PLoS Genetics: MiR-218 Hemmt Invasivität und Metastasierung von Magenkrebs durch Targeting die Robo1 Receptor

Abstrakt

MicroRNAs spielen eine Schlüsselrolle bei der Tumormetastasierung. Hier beschreiben wir die Regulation und Funktion von miR-218 in Magenkrebs (GC) Metastasierung. miR-218-Expression mit der Expression eines seiner Wirtsgene, Slit3 in metastatic GC verringert. Allerdings ist Robo1, eine von mehreren Slit-Rezeptoren, negativ reguliert durch miR-218, so dass eine negative Rückkopplungsschleife zu etablieren. Verminderte miR-218 Ebenen Robo1 Repression eliminieren, die die schlitz Robo1 Weg durch die Wechselwirkung zwischen Robo1 und Slit2 somit Auslösen der Tumormetastasierung aktiviert. Die Wiederherstellung von miR-218 unterdrückt die Expression Robo1 und hemmt das Tumorzellinvasion und Metastasierung In-vitro-
und in vivo
. Zusammengenommen beschreiben unsere Ergebnisse eine Slit-miR-218-Robo1 Regelkreis, deren Störung GC Metastasierung beitragen können. miR-218-Targeting kann eine Strategie zur Verfügung stellen für die Tumormetastasierung zu blockieren.

Autor Zusammenfassung

MicroRNAs als spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung identifiziert wurden, aber ihre Auswirkungen auf die GC-Metastasen wurde schlecht erforscht. Wir haben entdeckt, miR-218, das als Suppressor der Tumormetastasierung Funktionen und ist mit klinischen Stadium, Lymphknotenmetastasen korreliert und Prognose bei Patienten mit GC. Unsere Ergebnisse zeigen, dass miR-218 Teil eines Regelkreises ist die Slit-Robo1 Weg beteiligt sind. In metastatischen Tumorzellen wurde miR-218 zusammen mit Slit3 unterdrückt, eines seiner Wirtsgene. Unterdessen wird Robo1, eine von mehreren Slit-Rezeptoren, als Reaktion auf die Abnahme der miR-218 nach oben reguliert, die ihrerseits eine reaktive Aufregulation der schlitz Robo1 Weg durch eine Wechselwirkung mit Slit2 induziert, wodurch Tumorzellmigration und Invasion zu erleichtern. Solche Erkenntnisse liefern nicht nur neue Einblicke in die Mechanismen metastasiertem in GC, sondern auch Beweise für eine neue miRNA-vermittelten regulatorischen Modus von Rezeptor-Signal liefern

Citation. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) miR-218 Hemmt Invasivität und Metastasierung von Magenkrebs durch die Robo1 Receptor-Targeting. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

Editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 15. Juli 2009; Akzeptiert: 10. Februar 2010; Veröffentlicht: 12. März 2010

© 2010 Tie et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr 30670970, Nr 30873026, Nr 30672369, Nr 30530780) und der National Grundlagenforschung Programm von China (No.2010CB529300) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Die Fortschritte in der diagnostischen und therapeutischen Ansätze für eine langfristige Überleben für Magenfrühkarzinomen (GC) zu ausgezeichneten Erwartungen geführt. Allerdings bleibt schlecht ist die Prognose für fortgeschrittene GC mit umfangreichen Invasion und Metastasierung [1]. Um Tumorzellen zu metastasieren müssen eine Reihe von sequentiellen und selektiven Ereignisse passieren, einschließlich der Ablösung, Migration, lokale Invasion, Angiogenese, intravasation, Überleben im Kreislaufsystem, Extravasation und Nachwachsen in verschiedenen Organen. In der metastatischen Kaskade, Invasion von GC in das umgebende Gewebe ist ein wichtiger erster Schritt [2] - [4]. Allerdings haben die Mechanismen der Invasion noch nicht vollständig aufgeklärt.

Eine große Anzahl von microribonucleic Säuren (microRNAs oder miRNAs) wurden in Krebsmetastasen vor kurzem verwickelt [5], einschließlich miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520c und miR-205 in Brustkrebs [6] - [11]; miR-224 und miR-21 in Prostatakrebs [12], [13]; miR-29c in nasopharyngealen Karzinomen [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7 und miR-452 in Urothelkarzinome [15]; miR-182 in Melanomen [16]; miR-92b und miR-9/9 * bei Hirntumoren [17]; und miR-21 in kolorektalen Karzinoms [18]. Aber nur sehr wenige bekannt miRNAs in GC Metastasierung beteiligt werden berichtet. miRNAs sind natürlich vorkommende, kurze, nicht kodierende RNA-Moleküle, die sich negativ auf die Genexpression regulieren [19]. Bei Säugetieren sind reife miRNAs erzeugt aus pri-miRNAs und prä-miRNAs über eine sequentielle Verarbeitung von Drosha und Dicer und werden in vielen Organismen gefunden. Sie bestehen aus 21-24 Nukleotiden, integrieren in RNA-Silencing induzieren Komplexe, und eine Verbindung zu den nicht übersetzten Regionen 3 (3'-UTR) von spezifischen Ziel Boten-RNAs (mRNAs) Übersetzung zu unterdrücken oder den Abbau der Ziel-mRNAs induzieren [20 ]. Die Schwellen Erkenntnisse haben gezeigt, dass miRNAs Schlüsselrollen in verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Proliferation, Apoptose, Stressresistenz, Fettstoffwechsel, Tumorentstehung und Metastasierung [21] - [23]. Ein besseres Verständnis der Veränderungen in miRNA-Expression während der GC-Invasion kann zu einem besseren Verständnis der GC-Entwicklung, sowie mögliche Verbesserungen bei der Diagnose und Behandlung von fortgeschrittenem GC führen.

In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt hoch (MKN28-M und SGC7901-M) und niedrige invasive Zelle Subleitungen (MKN28-NM und SGC7901-NM) eine sich wiederholende Transwell-Test unter Verwendung von in-vitro-
. Wir untersuchten dann die globale miRNA-Expressionsprofil in jeder subline Zelle ein miRNA-Microarray mit unterschiedlich exprimiert miRNAs zu identifizieren, die menschliche GC-Invasion im Zusammenhang. Insgesamt wurden 45 miRNAs gezeigt im Vergleich zu nicht-invasive GC-Zellen in der invasiven unterschiedlich exprimiert werden. Unter diesen miR-218, ein deutlich herunter reguliert miRNA in hochinvasiven Zellen wurde gezeigt, eng mit GC tumorigenesis und Metastasierung bei Patienten korreliert werden. In jüngerer Zeit hat eine Abnahme der miR-218 in verschiedenen Arten von festen Tumoren berichtet, einschließlich Prostatakrebs, GC, Lungenkrebs, und Gebärmutterhalskrebs [24] - [27], aber diese Abnahme der miRNA-218 einfach wurde abgesiebt als eine der Dutzende von möglichen miRNAs von Interesse in den oben beschriebenen Krebsarten ist. Keine weiteren Untersuchungen wurden ausgeführt, um die Bedeutung von miR-218 in Tumormetastasierung zu beurteilen. Hier haben wir festgestellt, dass miR-218 Expression verringert wurde korreliert mit der fortgeschrittenen klinischen Stadium, Lymphknotenmetastasen und einer schlechten Prognose bei Patienten, und erneut die Expression von miR-218 in metastatischen Zellen konnte die Migration zu inhibieren, Invasion und Metastasenbildung beide in-vitro-
und in vivo
. Mit einer bioinformatischen Suche nach miR-218 Ziele, geortet wir den Rezeptor Robo1 als funktionelle Ziel der miR-218, und wir bestätigt, dass die Interaktion zwischen miR-218 und Robo1 GC Zellmotilität entscheidend war durch den Nachweis, dass es eine inverse Korrelation zwischen miR -218 und Robo1 in GC-Zellinien sowie in GC-Patienten. Darüber hinaus entdeckten wir eine faszinierende Gegenkopplungsschleife beteiligt Slit, miR-218 und Robo1, in der miR-218 in den Introns von zwei verschiedenen Mitgliedern des Slit-Proteinfamilie befindet sich von einem von zwei Genen abgeleitet werden. Darüber hinaus Mitglieder dieser Familie sind Liganden des Robo1 Rezeptor. Wir haben gezeigt, dass die Expression der beiden miRNA Vorläufer-Gene (miR-218-1 und miR-218-2) korreliert mit der Expression der Wirtsgene (Slit2 und Slit3, beziehungsweise) und dass die reife miR-218 vor allem aus dem miR abgeleitet wurde -218-2 Vorläufer, mit einer gleichzeitigen Reduktion der Wirt Slit3 aber nicht von Slit2 bei metastasierendem GC-Zellen. Somit Aufregulation von Robo1 in Reaktion auf die Abnahme der miR-218 induziert eine reaktive Aufregulation der schlitz Robo1 Weg durch seine Wechselwirkung mit Slit2, damit Tumorzellinvasion und Metastasierung zu erleichtern. Unsere Ergebnisse liefern nicht nur neue Einblicke in die Mechanismen metastasiertem in GC, aber sie zeigte auch einen neuartigen Regulationsmechanismus der Rezeptor-Signalisierung.

Ergebnisse |

Etablierung und Charakterisierung von Zell Subleitungen mit verschiedenen invasiven und metastatischen Potenziale

, um die GC Metastasierung Modelle herzustellen, haben wir invasive und nicht-invasive Zelle Subleitungen von den menschlichen GC-Zelllinien SGC7901 und MKN28 die wiederholte Transwell-Ansatz (1A, Materialien und Methoden sehen). Kurz gesagt, wurde ein sich wiederholendes Invasionstest durchgeführt, und die Zellen, die die Membranen und Zellen einzudringen gescheitert, die die Fähigkeit hatte, durch die Kollagen-beschichtete Membran in allen Auswahlrunden wurden zu wandern getrennt. Nach zehn Runden der Selektion, erhalten wir invasive (MKN28-M und SGC7901-M) und nicht-invasive Zelle Sublinien (MKN28-NM und SGC7901-NM). Die metastatischen Eigenschaften jeder Zelle subline wurden dann charakterisiert In-vitro-
und in vivo
. Wie in 1B und 1C gezeigt, war Migrationsfähigkeit von MKN28-M-Zellen etwa 4-fach größer als die von MKN28-NM-Zellen. Ebenso war das invasive Potential etwa 5-fach größer für MKN28-M-Zellen im Vergleich zu MKN28-NM-Zellen. In den in vivo
Studien wurde Metastasierung von Tumorzellen in Nacktmäusen beobachtet. Wie in Figur 1D und 1E gezeigt ist, nahezu keine metastatic GC-Zellen wurden in der Lunge oder Leber von Nacktmäusen bei 10 Wochen nach der Injektion von MKN28-NM-Zellen nachgewiesen, während injiziert meisten der Mäuse mit MKN28-M-Zellen offensichtlich, Lunge oder Leber angezeigten Metastasen. Ähnliche Ergebnisse wurden für SGC7901-M und SGC7901-NM-Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Keine signifikanten Unterschiede in der Zellproliferation oder Zellzyklus-Verteilung unter diesen Zell Subleitungen beobachtet wurden (Text S1, Abbildungen S1 und S2).

Identifikation von Metastasen bezogenen miRNAs von Array-basierten Hybridisierung

Um miRNAs möglicherweise beteiligt GC Invasion identifizieren, wir globale miRNA-Expression in jeder Zelle Subline mit der microRNA Array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Dänemark) untersucht, die für reife humane miRNAs von 847 Fangsonden besteht. Die Microarray-Ergebnisse zeigten, dass die Expression von 124 miRNAs signifikant zwischen der hoch invasive Variante MKN28-M und dem nicht-invasive Zelle subline MKN28-NM abwichen. Von diesen wurden 83 upregulated und 41 nach unten reguliert wurden. Im Vergleich mit SGC7901-NM wurden 62 miRNAs differentiell in der SGC7901-M Zelle subline ausgedrückt, darunter 47 nach unten reguliert und 15 hochregulierten miRNAs. Insgesamt wurden 11 miRNAs gefunden in beiden MKN28-M und SGC7901-M-Zellen im Vergleich zu denen in den entsprechenden nicht-invasive Subleitungen (Tabelle S1).

Von den 45 werden nach oben reguliert und 34 miRNAs wurden differentiell downregulated regulierten miRNAs war miR-218 eine von denen, die deutlich Ausdruck Differenz angezeigt. miR-218 wurde berichtet, dass in Gebärmutterhalskrebs [25], GC [26], Lungenkrebs [27] und Prostatakrebs [28], die auf mögliche Beteiligung an den onkogene Transformation und Tumormetastasierung nach unten reguliert werden. Jedoch war miRNA-218 nur eine der vielen möglichen miRNAs von Interesse in Krebserkrankungen. In dieser Arbeit wurde wesentlich detaillierter miR-218 untersucht. Um die Microarray-Ergebnisse bestätigen, wir beurteilt miR-218 Expression in den GC-Zelle Subleitungen zuvor erwähnt und in der unsterblichen Magenepithelzellen Zelllinie GES mit qRT-PCR [29]. miR-218 Expression wurde signifikant verringert in MKN28-M und SGC7901-M-Zellen und lagen in allen vier GC-Zelle Subleitungen im Vergleich zu immortalisierten humanen Magenepithelzellen GES-Zellen (2A). Weiterhin verglichen wir miR-218-Expression in der primären GC Tumor gegen die metastatische Lymphknoten in 10 Patienten mit Stadium III /IV GC qRT-PCR verwendet wird. Wie in 2B gezeigt, reife miR-218 Levels in 7 von 10 Lymphknotenmetastasen signifikant verringert waren, was darauf hinweist, dass miR-218 eine kausale Rolle bei GC Metastasierung spielen können.

Verminderte miR-218 Expression in GC verbunden war mit der fortgeschrittenen klinischen Stadium, Lymphknotenmetastasen und eine schlechte Prognose der Patienten

Um die potentiellen klinisch-pathologischen Auswirkungen der veränderten miR-218 Expression bestimmen, untersuchten wir die Expression von miR-218 in 40 GC Gewebe (T) und nicht-Tumor-Mukosa (N) durch qRT-PCR. Der Begriff -ΔCt verwendet wurde, das Expressionsniveau von miR-218 zu beschreiben. In Übereinstimmung mit den oben genannten Daten verifiziert die Ergebnisse, dass die miR-218-Expressionsniveau in GC (-13,81 ± 0,15, Mittelwert ± SE) Gewebe als signifikant niedriger war in nicht-neoplastische Schleimhaut (-11,62 ± 0,15, Mittelwert ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, gepaart t
-test) (3A). Die Korrelationen zwischen dem miR-218-Expressionsniveau und klinisch-pathologische Merkmale der GC sind in Tabelle 1 Statistisch signifikante Assoziationen zwischen der miR-218-Expressionsniveau und klinischen Stadium und zwischen der miR-218-Expressionsniveau und GC Metastasierung zusammengefasst wurden in dieser Studie beobachtet. Die mittlere Expression von miR-218 war -14,25 ± 0,17 in den 22 Fällen mit fortgeschrittenen Stadium (Stadium III und IV) Krankheit, während der mittlere Ausdruck -13,27 ± 0,20 ( war P
= 0,0010, Mann-Whitney Test) in den 18 Fällen mit Frühstadium (Stadium I und II der Erkrankung). In den 29 Fällen von GC mit Lymphknotenmetastasen betrug die mediane Expression von miR-218 -14,09 ± 0,16, die deutlich niedriger als der Median Ausdruck war (-13,07 ± 0,24) in den 11 nicht-metastasierten GC Fällen ( P
= 0,0036). Die Expression von miR-218 in GC-Patienten korrelierte nicht mit dem Alter, Geschlecht, Größe des Tumors, oder der Zelldifferenzierung. Darüber hinaus untersuchten wir, ob die Höhe der miR-218 Expression mit Überleben bei Patienten mit GC verbunden war. Patienten wurden anschließend in niedrige Expression aufgeteilt (n = 20) und eine hohe Expression Gruppen (n = 20), bezogen auf miR-218 Ebenen größer oder kleiner als der Mittelwert (-13,81) (3B). Kaplan-Meier-Überlebensanalysen zeigten, dass Patienten, deren primäre Tumoren angezeigt geringe Expression von miR-218 eine kürzere mediane Überlebenszeit hatte. Die Drei-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit niedrigem miR-218 Expression war 30%, was bei Patienten mit hohem miR-218 Expression (65% deutlich niedriger als die Überlebensrate betrug; P
= 0,0012, Log- Rank-Test;. 3C)

Die ektopische Expression von miR-218 gehemmt Tumorzellinvasion und Metastasierung in-vitro-
und in vivo

Zur Untersuchung die Rolle der miR-218 in GC-Metastasen wurden MKN28-M-Zellen, die mit pGenesil-1-miR-218 oder ein Steuervektor, der eine nicht-spezifische miRNA, Cel-miR-67, unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ausdrücken ). Die Zellen wurden dann mit 400 mg /L G418 ausgewählt MKN28-M-miR-218 und MKN28-M-miR-Steuer stabile Zellen zu erzeugen. Wir fanden heraus, dass die ektopische Expression von miR-218 führte zu einer etwa dreifache Reduktion der Migration und Invasivität. Um zu bestimmen, ob der Verlust von miR-218 würde die Migration oder Invasion von Krebszellen zu fördern, wir zum Schweigen miR-218 mit einem Antisense-Oligonucleotid-Inhibitor in der MKN28-NM-Zelllinie, was zu einer drei- bis vierfache Zunahme der Zellmigration und Invasivität (4A und 4B). Um zu testen, ob die Hemmung der Tumorinvasion von miR-218 durch Beeinträchtigung der invasiven Fähigkeit von Tumorzellen verursacht wird, ausgeschlossen wir die Wirkung von miR-218 auf die Proliferation und Zellzyklus-Verteilung von Magenkrebszellen. Überexpression von miR-218 hat nicht die Proliferation beeinflussen und die Zellzyklus-Verteilung von MKN28-M-Zellen in vitro
(Abbildung S5A und S5D). Um die Hemmung von Untersuchung in vivo
Tumormetastasierung von miR-218, wir implantiert MKN28-M-miR-218 Zellen, die stabil miR-218 oder Kontrollzellen in Nacktmäusen durch die seitliche Schwanzvene wurden exprimiert. Lungen- und Lebermetastasen von GC war in Mäuse injiziert mit MKN28-M-miR-Kontrollzellen zu erkennen. Im Gegensatz dazu wurden einige metastatischen Tumoren in Mäusen nachgewiesen injiziert MKN28-M-miR-218-Zellen (4C). Darüber hinaus beobachteten wir gleichzeitig das Wachstum der Primärtumoren und das Auftreten von Fernmetastasen in der nackten Mäusen subkutan mit MKN28-M-miR-218-Zellen oder Kontrollzellen injiziert. Die Ergebnisse zeigten, Lungen- oder Lebermetastasen in 3 von 10 Mäusen offensichtlich war, injiziert mit MKN28-M-miR-Kontrollzellen; Im krassen Gegensatz dazu wurden keine Metastasen in Mäusen mit MKN28-M-miR-218-Zellen (S5E) injiziert gefunden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Daten aus Schwanzvene Assays erhalten, die Krebsmetastasierung beurteilen und anzugeben, dass miR-218 die Fähigkeit der Metastasierung zu unterdrücken, hat, ohne die Zellproliferation zu beeinflussen.

war Robo1 eine direkte funktionale Ziel von miR-218 in GC Metastasierung

um zu beurteilen, wie ein niedriges Niveau der miR-218 Expression der Invasion und Metastasierung von GC beiträgt, suchten wir nach den möglichen regulatorischen Ziele von miR-218 Vorhersage-Tools, einschließlich MIRANDA, PicTar und TargetScan. Obwohl Hunderte von verschiedenen Zielen vorhergesagt wurden, die Gene beteiligt in Migration oder Invasion können die relevanten Ziele in Bezug auf die biologischen Funktionen von miR-218 sein. Wir führten dann eine funktionelle Klassifizierung der prognostizierten Ziele der DAVID-Programm (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Von diesen Genen wird Robo1 als Proto-Onkogen und Häfen migrationsfördernden Aktivität angesehen [30] - [35]. Mertsch et al.
Gezeigt, dass Robo1 Gliom-Zellmigration erleichtert durch Slit2 vermittelt [36]. Schmid et al.
Festgestellt, dass Brusttumorzellmigration durch die Slit2-Robo1 Wechselwirkung induziert wird In-vitro-
[37]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Robo1 ein Ziel für die miR-218 sein kann. Um unsere Hypothese zu testen, untersuchten wir die Expression von miR-218 und Robo1 in GES und in nicht-invasive (MKN28-NM und SGC7901-NM) und invasive (MKN28-M und SGC7901-M) GC-Zellen. Die Ergebnisse zeigten eine negative Korrelation zwischen den Ebenen von miR-218 und Robo1 mRNA in diesen Zellen (S3A). Darüber hinaus beobachteten wir, dass Robo1 mRNA (Abbildung S3B) und Protein (Abbildung 5B2) Ebenen verringert wurden, wenn miR-218 von pGenesil-1-miR-218 in MKN28-M-Zellen (5B1) ausgedrückt wurde. Die Rückseite wurde für Robo1 Expression beobachtet, wenn miR-218 wurde in MKN28-NM-Zellen (5C1 und Abbildung 5C2) umgeworfen. Die inverse Beziehung zwischen miR-218 und Robo1 Expression wurde durch Immunhistochemie (Text S1) in 40 Fällen von Magenkrebs bestätigt, in abgestimmt angrenzenden normalen Geweben, die auch in klinisch-pathologischen Studien verwendet wurden, und in 29 abgestimmt Metastasen. Die Ergebnisse zeigen, dass Robo1 in GC upregulated wurde, vor allem bei metastasierendem GC (Abbildung S4), in der miR-218 eine relativ niedrige Ausdruck hat.

weitere direkte Beweise dafür zu erhalten, dass Robo1 ein Ziel von miR-218 wir die Bindungsstelle von miR-218 in der 3'-UTR der mRNA Robo1 (5A) untersucht. Wir konstruierten ein Luciferase-Reportergen (Luc-Robo1), in denen die Nukleotide der 3'-UTR Robo1 komplementär zu miR-218 (nt 971-978) in den PMIR-REPORT miRNA Ausdruck Reportervektor eingefügt wurden [38]. Dementsprechend wir beide auch ein mutiertes reporter (Luc-Robo1-mu) erzeugt wird, in dem die ersten sechs Nukleotide in der miR-218 seed-Region komplementären Stellen deletiert wurden, und ein Steuer reporter, die ein nicht-verwandten Fragment von cDNA enthielt (Luc-Ctrl). miR-218-Expressionsplasmide wurden cotransfiziert mit Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, oder Luc-Ctrl in MKN28-M-Zellen. Die Tests zeigten, dass die Luciferase-Aktivität in den Luc-Robo1-transfizierten Zellen wurde signifikant auf die Luciferase-Aktivität in den mutierten und negativen Kontrollzellen sank im Vergleich ( P
< 0,05), was darauf hindeutet, dass miR-218 reduziert die Luciferase-Aktivität von Luc-Robo1 hatte aber keine Wirkung auf Luc-Robo1-mu (5D). Daher schlossen wir, dass die insertierte Fragment Robo1 (nt 971 -
978). War das Ziel von miR-218

Robo1 überexprimiert in Krebszellen gezeigt worden zu sein und ist bekannt, die Tumorangiogenese und Metastase über eine Wechselwirkung mit Slit [39], [40] zu fördern. Um zu testen, ob Robo1 funktionell von miR-218 reguliert ist, erzeugt man ein Robo1 Expressionskonstrukt nur ein Fragment des vorhergesagten miR-218-Bindungsstelle und Robo1 mutierten Expressionsvektor enthält völlig fehlt die 3'-UTR. Wir haben auch die Robo1 siRNA. MKN28-M-miR-218-Zellen, die stabil ektop miR-218 ausgedrückt, wurden mit dem Robo1 transient Konstrukt oder dem mutierten Konstrukt (ohne miR-218-Bindungsstelle) und MKN28-M-Zellen wurden mit Robo1 siRNA oder eine transfizierte negative Kontrolle siRNA. MKN28-M-miR-218-Zellen mit dem mutierten Konstrukt transfiziert Robo1 zeigte eine 3,8-fache Steigerung der Invasionsfähigkeit im Vergleich zu Zellen, die mit dem Konstrukt transfiziert Robo1. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Einführung von mutierten Robo1 cDNA, die die miR-218-Bindungsstelle in die miR-218-überexprimierenden Zellen fehlte umgekehrt die Wirkung von miR-218-vermittelten Unterdrückung der Zellinvasion. Allerdings wurde von miR-218 in Gegenwart des Robo1 3'-UTR enthält, die miR-218-Bindungsstellen die Wirkung von Robo1 verdrängt. Preissturz von Robo1 von siRNA in MKN28-M-Zellen Zellinvasion gehemmt, die auf ein ähnliches Niveau wie nach der Transfektion mit der miR-218-exprimierenden Vektor (5E und 5F) beobachtet fiel. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-218 unterdrückt direkt Robo1-vermittelte Zellinvasion.

Slit2, aber nicht Slit3 kann mit Robo1 interagieren, angereichert durch das Fehlen von miR-218, GC-Invasion fördern

Zwei Arten von miRNAs vorhanden sind: intergenic und Intron. Erstere werden in nicht-kodierenden Regionen von Genen liegt, und ihre entsprechenden pri-miRNAs sind von ihren eigenen Promotoren durch RNA-Polymerase II transkribiert allgemein. Letztere sind in den Introns der Gene Host befindet, und deren Biogenese von den Wirts Genpromotoren [41], [42] gesteuert. miR-218 ist ein Intron miRNA. Zwei Gene kodieren für reife miR-218, miR-218-1 und miR-218-2, die innerhalb des Introns 15 von Slit2 befinden und Intron 14 von Slit3, bzw. (6A). Die Intron-Position der beiden miR-218 Gene aufgefordert, uns zu fragen, ob miR-218-1 und miR-218-2 transkribiert zusammen mit ihrem Wirt Gen mRNAs. Um diese Hypothese zu testen, haben wir qRT-PCR verwendet, um die Expression der miR-218-1 Vorstufe zu untersuchen, die miR-218-2-Vorläufer, reifen miR-218, Slit2 mRNA und Slit3 mRNA in den GC-Gewebe im Überleben verwendet Analyse. Die statistische Analyse der Korrelationskoeffizient der qRT-PCR-Ergebnisse zeigten eine signifikante positive Korrelation zwischen den Ebenen der Slit2 mRNA und miR-218-1 und zwischen den Ebenen der Slit3 mRNA und miR-218-2 (6B und 6C). Diese Ergebnisse zeigen, dass die miR-218 codierenden Gene, miR-218-1 und miR-218-2, transkribiert werden zusammen mit ihren Wirtsgene, Slit2 und Slit3 sind. Eine signifikante positive Korrelation zwischen den Ebenen von miR-218 und miR-218-2 (6D) wurde in GC gesehen; Es wurde jedoch keine solche Korrelation zwischen den Ebenen von miR-218 und miR-218-1 (6E) gesehen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Herunterregulierung von miR-218 in GC wird durch eine Abnahme der miR-218-2 gefördert, aber nicht in miR-218-1. Im Einklang mit dieser Schlussfolgerung wurde Slit3 Expression signifikant in GC reduziert (-22,43 ± 0,21, Mittelwert ± SE) im Vergleich zu normalen Magen-Gewebe (-20,79 ± 0,23, Mittelwert ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, gepaart t
-test) (6F), während Slit2 Ausdruck nicht signifikant verschieden war ( P
= 0,0772, gepaart t
-test) ( Figur 6G). Zusammenfassend deuten unsere experimentellen Ergebnisse, dass signifikante Hochregulation des Robo1 Gens in Reaktion auf die Entfernung von miR-218 kann eine nachfolgende Aufregulation der schlitz Robo1 Weg durch seine Wechselwirkung mit Slit2 induzieren, Tumorzellmigration und Invasion zu erleichtern.

Diskussion

eine Krankheit zu untersuchen, ist es wichtig, ein ideales Modell zu konstruieren. In der vorliegenden Studie isolierten wir invasive und nicht-invasive Zell-Subpopulationen von etablierten humanen GC-Zelllinien, die wiederholte Transwell-Ansatz, der in vielen Studien zur Untersuchung von Tumormetastasen [43] erfolgreich angewendet wurde - [48]. Die Ergebnisse des metastasierten Prüfung In-vitro-
und in vivo
zeigten, dass die etablierten Zell Subleitungen verschiedene invasive und metastatische Fähigkeiten hatte. Hier, abgeschirmt wir nicht nur Zelle Subleitungen abgeleitet von GC-Zelllinien mit hoher invasive Potential, aber auch solche mit niedrigem invasive Potential. Mit Ausnahme ihrer metastatischen Eigenschaften waren die ausgewählte Zelle Sublinien beide sehr ähnlich, da sie den gleichen genetischen Hintergrund teilen. Da der Hauptunterschied zwischen den beiden Arten von Unterlinien metastatischen Fähigkeit ist, die Gene, die zwischen ihnen unterscheiden sollten mit Metastasen korrelieren gut. Darüber hinaus sind unsere Verfahren ist in der Lage invasion Stufen von Metastasen zu unterscheiden und ermöglicht die Untersuchung spezifischer Schritte bei der Metastasierung, die nicht in dem Live-Tiermodell bewertet werden.

Kürzlich wurden miRNAs berichtet zu fördern [49] [50] oder zu unterdrücken [51] - [54] Tumormetastasierung, eine neue Perspektive auf dem metastatischen Prozess. Dennoch wird die Rolle von miRNAs in GC Metastasierung fehlt. In diesem Bericht untersucht und wir zum ersten Mal 45 Metastasierung bezogene miRNAs in der GC basiert auf einer gut etablierten Metastasierung Zellmodell erhalten. Der Befund, dass miR-218 wurde in metastatic GC abreguliert ist interessant, da miR-218 Niveaus verringert haben in verschiedene Arten von soliden Tumoren berichtet [24] - [27], [55], was anzeigt, dass der Verlust von miR-218 eine gemeinsame Veranstaltung in tumorigenesis sein. In der vorliegenden Studie haben wir uns auf die Wirkung von miR-218 auf GC Metastasierung und gezeigt, dass miR-218 wirkt als Tumorsuppressor in GC Metastasierung. Die Wiederherstellung der miR-218 reduziert die Zellmigration und Invasion In-vitro-
und Tumormetastasierung in vivo
. Zur Erzielung von stabilen Zelllinien, die überexprimiert miR-218, wir MKN28-M-Zellen mit miR-218 Plasmide und abgeschirmt von G418 transfiziert. Wir wählten zwölf Zellkolonien in der miR-218-transfizierten Gruppe und fand 10 von 12 Kolonien zeigten bemerkenswert einheitlich, stabile und starke Expression von miR-218. Darüber hinaus zeigten drei zufällig ausgewählte monoklonale Zelllinien ähnliche Reduktion in invasive ablility. Allerdings führen Strategien Plasmidtransfektion oft in geringeren Integrationseffizienz im Vergleich zu viralen Expression auf die Möglichkeit der stochastischen Auswahl an seltenen funktionell heterogenen Varianten von der anfänglichen Massenpopulation führt. Deshalb ist die zukünftige Verwendung von viralen Expressionssystemen sollte eine unvoreingenommene Ausgangspopulation schaffen unsere Hypothese zu testen.

Im Rahmen unserer Forschung auf, wie der Verlust von miR-218 wirkt Metastasierung GC haben wir gezeigt, dass Robo1 ein kritischer war Downstream-Ziel von miR-218. Es ist bekannt, daß Robo ein Axon Führung Rezeptor für Slit ist und bei Tieren im Bereich von Fruchtfliegen zu Säugetieren konserviert. Bei Säugetieren drei Slit (Slit1-3) und vier Robo (Robo1-4) Gene wurden beschrieben [56], [57]. Die Slit-Robo-Interaktionen vermitteln Signale abstoßend Hinweise auf Axonen und Wachstumskegel während neuronale Entwicklung und beteiligen sich an T-Zellen und Monozytenchemotaxis vermittelnde [58] - [64]. Wie für andere Entwicklungswege, anomale Expression des Slit - [68] -
Robo-Gene wurde in einer Vielzahl von Tumorarten [65] beobachtet. Zum Beispiel in Proben Brustkarzinomgewebe wurde Robo1 gezeigt überexprimiert sein und nachgewiesen wurde, die Migration von Brustkrebszelllinien [37] zu induzieren. Slit2-Robo1 Signalisierung ermöglicht [36] Migration Gliom Zelle und wird an der Angiogenese beteiligt durch Gefäßdichte und Tumormasse in einem Tumor-Xenotransplantat-Modell zunehmende [30]. Wang et al.
Gezeigt, dass die Überexpression von Robo1 in neuer Blutgefäße in Tumoren Krebs Neovaskularisation und Wachstum über eine Wechselwirkung zwischen Robo1 und seinem Liganden, Slit2 induziert. Sie auch Phosphoinositid-3-kinase (PI-3K) als nachgeschalteter Effektor der Slit2 /Robo1 Signalisierung identifiziert. Dies legt nahe, dass es existiert eine schlitz Robo1-PI-3K-Kaskade, die zur Erzeugung von Phosphoinositol-3,4,5-triphosphat und die anschließende Aktivierung der kleinen GTPasen, die Bewegung und den Umbau des Aktin-Zytoskelett vermitteln Zelle führen kann [30] [35]. Im Gegensatz dazu haben andere Studien argumentiert, dass die Herabregulation von Robo1 verursacht durch Deletionen oder epigenetische Veränderungen können eine Rolle bei der Tumorprogression [69] spielen - [73]. Wir schlagen vor, dass eine gewebespezifische Expressionsmuster für die Slit-Robo-Genen besteht.

In der aktuellen Studie haben wir festgestellt, dass Robo1 oft auf einem hohen Niveau in invasive Zellen exprimiert wurde und in geringen Mengen in nicht-invasive Zellen , während miR-218 das Gegenteil Expressionsmuster. Wenn wir die miR-218-Expressionsvektor und hemmenden Oligonukleotide in MKN28-M und MKN28-NM-Zellen, die jeweils wurde ein inverses Expressionsmuster zwischen miR-218 und Robo1 beobachtet das heißt, wenn miR-218 Expression hoch war, Robo1 Ausdruck war niedrig und umgekehrt. Dieses Ergebnis wurde weiter in klinischen Proben und der Luciferase-Aktivitätstests bestätigt. Wir bemerkten auch, dass die Induktion der Expression von Robo1 durch die Robo1 mutierten Konstrukt ohne die miR-218-Bindungsstelle könnte miR-218-vermittelten Unterdrückung der Tumorzellinvasion umkehren. Im Gegensatz dazu Zuschlagsausdrucks Robo1 Gens durch RNAi hatte eine Wirkung auf die Tumorzellinvasion ähnlich dem von der Wiederherstellung von miR-218 zu reduzieren, obwohl allein Robo1 Knockdown eine schwache Wirkung demonstriert. Dies könnte daran liegen Robo1 nicht das einzige Ziel von miR-218 ist, die Tumormetastasierung relevant ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Invasion Unterdrückungseffekt von miR-218 zumindest teilweise durch eine Abnahme der Expression Robo1 vermittelt. Dies ist auch die erste Studie zu zeigen, dass der Tumor-assoziierten Gens Robo1 negativ von miR-218 über eine bestimmte Zielstelle (nt 971-978) innerhalb der 3'-UTR geregelt wird. Der Robo1 Rezeptor ist entscheidend für die Reaktion auf extrazelluläre Signale und zellulären phänotypischen Veränderungen; daher strenge Regulierung des Robo1 Rezeptors durch miR-218 kann robustere Signalübertragung erleichtern. Anti-Robo1 monoklonaler Antikörper berichtet wurde eine wirksame Behandlung für Robo1-exprimierenden Krebsarten zu sein [30], [33]. In der vorliegenden Studie fanden wir einen neuen Inhibitor der Robo1, miR-218, die möglicherweise verwendet werden können, einige Arten von Krebs zu behandeln.

Wie bereits erwähnt, Slit1, Slit2 und Slit3 umfassen die Slit-Familie Proteinen. Obwohl die Gene überlappen, sind ihre Expressionsmuster und Funktionen deutlich. Die ersten beiden Proteine ​​sind dafür bekannt, in axon Führung und der Zellmigration beteiligt zu sein [37], [74], während Slit3 wird bei der Entwicklung der Organe und Organsysteme, einschließlich der Membran und der Niere [75] beteiligt. In Übereinstimmung mit diesen Daten fanden wir, dass Slit2, aber nicht Slit3, mit Robo1 interagierten GC Invasion zu fördern.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die miR-218 kodierenden Gene in und transkribiert zusammen mit Slit-Genen befanden , die damit Robo1 Liganden, waren eine negative Rückkopplungsschleife zu schaffen, die Slit /Robo1 Signalweg reguliert. Sailen Barik gezeigt, dass ein Intron miRNA, miR-338, Gene zum Schweigen gebracht, die funktionell antagonistisch zu seinem Wirt Genprodukt, wodurch eine positive Rückkopplungsschleife zu schaffen, die in der physiologischen Rolle des Wirtsgens unterstützt [76].

• PLoS ONE: Vascular CXCR4 Expression - ein Roman Antiangiogenetische Ziel in Magenkrebs
• PLoS ONE: Silencing von Claudin-11 ist mit einem erhöhten Invasivität von Magenkrebs Zellen assoziiert