen op axonen en groei kegels tijdens de neurale ontwikkeling en neem deel aan T-cel en monocyt chemotaxis [58] - [64]. Voor andere ontwikkelingspaden, afwijkende expressie van de slit -
Robo genen waargenomen in verschillende tumortypen [65] - [68]. Bijvoorbeeld in borstcarcinoom weefselmonsters, Robo1 is aangetoond dat overexpressie en is aangetoond migratie van borstkankercellijnen [37] induceren. Slit2-Robo1 signalering vergemakkelijkt glioma celmigratie [36] en is betrokken bij angiogenese door het verhogen van de dichtheid van microvaten en tumormassa bij een tumor xenograft model [30]. Wang et al.
Aangetoond dat de overexpressie van Robo1 in nieuwe bloedvaten in tumoren veroorzaakt kanker neovascularisatie en groei via een interactie tussen Robo1 en zijn ligand, Slit2. Voorts hebben zij fosfoinositide 3-kinase (PI-3K) als een stroomafwaartse effector van Slit2 /Robo1 signalering. Dit suggereert dat er een Slit-Robo1-PI-3K cascade die kunnen leiden tot de vorming van fosfoinositol-3,4,5-trifosfaat en de daaropvolgende activering van kleine GTPases die cel beweging en hermodellering van het actine cytoskelet mediëren [30] , [35]. In tegenstelling tot andere studies aangevoerd dat de neerwaartse regulatie van Robo1 veroorzaakt door deleties of epigenetische veranderingen een rol in de progressie van de tumor [69] kunnen spelen - [73]. Wij stellen voor dat een weefsel-specifieke expressie patroon bestaat voor de slit-Robo genen.

In de huidige studie, vonden we dat Robo1 vaak werd uitgedrukt op hoge niveaus in invasieve cellen en op een laag niveau in niet-invasieve cellen , terwijl miR-218 verschijnt het tegenovergestelde patroon van expressie. Toen we getransfecteerde de miR-218-expressievector en remmende oligonucleotiden in MKN28-M en MKN28-NM cellen respectievelijk een inverse expressiepatroon werd waargenomen tussen miR-218 en Robo1, dat wil zeggen wanneer miR-218 expressie hoog was, Robo1 expressie was laag en vice versa. Dit resultaat werd bevestigd in klinische monsters en luciferaseactiviteit assays. We hebben ook gemerkt dat de inductie van de expressie van Robo1 door de Robo1 mutant construct zonder de miR-218 bindingsplaats kon miR-218-gemedieerde onderdrukking van de tumorcel invasie te keren. Daarentegen knockdown van Robo1 genexpressie door RNAi had een effect op het verminderen tumorcel invasie vergelijkbaar met die van het herstel van miR-218, hoewel Robo1 knockdown alleen een zwak effect aangetoond. Dit kan zijn omdat Robo1 is niet het enige doel van miR-218 die tumormetastase relevant is. Deze bevindingen geven aan dat de invasie onderdrukkingseffect van miR-218 ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door een afname Robo1 expressie. Dit is de eerste studie aangetoond dat de tumor-geassocieerde gen Robo1 negatief wordt gereguleerd door miR-218 via een specifieke doelplaats (nt 971-978) in de 3'-UTR. De Robo1 receptor is cruciaal voor de reactie op extracellulaire signalen en cellulaire fenotypische veranderingen; daarom kan strakke regulering van de Robo1 receptor door miR-218 robuuster signaaltransductie te vergemakkelijken. Anti-Robo1 monoklonaal antilichaam is gerapporteerd dat het een effectieve behandeling voor Robo1 expressie kanker [30], [33] zijn. In de huidige studie, vonden we een nieuwe remmer van Robo1, miR-218, die mogelijk kunnen worden gebruikt om bepaalde vormen van kanker te behandelen.

Zoals hierboven vermeld, Slit1, Slit2 en Slit3 bestaat uit de Slit familie van eiwitten. Hoewel de genen overlappen de expressiepatronen en functies onderscheiden. De eerste twee eiwitten is bekend dat ze betrokken zijn bij axon guidance en celmigratie [37], [74], terwijl Slit3 is betrokken bij de ontwikkeling van organen en orgaansystemen, met inbegrip van het diafragma en de nieren [75]. In overeenstemming met deze gegevens, vonden we dat Slit2, maar niet Slit3, wisselwerking met Robo1 GC invasie te promoten.

Daarnaast hebben we aangetoond dat de miR-218-coderende genen bevonden zich in en samen getranscribeerd met Slit genen , die Robo1 liganden, waardoor een negatieve feedback lus die Slit /Robo1 signalering regelt waren. Sailen Barik aangetoond dat een intron miRNA, miR-338, zwijgen genen die functioneel antagonistisch zijn gastheer genproduct, waardoor een positieve feedback lus die helpt bij de fysiologische rol van de ontvangende gen [76].

• PLoS ONE: Vascular CXCR4 Expression - een roman Antiangiogene Target bij maagkanker
• PLoS ONE: Silencing van Claudin-11 is geassocieerd met verhoogde Invasiviteit van maagkanker Cells