Финансирование:. Это исследование Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 30670970, No. 30873026, No. 30672369, № 30530780) и Национальной программы фундаментальных исследований Китая (No.2010CB529300). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Создание и характеристика клеточных сублиниях с различными инвазивным и метастатическим потенциалы Идентификация метастазирования, связанных с микроРНК с помощью массива на основе гибридизации Для того, чтобы определить потенциальные последствия клинико-измененную экспрессию микроРНК-218, мы исследовали уровни экспрессии микроРНК-218 в 40 GC тканей (Т) и слизистая неопухолевой (N), с помощью QRT-PCR. Термин -ΔCt был использован для описания уровня экспрессии микроРНК-218. В соответствии с приведенными выше данными, результаты подтвердили, что уровень микроРНК-218 выражение в GC (-13,81 ± 0,15, среднее значение ± SE) ткани была значительно ниже, чем в неопухолевых слизистой оболочки (-11,62 ± 0,15, среднее значение ± SE) ( P Эктопическая экспрессия микроРНК-218 заторможенной вторжения опухолевых клеток и метастазирования в пробирке для того, чтобы оценить, как низкий уровень экспрессии микроРНК-218 способствует инвазии и метастазирования GC, мы искали потенциальных регуляторных мишеней микроРНК-218 с использованием инструментов прогнозирования, в том числе Miranda, PicTar и TargetScan. Хотя сотни различных мишеней были предсказаны, те гены, участвующие в миграции или вторжения могут быть соответствующие цели в отношении биологических функций микроРНК-218. Затем мы провели функциональную классификацию прогнозируемых целей с помощью программы DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/~~HEAD=dobj). Из этих генов, Robo1 рассматривается как протоонкогена и гаваней миграции способствующего активности [30] - [35]. Mertsch и др. Обсуждение
<р> Достижения в области диагностических и терапевтических подходов привели к отличным ожиданиям для долгосрочного выживания для раннего рака желудка (GC). Однако прогноз по усовершенствованному GC с обширным инвазии и метастазированию остается на низком уровне [1]. Для того, чтобы метастазированию, опухолевые клетки должны пройти через серию последовательных и селективные событий, в том числе отслойки, миграции, местной инвазии, ангиогенеза, intravasation, выживание в кровеносной системе, транссудации и возобновление роста в различных органах. В метастатического каскада, вторжение GC в окружающие ткани является важным первым шагом [2] - [4]. Тем не менее, механизмы вторжения еще не были полностью выяснены.
<Р> Большое количество microribonucleic кислот (микроРНК или микроРНК) были недавно замешан в раковых метастазов [5], в том числе MIR-10b, MIR-21, микроРНК-126, микроРНК-335, микроРНК-373, микроРНК-146, микроРНК-520C и микроРНК-205 при раке молочной железы [6] - [11]; микроРНК-224 и микроРНК-21 при раке предстательной железы [12], [13]; микроРНК-29с в носоглоточных карцином [14]; микроРНК-10a, микроРНК-222, микроРНК-125b, микроРНК-7, и микроРНК-452 в уротелиальных карцином [15]; микроРНК-182 в меланоме [16]; микроРНК-92b и микроРНК-9/9 * в опухолях головного мозга [17]; и микроРНК-21 в колоректального рака [18]. Тем не менее, было зарегистрировано очень мало микроРНК, как известно, участвует в GC метастазирования. микроРНК в природе, короткие, некодирующие молекулы РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов [19]. У млекопитающих зрелые микроРНК генерируются из Pri-микроРНК и пре-микроРНК посредством последовательной обработки с помощью Drosha и Dicer и встречаются во многих организмов. Они состоят из 21-24 нуклеотидов, интегрироваться в РНК-индуцирующего глушителей комплексов, а также сопряжение с нетранслируемые области 3 '(3'-UTR) конкретных целевых информационных РНК (мРНК), чтобы подавить перевод или вызвать деградацию мРНК мишеней [20 ]. Новые данные показали, что микроРНК играют ключевую роль в различных биологических процессах, в том числе клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза, стрессоустойчивости, жировой обмен, онкогенеза и метастазирования [21] - [23]. Лучшее понимание изменений в экспрессии микроРНК во время GC вторжения может привести к лучшему пониманию развития GC, а также возможных путей совершенствования диагностики и лечения поздних стадий GC.
<Р> В настоящем исследовании мы установили высокий (MKN28-M и SGC7901-М) и низкие сублиний инвазивные клеток (MKN28-NM и SGC7901-NM) с использованием повторяющихся анализа Transwell в пробирке
. Затем мы проанализировали глобальный профиль экспрессии микроРНК в каждой ячейке сублиния с использованием микрочипов микроРНК для идентификации дифференцированно выраженных микроРНК, связанных с вторжением GC человека. В общей сложности было показано дифференцированно выражены в инвазивной против неинвазивных GC клеток 45 микроРНК. Среди них, микроРНК-218, значительно подавлена микроРНК в высоко инвазивные клетки, как было показано, тесно коррелирует с GC онкогенеза и метастазирования у пациентов. Совсем недавно, снижение MIR-218 было сообщено в нескольких видах солидных опухолей, включая рак простаты, GC, рак легких и рак шейки матки [24] - [27], однако это снижение микроРНК-218 был просто отсеивают как один из десятков потенциальных микроРНК, представляющих интерес в раковых заболеваний, описанных выше. Никакие дальнейшие исследования не проводились, чтобы оценить значение микроРНК-218 в метастазирование опухоли. Здесь мы обнаружили, что снижение экспрессии микроРНК-218 коррелировала с продвинутой стадии клинических, узловой метастаз лимфы, и плохим прогнозом у пациентов, и повторно экспрессия микроРНК-218 в метастатических клетках обладает способностью ингибировать миграцию, инвазию и формирование метастаз и в пробирке
и в естественных условиях
. Использование поиска биоинформатики для MIR-218 мишеней, мы точно определили рецептор Robo1 в качестве функциональной мишени микроРНК-218, и мы подтвердили, что взаимодействие между микроРНК-218 и Robo1 имеет решающее значение для GC подвижности клеток, демонстрируя, что существует обратная корреляция между MIR -218 и Robo1 в линиях клеток GC, а также у больных ГЦ. Кроме того, мы обнаружили, интригующим отрицательной обратной связи с участием щелью, микроРНК-218 и Robo1, в котором микроРНК-218 может быть получена из любого из двух генов, расположенных в интронов двух различных членов семейства белков щелью. Кроме того, члены этого семейства являются лигандами рецептора Robo1. Мы показали, что экспрессия двух генов-предшественников микроРНК (MIR-218-1 и MIR-218-2) коррелировала с экспрессией генов хозяина (Slit2 и Slit3, соответственно) и что зрелый микроРНК-218 в основном происходит от MIR -218-2 предшественник, с сопутствующим снижением хозяина Slit3 но не Slit2 в метастатических клетках GC. Таким образом, повышающая регуляция Robo1 в ответ на уменьшение MIR-218 индуцировали реактивную повышающую регуляцию пути Щелевой-Robo1 через его взаимодействие с Slit2, способствуя тем самым проникновению клеток и метастазирования опухолей. Наши результаты не только обеспечивают новое понимание механизмов метастатических в GC, но они также выявили новый механизм регулирования передачи сигналов рецептора.
Результаты
<р> Чтобы установить модели GC метастаз, мы создали инвазивные и неинвазивные сублиниях клетки из ГХ клеточных линий человека SGC7901 и MKN28 используя повторный подход Transwell (рис 1А, см материалы и методы). Вкратце, повторяющаяся анализ вторжения проводили, и те клетки, которые не удалось вторгнуться в мембраны и клетки, которые имели возможность мигрировать через мембрану коллагена покрытием во всех раундах отбора были разделены. После десяти раундов отбора, мы получили инвазивные (MKN28-М и SGC7901-М) и неинвазивные сублиниях клеток (MKN28-NM и SGC7901-NM). Метастатические свойства каждой ячейки сублиния затем характеризуются в пробирке
и В естественных условиях
. Как показано на рисунке 1В и 1С, миграция способность клеток MKN28-M был примерно в 4 раза больше, чем у MKN28-NM клеток. Аналогичным образом, инвазивный потенциал был около 5 раз больше, для клеток MKN28-М по сравнению с MKN28-NM клеток. В В естественных условиях
исследований, метастазов опухолевых клеток наблюдалась у голых мышей. Как показано на рисунке 1D и 1E, почти не метастатические GC клетки не были обнаружены в легких или печени голых мышей через 10 недель после инъекции MKN28-NM клеток, в то время как большинство мышей, которым вводили клетки MKN28-М присутствовали очевидные легких или печени метастаз. Аналогичные результаты наблюдались для SGC7901-M и SGC7901-NM клеток (данные не показаны). Не было обнаружено существенных различий в клеточной пролиферации или распределения клеточного цикла среди этих клеточных сублиниях (Текст S1, Рисунки S1 и S2).
<р> Для выявления микроРНК потенциально вовлеченных в GC вторжения, мы исследовали глобальное выражение микроРНК в каждой ячейке сублиния используя массив микроРНК (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Дания), которая состоит из 847 зондов для захвата зрелых человеческих микроРНК. Результаты микрочипов показали, что экспрессия 124 микроРНК существенно отличались между весьма инвазивной вариантом MKN28-M и неинвазивным клеток сублинии MKN28-NM. Из них 83 были 41 и повышающей регуляции были подавляются. По сравнению с SGC7901-NM, 62 микроРНК были дифференцированно выражены в клеточной сублиния SGC7901-М, в том числе 47 подавляются и 15 активируемых микроРНК. В общей сложности были найдены 11 микроРНК быть и 34 повышающей регуляции микроРНК были подавляются в обоих MKN28-М и SGC7901-M клеток по сравнению с теми, в соответствующих неинвазивных сублиниях (таблица S1).
<Р> Из 45 дифференцированно регулируемые микроРНК, микроРНК-218 был одним из тех, которые отображали значительно дифференциального выражения. микроРНК-218 было сообщено быть подавлена в рак шейки матки [25], GC [26], рак легкого [27] и рак предстательной железы [28], что указывает на возможное участие в обоих опухолевой трансформации и метастазирования опухолей. Тем не менее, микроРНК-218 был лишь одним из многих потенциальных микроРНК, представляющих интерес видов рака. В этой работе, микроРНК-218 был исследован гораздо более подробно. Для проверки достоверности результатов микрочипов, мы оценивали экспрессию микроРНК-218 в ГХ клеточных сублиниях ранее упомянутых и в бессмертном эпители желудка клеточной линии GES с использованием QRT-PCR [29]. выражение микроРНК-218 было значительно снижено в клетках MKN28-M и SGC7901-М и была ниже, во всех четырех сублиниях GC клеток по сравнению с увековечены желудочных эпителиальных клеток человека GES (рис 2А). Кроме того, мы сравнили микроРНК-218 экспрессию в первичной опухоли ГХ против метастатических лимфатических узлов у 10 пациентов со стадией III /IV ГХ с использованием QRT-PCR. Как показано на рисунке 2B, зрелые уровни микроРНК-218 были значительно уменьшились в 7 из 10 метастатических лимфатических узлов, что свидетельствует о том, что микроРНК-218 может играть причинную роль в GC метастазирования.
Снижение экспрессии микроРНК-218 в GC был связан с передовой клинической стадии, метастаз лимфатических узлов, а также неблагоприятным прогнозом пациента
&л; 0,0001, т = 10,62, в паре т
-test) (рис 3А). Корреляция между уровнем экспрессии микроРНК-218 и клиникопатологическими характеристики GC приведены в таблице 1. наблюдались статистически значимые связи между уровнем экспрессии микроРНК-218 и клинической стадии, а также между уровнем экспрессии микроРНК-218 и GC метастазирования в этом исследовании. Медиана экспрессия микроРНК-218 был -14,25 ± 0,17 в 22 случаях с продвинутой стадии (стадия III и IV) заболевания, в то время как средний показатель выражение было -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Манна-Уитни тест) в 18 случаях на ранней стадии (стадии I и II) заболевания. В 29 случаях GC с метастазов в лимфатических узлах, медиана экспрессии микроРНК-218 был -14,09 ± 0,16, что достоверно ниже, чем медиана выражение (-13,07 ± 0,24) в 11 неметастатической случаях GC ( P
= 0,0036). Выражение микроРНК-218 у больных ГХ не коррелировала с возрастом, полом, размер опухоли, или дифференцировки клеток. Кроме того, мы исследовали, является ли уровень экспрессии микроРНК-218 было связано с выживанием у больных с GC. Пациенты были разделены на впоследствии низкой экспрессией (n = 20) и высокой групп выражение (п = 20), основанных на уровнях микроРНК-218 больше или меньше среднего (-13.81) (рис 3B). выживаемости Каплана-Мейера анализы показали, что пациенты, у которых первичная опухоль отображается низкой экспрессии микроРНК-218 был короче средняя продолжительность жизни. Трехлетняя выживаемость пациентов с низким уровнем экспрессии микроРНК-218 был 30%, что значительно ниже, чем уровень выживаемости у больных с высоким уровнем экспрессии микроРНК-218 (65%; P
= 0,0012, лог- Оценка теста;. Рисунок 3C)
и в естественных условиях
<р> изучить роль микроРНК-218 в ГК метастазирования, MKN28-М-клетки трансфицировали pGenesil-1-микроРНК-218 или контрольным вектором экспрессии неспецифической микроРНК, Cel-микроРНК-67, используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США ). Затем клетки выбраны с 400 мг /л G418 для генерации MKN28-М-микроРНК-218 и MKN28-М-Mir-контроль стабильные клетки. Мы обнаружили, что эктопическая экспрессия микроРНК-218 привело к примерно в три раза сокращение миграции и инвазии. Для того, чтобы определить, является ли потеря микроРНК-218 будет способствовать миграции или инвазии раковых клеток, мы притихли MIR-218 с ингибитором антисмысловых олигонуклеотидов в клеточной линии MKN28-NM, в результате чего в три-четыре раза увеличение миграции клеток и инвазивность (рис 4А и 4Б). Для того, чтобы проверить, является ли ингибирование инвазии опухоли путем MIR-218 обусловлена ухудшая инвазивную способность опухолевых клеток, мы исключили влияние микроРНК-218 на распределение пролиферации и клеточного цикла клеток рака желудка. Избыточная экспрессия микроРНК-218 не влияет на пролиферацию и распределение клеточного цикла клеток MKN28-M в пробирке
(Рисунок S5A и S5D). Для дальнейшего исследования ингибирования естественных условиях
метастазирования опухоли в Мир-218, мы имплантировали MKN28-М-микроРНК-218 клеток, которые стабильно экспрессирующие микроРНК-218 или контрольные клетки в голых мышей через боковую хвостовую вену. Легких и метастаз печени GC было очевидно, у мышей, которым вводили MKN28-М-Mir-контрольными клетками. В отличие от этого, несколько метастатические опухоли были обнаружены у мышей, которым вводили MKN28-М-микроРНК-218 клеток (рис 4в). Кроме того, мы одновременно наблюдали рост первичных опухолей и частота отдаленных метастазов в голых мышей вводили подкожно с клетками MKN28-М-микроРНК-218 или контрольными клетками. Результаты показали, легких или печени метастаз было очевидно, в 3 из 10 мышей, которым вводили MKN28-М-Mir-контрольными клетками; в противоположность этому, нет метастазов не было обнаружено у мышей, которым вводили MKN28-M-микроРНК-218 клеток (рис S5E). Эти результаты согласуются с данными, полученными из хвостовой вены анализов, которые оценивают метастазирования рака и указывают, что микроРНК-218 обладает способностью подавлять метастазирование, не влияя на клеточную пролиферацию.
Robo1 был прямым функциональным объектом микроРНК-218 в GC метастазирование
Показали, что Robo1 облегчает миграцию клеток глиомы, опосредованного Slit2 [36]. Schmid и др.
Обнаружили, что миграция клеток опухоли молочной железы индуцируется Slit2-Robo1 взаимодействия в пробирке
[37]. Эти данные позволяют предположить, что Robo1 может быть мишенью для микроРНК-218. Для дальнейшей проверки нашей гипотезы мы провели анализ экспрессии микроРНК-218 и Robo1 в GES и неинвазивный (MKN28-NM и SGC7901-NM) и инвазивного (MKN28-М и SGC7901-M) GC клеток. Результаты показали отрицательную корреляцию между уровнями микроРНК-218 и мРНК Robo1 в этих клетках (рис S3A). Кроме того, мы обнаружили, что уровни Robo1 мРНК (рис S3B) и белка (рис 5В2) были уменьшены, когда микроРНК-218 была выражена pGenesil-1-MIR-218 в клетках MKN28-М (рис 5B1). Обратное наблюдалось для экспрессии Robo1 когда микроРНК-218 был сбит в MKN28-НМ клеток (рис 5с1 и 5с2 Рисунок). Обратная связь между микроРНК-218 и экспрессии Robo1 было дополнительно подтверждено с помощью иммуногистохимии (Текст S1) в 40 случаях рака желудка, в согласованных соседних нормальных тканях, которые также использовались в клинико-патологическими исследований, а также в 29 согласованных метастазов. Результаты показывают, что Robo1 был в GC усиливает свою активность, особенно в метастатической GC (рис S4), в котором микроРНК-218 имеет относительно низкую экспрессию.
<Р> Чтобы получить дополнительную прямые доказательства того, что Robo1 является объектом MIR-218 , мы исследовали сайт связывания микроРНК-218 в 3'-UTR мРНК Robo1 (рис 5А). Мы построили люциферазы (Luc-Robo1), в котором нуклеотиды Robo1 3'-UTR, комплементарной микроРНК-218 (нуклеотиды 971-978) были вставлены в pMIR-REPORT микроРНК выражение репортер вектора [38]. Соответственно, мы также генерироваться как мутантный репортер (Luc-Robo1-му), в котором были удалены первые шесть нуклеотидов в микроРНК-218 семян области дополнительных сайтов, а также контрольный репортер, который содержал несвязанной фрагмент кДНК (Luc-Ctrl). микроРНК-218-плазмиды экспрессии котрансфицируют с Luc-Robo1, Люк-Robo1-му, или Luc-Ctrl в клетки MKN28-M. Анализы показали, что активность люциферазы в Luc-Robo1-трансфецированных клеток значительно снизилась по сравнению с активности люциферазы в мутантных и отрицательных контрольных клеток ( P
&л; 0,05), предполагая, что микроРНК-218 уменьшено люциферазы активность Люк-Robo1, но не имел никакого влияния на Luc-Robo1-му (рис 5D). Таким образом, мы пришли к выводу, что вставленный фрагмент Robo1 (нт 971 - Страница 978). Был объектом MIR-218
<р> Robo1 было показано, чтобы быть сверхэкспрессии в раковых клетках и известно, что стимулировать ангиогенез опухоли и метастазирование посредством взаимодействия с слите [39], [40]. Для того, чтобы проверить, является ли Robo1 функционально регулируется микроРНК-218, мы сгенерировали экспрессии Robo1 конструкцию, содержащую только фрагмент предсказанного сайта микроРНК-218 связывания и Robo1 мутант вектором экспрессии, полностью лишенного 3'-UTR. Мы также сделали Robo1 миРНК. MKN28-М-микроРНК-218 клеток, которые стабильно выраженные MIR-218 эктопически, были трансфицированы с Robo1 Конструкцию или мутантной конструкцией (без сайта микроРНК-218 связывания), и MKN28-M клетки трансфицировали Robo1 миРНК или его отрицательный контроль миРНК. Клетки MKN28-М-микроРНК-218, трансфицированных мутантной конструкцией Robo1 показал 3,8-кратное увеличение способности инвазии по сравнению с клетками, трансфицированных Robo1 конструкцией. Эти результаты указывают на то, что введение мутантного Robo1 кДНК, которая не хватало сайт связывания микроРНК-218 в микроРНК-218-избыточно экспрессирующих клеток обратный эффект микроРНК-218-опосредованной подавление инвазии клеток. Тем не менее, эффект Robo1 был репрессирован MIR-218 в присутствии Robo1 3'-UTR, содержащий сайты связывания микроРНК-218. Нокдаун Robo1 с помощью миРНК в клетках MKN28-М ингибирует инвазию клеток, который упал до уровней, аналогичных тем, которые наблюдаются после трансфекции с микроРНК-218-выражающей вектора (рис 5E и 5F). Эти наблюдения указывают на то, что микроРНК-218 непосредственно подавляет Robo1-опосредованной вторжение клеток.
Slit2, но не Slit3, могут взаимодействовать с Robo1, обогащенная отсутствием MIR-218, в целях содействия GC вторжения
<р> Два типа микроРНК существуют: межгенная и интронного. Первые расположены в некодирующей области между генами, и их соответствующие Pri-микроРНК, как правило, транскрибируются с их собственных промоторов РНК-полимеразы II. Последние расположены в пределах интронов генов хозяина, и их биогенез контролируется геном хозяина промоторов [41], [42]. микроРНК-218 представляет собой интронного микроРНК. Два гена кода для зрелой микроРНК-218, MIR-218-1 и MIR-218-2, которые расположены в пределах интрон 15 Slit2 и интрон 14 Slit3, соответственно (рис 6а). Интронного расположение двух генов микроРНК-218 побудило нас спросить, есть ли микроРНК-218-1 и микроРНК-218-2 транскрибируются вместе с их геном мРНК хозяина. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали QRT-PCR для изучения экспрессии предшественника микроРНК-218-1, Мирский-218-2 предшественник, зрелые микроРНК-218, мРНК Slit2 и мРНК Slit3 в тканях, используемых в GC выживания анализ. Статистический анализ коэффициента корреляции результатов QRT-ПЦР показал значимую положительную корреляцию между уровнями мРНК Slit2 и MIR-218-1 и между уровнями мРНК Slit3 и MIR-218-2 (рис 6В и 6С). Эти результаты указывают на то, что микроРНК-218 кодирующих генов, микроРНК-218-1 и микроРНК-218-2, транскрибируются вместе со своими генами хозяев, Slit2 и Slit3 соответственно. Значительная положительная корреляция между уровнями микроРНК-218 и MIR-218-2 (рис 6D) был замечен в GC; Однако, ни один такой корреляции не наблюдалось между уровнями микроРНК-218 и MIR-218-1 (рис 6е). Эти результаты указывают на то, что понижающая регуляция микроРНК-218 в GC способствует уменьшению MIR-218-2, но не в MIR-218-1. В соответствии с этим выводом, экспрессия Slit3 была значительно уменьшена в GC (-22,43 ± 0,21, среднее значение ± SE) по сравнению с нормальной желудочной ткани (-20,79 ± 0,23, среднее значение ± SE), ( P
&л; 0,0001, т = 7,67, в паре т
-test) (рис 6F), тогда как экспрессия Slit2 существенно не отличалась ( P
= 0,0772, в паре т
-test) ( Рисунок 6G). Таким образом, наши экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что значительное усиление активности гена Robo1 в ответ на удаление MIR-218 может вызвать последующую повышающую регуляцию пути щелевая-Robo1 за счет взаимодействия с Slit2, что облегчает миграцию опухолевых клеток и инвазию.
<р> для изучения заболевания, жизненно важно построить идеальную модель. В настоящем исследовании мы выделили инвазивные и неинвазивные субпопуляции клеток из установленных линий GC клеток человека с помощью повторного подхода Transwell, который успешно применяется во многих исследованиях исследовании метастазирования опухоли [43] - [48]. Результаты метастатическим экспертизы в пробирке
и В естественных условиях
показали, что установленные сублиний клеток имели различные инвазивные и метастатических возможности. Здесь мы провели скрининг не только сублиниях клетки, полученные из клеточных линий GC с высоким инвазивным потенциалом, но и те с малоинвазивной потенциалом. За исключением их метастатическим способностей, выбранные сублиний клеточные оба были очень похожи, так как они одни и те же генетические предпосылки. Так как основное различие между этими двумя типами сублиниях является метастатический потенциал, гены, которые различаются между ними должны хорошо коррелируют с метастазированием. Кроме того, наш метод способен различать этапы вторжения от метастаз и позволяет исследовать конкретные шаги в метастаза, которые не могут быть оценены в модели живого животного.
<Р> В последнее время микроРНК было зарегистрировано в целях содействия [49] , [50] или подавить [51] - [54] метастазирование опухолей, обеспечивая новую перспективу на метастатического процесса. Тем не менее, роль микроРНК в ГК метастазирования отсутствует. В этом докладе, мы исследовали и получили в первый раз 45 метастазирования связанных с микроРНК в GC на основе хорошо зарекомендовавшей модели метастазирование клеток. Тот факт, что микроРНК-218 был подавляются в метастатических GC интригует, как снижение уровней микроРНК-218 было зарегистрировано в нескольких типах солидных опухолей [24] - [27], [55], что свидетельствует о том, что потеря MIR-218 может быть обычным явлением в онкогенеза. В настоящем исследовании мы сосредоточили внимание на эффекте микроРНК-218 на GC метастазирования и показали, что микроРНК-218 действует как подавитель опухоли в GC метастазирования. Восстановление микроРНК-218 миграции клеток снижается и вторжения в пробирке
и метастазирование опухолей В естественных условиях
. Для получения стабильных клеточных линий, которые сверхвыражен микроРНК-218, мы трансфицированных MKN28-М клеток с микроРНК-218 плазмид и экранированы G418. Мы выбрали двенадцать клеточных колоний в микроРНК-218-трансфицированных группы и обнаружили 10 из 12 колоний выставлены удивительно равномерное, стабильное и выражение высокого уровня микроРНК-218. Кроме того, три случайно выбранных моноклональные клеточные линии выставлены аналогичное снижение инвазивного ablility. Тем не менее, стратегии трансфекции плазмиды часто приводят к снижению эффективности интеграции по сравнению с вирусной экспрессии, приводящей к возможности случайного отбора редких функционально разнородных вариантов от исходной насыпной населения. Поэтому дальнейшее использование вирусных систем экспрессии должны создать более объективную начальную популяцию, чтобы проверить нашу гипотезу.
<Р> В рамках нашего исследования о том, как потеря микроРНК-218 влияет GC метастазирование, мы показали, что Robo1 был критическим нижестоящей мишенью микроРНК-218. Известно, что Робо является аксонов рецептором для щелевых и сохраняется у животных, начиная от плодовых мух до млекопитающих. У млекопитающих, три щелевой (Slit1-3) и четыре гена Робо (Robo1-4) описаны [56], [57]. Взаимодействие щелевая-Robo передают сигналы, опосредующие отталкивающие сигналы на аксонов и ростовых конусов во время развития нервной системы и участвуют в клеточных и моноцитов хемотаксис Т [58] - [64]. Что касается других путей развития, аберрантной экспрессией слите -
гены Robo наблюдается в различных типах опухолей [65] - [68]. Например, в образцах ткани карциномы молочной железы, Robo1 было показано, что сверхвыражен, и было показано, чтобы вызвать миграцию клеточных линий рака молочной железы [37]. сигнализации Slit2-Robo1 способствует миграции клеток глиомы [36] и участвует в ангиогенезе за счет увеличения плотности микрососудов и массы опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли [30]. Ван <ЕМ> и др.
Показано, что избыточная экспрессия Robo1 в новых кровеносных сосудов в опухоли индуцирует образование новых сосудов рака и роста посредством взаимодействия Robo1 и его лигандом, Slit2. Они также определили фосфоинозитидного-3-киназы (PI-3K) как нижестоящий эффектор сигнализации Slit2 /Robo1. Это наводит на мысль, что существует каскад щелевая-Robo1-PI-3K, что может привести к образованию фосфоинозитол-3,4,5-трифосфата и последующей активации малых GTPases, которые опосредуют движение клеток и ремоделирование цитоскелета [30] , [35]. В противоположность этому, другие исследования утверждают, что подавление Robo1 вызванное делеции или эпигенетических модификаций могут играть определенную роль в опухолевой прогрессии [69] - [73]. Мы предлагаем, что тканеспецифическая паттерн экспрессии существует для генов щелевая-Robo.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что Robo1 часто экспрессируются на высоких уровнях в клетках инвазивных и на низких уровнях в неинвазивных клеток , в то время как микроРНК-218 отображается противоположный паттерн экспрессии. Когда мы трансфецировали вектор микроРНК-218-экспрессии и ингибирующих олигонуклеотидов в MKN28-M и MKN28-NM клеток, соответственно, наблюдалась обратная картина экспрессии между микроРНК-218 и Robo1, то есть, если микроРНК-218 выражение было высоким, Robo1 выражение было низким, и наоборот. Этот результат был дополнительно подтверждено в клинических образцах и в анализах активности люциферазы. Мы также заметили, что индукция экспрессии Robo1 мутантом конструкции Robo1 без сайта микроРНК-218 связывания может полностью изменить микроРНК-218-опосредованной подавление инвазии опухолевых клеток. В противоположность этому, нокдаун экспрессии генов Robo1 по RNAi оказало влияние на снижение инвазии опухолевых клеток, аналогичную восстановление микроРНК-218, хотя в одиночку Robo1 нокдаун продемонстрировал слабый эффект. Это может быть потому, что Robo1 не является единственной мишенью микроРНК-218, который имеет отношение к метастазирования опухоли. Эти данные показывают, что подавление инвазии эффект MIR-218, по меньшей мере частично опосредованы снижением экспрессии Robo1. Это также первое исследование, чтобы показать, что опухоль-ассоциированный ген Robo1 негативно регулируется с помощью микроРНК-218 с помощью конкретного целевого участка (нуклеотиды 971-978) в пределах 3'-UTR. Рецептор Robo1 имеет решающее значение для ответа на внеклеточные сигналы и клеточных фенотипических изменений; Таким образом, жесткая регуляция рецептора Robo1 с помощью микроРНК-218 может способствовать более надежной передачи сигнала. Анти-Robo1 моноклональное антитело, как сообщается, является эффективным средством для лечения Robo1 экспрессирующих видов рака [30], [33]. В настоящем исследовании мы обнаружили новый ингибитор Robo1, MIR-218, которые потенциально могут быть использованы для лечения некоторых видов рака.
<Р> Как уже упоминалось выше, Slit1, Slit2 и Slit3 содержать семью щелью белки. Несмотря на то, что гены перекрываются, их паттерны экспрессии и функции различны. Первые два белки, как известно, участвуют в аксонов и миграции клеток [37], [74], в то время как Slit3 участвует в развитии органов и систем органов, в том числе диафрагмы и почек [75]. В соответствии с этими данными, мы обнаружили, что Slit2, но не Slit3, взаимодействовали с Robo1 для содействия GC вторжения.
<Р> Кроме того, мы показали, что гены, кодирующие микроРНК-218 были расположены в и транскрибируется вместе с генами щелевых , которые являются Robo1 лиганды, тем самым создавая негативную петлю обратной связи, который регулирует передачу сигналов щелевая /Robo1. Sailen Barik продемонстрировали, что интронного микроРНК, микроРНК-338, замолчать гены, которые функционально антагонистических его генного продукта хозяина, создавая тем самым положительную обратную связь, которая помогает в физиологической роли гена-хозяина [76].
Самые полезные кишечные бактерии с растительной или средиземноморской диетой
Новое исследование показывает, что определенные продукты, содержащиеся в растительной или средиземноморской диете, могут защитить кишечник от воспалительных заболеваний. избирательно способствуя росту
Микробиом легких предсказывает тяжесть заболевания COVID-19
Новый препринт исследовательской работы размещен в medRxiv * сервер обнаружил, что изменения в микробиоме легких во время тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-C
Исследователи управляют видами бактерий в кишечнике с помощью диеты
Ученые из Медицинской школы Стэнфордского университета показали, что, изменяя диету на мышиной модели, можно отдать предпочтение приживлению одного штамма бактерий перед другими. Предостав
