PloS Genetics: Mir-218 Sprječava invazije i metastaziranja raka želuca ciljanjem Robo1 Receptor

Sažetak pregled

mikroRNA igraju ključne uloge u metastaza tumora. Ovdje ćemo opisati regulaciju i funkciju Mir-218 kod raka želuca (GC) metastaza. Mir-218 ekspresija se smanjuje uz ekspresiju jednog od njegovih gena domaćina, Slit3 metastatskog GC. Međutim, Robo1, jedan od nekoliko razrez receptora, negativno je regulirana Mir-218, čime se uspostavlja negativna povratna sprega. Smanjena Mir-218 razina eliminirati Robo1 represiju, koji aktivira prorez-Robo1 put kroz interakcije između Robo1 i Slit2, čime se pokreće tumorskih metastaza. Obnova Mir-218 smanjuje ekspresiju Robo1 i inhibira staničnu invaziju i metastaziranje tumora In vitro
i in vivo pregled. Uzeti zajedno, naši rezultati opisuju prorez-Mir-218-Robo1 regulatorni krug čiji poremećaj može doprinijeti GC metastaza. Ciljanje Mir-218 može osigurati strategiju za blokiranje tumorskih metastaza. Pregled

Autor Sažetak pregled

mikroRNA su identificirani kao igranje važnu ulogu u metastaziranja tumora, ali je njihov utjecaj na GC metastaza je slabo istražena. Mi smo otkrili Mir-218, koja djeluje kao supresor metastaze tumora i korelirana s fazi kliničkog ispitivanja, metastaza limfnih čvorova i prognozi u bolesnika s GC. Naši rezultati pokazuju da miR-218 je dio regulacijskog sklopa uključuje proreza Robo1 put. U metastatskih tumorskih stanica, Mir-218 je potisnuta uz Slit3, jednom od svojih domaćina gena. U međuvremenu, Robo1, jedan je od nekoliko proreza receptora, povećana u odgovor na pad Mir-218, koji je sa svoje strane inducirane reaktivnog doreguliranje proreza-Robo1 puta kroz interakciju s Slit2, na taj način olakšavajući tumorskih stanica i invaziju. Takvi rezultati ne samo da pružaju nove uvide u metastatskih mehanizama u GC, ali i pružiti dokaze za novi Mirna posredovanog regulatornog način signalizacije receptora pregled

Izvor:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) Mir-218 Koči invazije i metastaziranja raka želuca ciljanjem Robo1 receptora. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000879 pregled

Urednik: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 15. srpnja 2009; Prihvaćeno: 10 veljača 2010; Objavljeno: 12. ožujak 2010 pregled

Copyright: © 2010 Tie et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 30670970, br 30873026, br 30672369, broj 30530780) i Nacionalnog Basic Research programa Kine (No.2010CB529300). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Napredak u dijagnostičke i terapijske pristupe doveli su do izvrsnih očekivanja za dugoročno preživljavanje ranog karcinoma želuca (GC). Međutim, prognoza za napredno GC s velikim invaziju i metastaziranje i dalje loš [1]. Kako bi se metastaziranje, tumorske stanice moraju proći kroz niz uzastopnih i selektivnih događaja, uključujući i odvajanju, migracije, lokalne invazije, angiogenezu, intravasation, preživljavanje u krvožilni sustav, izljeva i ponovni rast u različitim organima. U metastatskog kaskade, invazija GC u okolno tkivo je ključni rano korak [2] - [4]. Međutim, mehanizmi invazije još nije u potpunosti razjašnjen. Pregled

Velik broj microribonucleic kiselina (mikroRNA ili miRNAs) nedavno su upleteni u metastaze raka [5], uključujući i Mir-10b, Mir-21, mir-126, mir-335, mir-373, mir-146, mir-520c i mir-205 kod raka dojke [6] - [11]; Mir-224 i Mir-21 kod raka prostate [12], [13]; Mir-29c u nazofarinksa karcinomima [14]; Mir-10a, Mir-222, Mir-125b, Mir-7, a Mir-452 u urothelial karcinomima [15]; Mir-182 u melanom [16]; Mir-92b i Mir-9/9 * u tumorima mozga [17]; i Mir-21 u rak debelog crijeva [18]. Međutim, vrlo malo miRNAs se zna da sudjeluju u GC metastaze su izvijestili. miRNAs se prirodno pojavljuje, kratka, NEKODIRAJUĆA RNK molekule koje negativno reguliraju ekspresiju gena [19]. U sisavaca, zrele miRNAs su generirani od Pri-miRNAs i pre-miRNAs putem sekvencijalnog preradi Drosha i kockar, a nalaze se u mnogim organizmima. Oni se sastoje od 21-24 nukleotida, integrirati u RNK inducira ušutkavanja kompleksa, i uparivanje s 3 'neprevedenih regija (3'-UTR) specifičnih meta messenger RNA (mRNA) za suzbijanje prijevoda ili izazvati razgradnju ciljne mRNA [20 ]. Sve je više dokaza je otkrila da miRNAs imaju ključnu ulogu u različitim biološkim procesima, uključujući staničnu diferencijaciju, proliferacije, apoptoze otpornosti na stres, metabolizam masti, tumorigenezi i metastaza [21] - [23]. Bolje razumijevanje promjena u Mirne izražavanja tijekom GC invazije mogu dovesti do boljeg razumijevanja razvoja GC, kao i moguća poboljšanja u dijagnostici i liječenju napredne GC. Pregled

U ovom istraživanju, uspostavili smo visoko (MKN28-M i SGC7901-M) i niske stanične podlinije invazivne (MKN28-NM i SGC7901-nm) upotrebom repetitivne prerastanja testa in vitro pregled. Zatim smo ispitali globalnu Mirna profil ekspresije u svakoj stanici podlinije pomoću Mirna mikročipa identificirati različito izražene miRNAs se odnose na ljudske GC invazije. Ukupno 45 miRNAs pokazalo da su s različitiom ekspresijom u invazivni vs neinvazivnih GC stanicama. Među njima, Mir-218, što je značajno regulirani Mirne u visoko invazivnim stanicama, pokazalo se da je usko povezana s GC tumorigenezi i metastaza u bolesnika. U novije vrijeme, što je smanjenje u Mir-218 je bio prijavljen u nekoliko vrsta solidnih tumora, uključujući rak prostate, GC, raka pluća i raka vrata maternice [24] - [27], ali ovaj pad Mirna-218 jednostavno je prikazan izvan kao jedan od desetaka potencijalnih miRNAs interesa u rakova je gore opisano. Nema daljnjih istraživanja su provedena procijeniti značaj Mir-218 tumorskih metastaza. Ovdje smo otkrili da je smanjen Mir-218 ekspresija je povezana s naprednim fazi kliničkog ispitivanja, limfnih čvorova metastaza, i lošom prognozom u bolesnika, i ponovno izraz Mir-218 u metastatskih stanica bio u mogućnosti spriječiti migracije, invazije i stvaranja metastaza i In vitro pregled i in vivo pregled. Koristeći pretragu bioinformatičkih za Mir-218 ciljeva, pokazalo mi receptor Robo1 kao funkcionalna cilja Mir-218, a mi je potvrdio da je interakcija između Mir-218 i Robo1 bila je presudna za GC stanične pokretljivosti demonstrirajući da je inverzna korelacija između MIR -218 i Robo1 u staničnim linijama GC kao i GC pacijenata. Nadalje smo otkrili zanimljivu negativna povratna sprega uključuje otvor, Mir-218, i Robo1, u kojem miR-218 se može izvesti iz bilo kojeg od dva gena smještenih u introna dva različita člana proreza obitelji proteina. Osim toga, članovi ove obitelji su ligandi Robo1 receptora. Pokazali smo da je ekspresija dviju Mirna prekursora gena (Mir-218-1 i Mir-218-2) u odnosu na ekspresiju gena domaćina (Slit2 i Slit3, respektivno), te da zreli Mir-218 je uglavnom izvedena iz Mir -218-2 prekursor, s istovremenim smanjenjem domaćina Slit3, ali ne i u Slit2 metastatskih GC stanicama. Tako, uzlazni Robo1 odgovor na smanjenje Mir-218 inducirane reaktivnog doreguliranje proreza-Robo1 puta kroz njegovu interakciju s Slit2, čime se olakšava invaziju tumorskih stanica i metastaziranje. Naši rezultati ne samo da pružaju novi uvid u metastatskih mehanizama u GC, ali oni su također pokazali novi regulatorni mehanizam signalizacije receptora. Pregled

Rezultati pregled

Osnivanje i karakterizacija stanica sublini s različitim invazivne i metastazama potencijali

Za uspostavljanje modela GC metastaza, stvorili smo invazivne i neinvazivne stanica sublini iz ljudskog GC staničnim linijama SGC7901 i MKN28 pomoću ponavlja prerastanja pristup (Slika 1A, vidi Materijali i metode). Ukratko, ponavljajući invazija Test je proveden, a one stanice koje nisu uspjele upasti membrane i stanice koje su imale mogućnost da migriraju kroz membranu kolagenom obložene u svim krugovima selekcije su razdvojeni. Nakon deset rundi selekcije, dobili smo invazivne (MKN28-M i SGC7901-M) i ne-invazivne stanice sublini (MKN28-nm i SGC7901-nm). Metastatskih svojstva svakog stanica podlinije su tada karakterizira In vitro pregled i in vivo pregled. Kao što je prikazano na slici 1B i 1C migracijske sposobnosti MKN28-M stanice, približno je 4 puta veća od MKN28-NM stanica. Isto tako, invazivni potencijal je bila približno 5 puta veću za MKN28-M stanice u usporedbi s MKN28-NM stanica. U in vivo
studija, tumorske stanice metastaze zabilježeno je u miševa. Kako je prikazano na Slici 1D i 1E gotovo nema metastaze GC stanice bile su detektirane u plućima i jetri golih miševa, na 10 tjedana nakon injekcije MKN28-NM stanica, dok se većina miševa s MKN28-M stanice prikazane očigledan pluća ili jetre metastaze. Slični rezultati opaženi su za SGC7901-M i SGC7901-NM stanicama (podaci nisu prikazani). Nema značajne razlike u proliferaciji stanica ili distribuciju staničnog ciklusa su uočeni kod tih staničnih sublini (Tekst S1, Sl S1 i S2). Pregled

Identifikacija metastaza povezanih miRNAs prema bazi nizova, za hibridizaciju

za identifikaciju miRNAs potencijalno uključenih u GC invazije, ispitali smo globalno izražavanje Mirne u svakoj stanici podlinije pomoću mikrornk Array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Danska), koji se sastoji od 847 hvatanje uzoraka za zrele ljudske miRNAs. Rezultati microarray otkrila da je ekspresija 124 miRNAs značajno razlikovala između vrlo invazivne varijanti MKN28-M i neinvazivna stanica SubLine MKN28-NM. Od tog broja, 83 su regulira prema gore i 41 su regulirani. U usporedbi s SGC7901-NM 62 miRNAs su s različitiom ekspresijom u stanici podlinije SGC7901-M, uključujući 47 regulirani i 15 doreguliran miRNAs. Ukupno, 11 miRNAs Utvrđeno je da se regulira prema gore i 34 miRNAs su regulirani u oba MKN28-M i SGC7901-M stanice u usporedbi s onima u odgovarajućim neinvazivnih sublini (Tablica S1). Pregled

Od 45 diferencijalno regulirane miRNAs, mir-218 je bio jedan od onih koji se prikazuje znatno diferencijalne ekspresije. Mir-218 je objavljeno da regulirani kod karcinoma cerviksa [25], GC [26], karcinom pluća [27] i rak prostate [28], što upućuje na to da su u oba onkogena transformacija i metastaze tumora. Međutim, Mirna-218 bio je samo jedan od mnogih mogućih miRNAs interesa u raka. U ovom radu, Mir-218 je ispitivan u mnogo više detalja. Kako provjeriti rezultate Microarray, procjenjuje Mir-218 izražaj u GC stanica sublini prethodno spomenutih i besmrtne želuca epitelnih stanica linije GES pomoću QRT-PCR [29]. Mir-218 izražavanje bilo značajno smanjena u MKN28-M i SGC7901-M stanice i bila je niža u sva četiri GC stanica sublini odnosu na besmrtnih ljudskih želučanih epitelnih GES stanica (Slika 2a). Osim toga, usporedili smo Mir-218 izražavanje u primarnom tumoru GC vs metastatskih limfnih čvorova u 10 bolesnika s stadiju III /IV GC pomoću QRT-PCR. Kao što je prikazano na slici 2B, zrele Mir-218 bile su značajno smanjena u sedam od 10 metastatskih limfnih čvorova, što znači da Mir-218 može igrati uzročnu ulogu u GC metastaza. Pregled

Smanjena Mir-218 izričaj u GC bio je povezan s naprednim fazi kliničkog ispitivanja, limfnih čvorova metastaza, te lošom prognozom bolesnika Netlogu

Kako bi se utvrdile potencijalne kliničkopatološka implikacije promijenjen Mir-218 izražavanja, istraživali smo razine ekspresije Mir-218 u 40 GC tkivima (T) i ne-tumor sluznica (N) tako QRT-PCR. Pojam -ΔCt se koristi za opisivanje razinu ekspresije Mir-218. U skladu s gore navedenim podacima, rezultati potvrdili da je Mir-218 razina ekspresije u GC (-13,81 ± 0,15, srednja vrijednost ± SE) tkiva bila je značajno niža nego u ne-neoplastičnim sluznice (-11,62 ± 0,15, srednja vrijednost ± SE) ( P izvoznici < 0.0001, t = 10,62, u paru t pregled -test) (slika 3A). Korelacije između Mir-218 razine ekspresije i kliničko karakteristikama GC sažeto su prikazani u tablici 1. statistički značajna povezanost između razine Mir-218 izražavanja i kliničke faze i između Mir-218 razine ekspresije i GC metastaze su promatrane u ovoj studiji. Medijan izraz Mir-218 je -14,25 ± 0,17 u 22 slučajeva s uznapredovalom stadiju (stadij III i IV) bolesti, dok je medijan izraz bio -13,27 ± 0.20 ( P pregled = 0,0010, Mann-Whitney test) u 18 slučajeva sa ranoj fazi (faze i i II) bolesti. U 29 slučajeva GC s limfnih čvorova metastaze, medijan izraz Mir-218 je -14,09 ± 0,16, što je znatno niže od medijana izraza (-13,07 ± 0,24) u ne-metastatskih slučajevima GC 11 ( P pregled = 0,0036). Izraz Mir-218 u GC pacijenata nije bio u korelaciji s dobi, spolu, veličini tumora, ili diferencijaciju stanica. Štoviše, ispitali smo je li razina Mir-218 izražavanja bila je povezana s preživljavanjem u bolesnika s GC. Bolesnici su potom podijeljeni u niskom ekspresijom (n = 20) i visoke ekspresije skupine (n = 20) na temelju razine Mir-218 veća ili manja od prosjeka (-13.81) (slika 3B). Kaplan-Meier opstanak analiza pokazala je da pacijenti čiji je primarni tumori prikazuje nisku ekspresiju Mir-218 je imao kraći srednja vrijednost vremena preživljenja. Trogodišnji stopa preživljavanja pacijenata s niskim Mir-218 izražavanja bila je 30%, što je znatno niže od stopa preživljavanja kod pacijenata s visokim Mir-218 izrazu (65%; P pregled = 0,0012, log rank test;. Slika3C) pregled

Ectopic izraz Mir-218 inhibiran invaziju tumorskih stanica i metastaziranje In vitro pregled i In vivo

Kako bi se ispitalo uloga Mir-218 u GC metastaza, MKN28-M stanice su transfektirane s pGenesil-1 Mir-218 ili kontrolni vektor izražavanja na nespecifičnu Mirne, cel-Mir-67, korištenjem Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Stanice su zatim selektirani s 400 mg /L G418 generirati MKN28-M-miR-218 i MKN28-M-miR upravljanja stabilne stanice. Otkrili smo da izvanmaternične izraz Mir-218 rezultirala je otprilike tri puta smanjenje migracije i invazivnosti. Da bi se utvrdilo da li je gubitak Mir-218 će promicati migraciju ili invaziju stanica raka, ušutkao smo Mir-218 s inhibitorom oligonukleotidom u staničnoj liniji MKN28-NM, što je rezultiralo u tri do četiri puta povećanje stanične migracije i invazivnost (Slika 4A i 4B). Kao dokaz da je inhibicija tumora invaziju Mir-218 uzrokovano ometanje invazivnu sposobnost tumorskih stanica, isključeni je učinak Mir-218 na proliferaciju i staničnog ciklusa raspodjele želuca stanica raka. Prekomjerna ekspresija Mir-218 nije utjecala na proliferaciju i distribucija staničnog ciklusa MKN28-M stanice in vitro
(Slika S5 i S5D). Kako bi se dodatno istražiti inhibiciju in vivo
tumorskih metastaza strane Mir-218, usadio mi MKN28-M-Mir-218 stanice koje su stabilno eksprimiraju Mir-218 ili kontrolne stanice u golim miševima kroz bočnu repnu venu. Pluća i jetre metastaze GC je očito kod miševa kojima je ubrizgan MKN28-M-Mir-kontrolnim stanicama. Za razliku od toga, nekoliko metastatski tumori otkriveni su u miševa kojima je ubrizgan MKN28-M-Mir-218 stanicama (Slika 4c). Nadalje, uočeno je istovremeno rast primarnih tumora i učestalost udaljenim metastazama u golih miševa subkutano sa MKN28-M-miR-218 stanice ili kontrolnim stanicama. Rezultati su pokazali pluća ili jetre metastaza bio je očit u 3 od 10 miševa kojima je injektiran MKN28-M-miR-kontrolnih stanica; u oštroj suprotnosti, nema metastaze su pronađeni u miševa kojima je ubrizgan MKN28-M-Mir-218 stanicama (Slika s5e). Ovi rezultati su u skladu s podacima dobivenim iz repne vene testova koji procjenjuju metastaza raka i ukazuju na to da Mir-218 ima sposobnost potiskivanja metastaza bez utjecaja na proliferaciju stanica. Pregled

Robo1 bio izravan funkcionalna meta Mir-218 u GC metastaze pregled

kako procijeniti koliko je niska razina Mir-218 izražavanja doprinosi invazije i metastaziranja GC, tražili smo potencijalne regulatorne ciljeve Mir-218 pomoću predviđanja alata, uključujući i Miranda PicTar i TargetScan. Iako stotine različitih ciljeva koje su predvidjeli, ti geni uključeni u migracije ili invazije mogu biti relevantni ciljevi s obzirom na biološke funkcije Mir-218. Zatim smo izveli funkcionalnu klasifikaciju od predviđenih ciljeva pomoću DAVID program (http://david.abcc.ncifcrf.gov/~~HEAD=dobj). Od tih gena, Robo1 smatra migracije promicanje aktivnosti proto-onkogena i lukama [30] - [35]. Mertsch i sur. Pregled je pokazao da Robo1 olakšava migraciju glioma stanica posredstvom Slit2 [36]. Schmid et al. Pregled pronađeno da migracija tumor dojke stanica inducirana Slit2-Robo1 interakcije in vitro pregled [37]. Ovi rezultati ukazuju na to da Robo1 može biti meta Mir-218. Kako bi se dodatno testirati hipotezu, analizirali smo ekspresiju Mir-218 i Robo1 u GES i neinvazivno (MKN28-NM i SGC7901-NM) i invazivni (MKN28-M i SGC7901 M) GC stanicama. Rezultati su pokazali negativnu korelaciju između razine Mir-218 i Robo1 mRNA u tim stanicama (Slika S3A). Nadalje, mi smo opazili da su Robo1 mRNA (Slika S3B) i proteina (Slika 5B2) razine smanjuje kad miR-218 je izrazio pGenesil-1-Mir-218 u MKN28-M stanice (Slika 5B1). Obrnuti zabilježena je za Robo1 izražavanja kada Mir-218 srušen u MKN28-NM stanica (Slika 5C1 i Slika 5C2). Inverzna veza između Mir-218 i Robo1 izražavanja dodatno je potvrdio i imunohistokemijski (Tekst S1) u 40 slučajeva raka želuca, u podudarnih susjednim normalnim tkivima koji su također bili korišteni u kliničkopatološkim studije, a na 29 podudaraju metastaza. Rezultati pokazuju da Robo1 je reguliran u GC, posebno u metastatskim GC (Slika S4), u kojoj je Mir-218 ima relativno mali izraz. Pregled

Kako dobiti dodatne izravne dokaze da Robo1 meta Mir-218 istraživali smo vezno mjesto Mir-218 u 3 'UTR od Robo1 mRNA (slika 5A). konstruirali smo reporter luciferaze (Luc-Robo1) u kojima su nukleotidi u Robo1 3'-UTR dopuna Mir-218 (nt 971-978) su uložena u pMIR-REPORT Mirna ekspresije reporter vektor [38]. U skladu s tim, mi također ostvarila obje mutant novinar (Luc-Robo1-MU) u kojem su izbrisane prvih šest nukleotida Mir-218 sjemenki-regija komplementarnim web stranice, a kontrolna novinar, koji se nalazio nepovezanog fragment cDNA (Luc-Ctrl). Mir-218 ekspresijski plazmidi su kotransfektirane sa Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, odnosno Luc-Ctrl u MKN28-M stanice. Pokusi su pokazali da je aktivnost luciferaze u Luc-Robo1-transficiranim stanicama je značajno smanjena u odnosu na aktivnost luciferaze u mutantnim i negativnim kontrolnim stanicama ( P pregled < 0,05), što ukazuje da miR-218 smanjuje luciferaza aktivnost Luc-Robo1, ali nije imalo učinka na Luc-Robo1-MU (Slika 5D). Dakle, zaključili smo da je umetnuta fragment Robo1 (NT 971 - pregled 978). Bio je meta Mir-218 pregled

Robo1 je pokazala da je prekomjerno izražen u stanicama raka i koja je poznato je da pospješuju tumorske angiogeneze i metastaza preko interakcije s proreza [39], [40]. Za testiranje da li Robo1 funkcionalno uređeno je Mir-218, generira smo Robo1 izraz konstrukt koji sadrži samo fragment predvidio Mir-218 veznih mjesta i Robo1 mutant vektoru ekspresije u potpunosti nedostaje 3'-UTR. Također smo napravili na Robo1 siRNA. MKN28-M-miR-218 stanice, koje stabilno eksprimiraju Mir-218 ektopički prolazno su transfektirane s Robo1 konstrukta ili mutiranog konstrukta (bez miR-218 veznog mjesta) i MKN28-M stanice su transfektirane s Robo1 siRNA ili njegove negativna siRNA kontrola. MKN28-M-miR-218 stanice transficirane s konstruktom Robo1 mutiranim pokazali 3,8-struko povećanje invazije sposobnost u usporedbi sa stanicama presječenim samo sa Robo1 konstrukt. Ovi rezultati pokazuju da uvođenje mutanta Robo1 cDNA koja je nedostajala Mir-218 vezno mjesto u Mir-218-ekspresijom stanica obrnuti učinak Mir-218-posredovane suzbijanje invazije stanica. Međutim, učinak Robo1 je potisnuta Mir-218 u prisutnosti Robo1 3'-UTR sadrži vezna mjesta Mir-218. Obaranje Robo1 po siRNA u MKN28-M stanice inhibirana invazije stanica, koja je pala na razine slične onima koje su primijećene nakon transfekcije s Mir-218-izražava vektora (Slika 5E i 5F). Ova opažanja ukazuju na to da Mir-218 direktno potiskuje staničnu invaziju Robo1 posredovane. Pregled

Slit2, ali ne Slit3, može komunicirati s Robo1, obogaćen nedostatku Mir-218, za promicanje GC invazija pregled

Dvije vrste miRNAs postoje: među-a intronske. Bivši se nalazi u ne-kodirajuće regije između gena i njihove odgovarajuće Pri-miRNAs općenito prepisuju iz vlastitih promotora s RNA polimerazom II. Potonji se nalaze unutar introna gena domaćina, a njihov biogeneza kontrolira od strane domaćina gena promotora [41], [42]. Mir-218 je intronske Mirne. Dva gena kod za zrelu Mir-218, Mir-218-1 i Mir-218-2, koji se nalazi unutar introna 15 Slit2 i introna 14 Slit3, odnosno (slika 6a). Intronske Lokacija dva Mir-218 gena potaknula nas pitati da li Mir-218-1 i Mir-218-2 prepisuju zajedno sa svojim mRNA domaćina gena. Da bi testirali tu hipotezu, koristili smo QRT-PCR ispitati ekspresiju Mir-218-1 prekursora, Mir-218-2 prethodnik, zrele Mir-218, Slit2 mRNA i Slit3 mRNA u GC tkiva koji se koriste u opstanak analiza. Statistička analiza koeficijenta korelacije rezultata QRT-PCR pokazala je značajnu pozitivnu korelaciju između razine Slit2 mRNA i Mir-218-1 i između razina Slit3 mRNA i Mir-218-2 (Slika 6B i 6C). Ovi rezultati pokazuju da je Mir-218 kodirane gene, Mir-218-1 i Mir-218-2, prepisuju se zajedno sa svojim genima domaćina, Slit2 i Slit3, respektivno. Značajna pozitivna korelacija između razine Mir-218 i Mir-218-2 (Slika 6D) je viđen u GC; Međutim, takva korelacija je viđen između razine Mir-218 i Mir-218-1 (Slika 6e). Ovi rezultati pokazuju da regulacija od Mir-218 u GC promovira smanjenje Mir-218-2, ali ne u Mir-218-1. U skladu s tom kraju, Slit3 ekspresija se znatno smanjila u GC (-22,43 ± 0,21, srednja vrijednost ± SE) u usporedbi sa normalnim tkivom želučanog (-20,79 ± 0,23, srednja vrijednost ± SE), ( P pregled i 0,0001, t = 7,67, u paru t pregled -test) (Slika 6F), dok Slit2 izraz nije bio značajno različit ( P pregled = 0,0772, u paru t pregled -test) ( slika 6 g). Ukratko, naši eksperimentalni rezultati pokazuju da značajan regulaciju gena Robo1 odgovor na uklanjanje Mir-218 može izazvati naknadno reguliranje prema prorez-Robo1 put kroz njegove interakcije s Slit2, olakšava migraciju tumorskih stanica i invaziju. Pregled

Rasprava pregled

za proučavanje bolesti, neophodno je da se konstruirati idealno model. U ovom istraživanju, izolirani smo invazivne i neinvazivne stanične subpopulacije od utvrđenih GC humanih stanica pomoću ponavlja prerastanja pristup, koji je uspješno primijenjen u mnogim studijama istražuje tumorskih metastaza [43] - [48]. Rezultati metastatskim pregleda In vitro
i in vivo pregled je pokazao da su utvrđeni stanica podlinije imali različita invazivne i metastatskih sposobnosti. Ovdje prikazan ne samo sublini stanice izvedene iz GC staničnim linijama s visokim-invazivni potencijal, ali i onih s niskim invazivni potencijal. S izuzetkom njihovih metastatskih sposobnosti, izabrane stanične podlinije bili su vrlo slični, jer dijele isti genetski pozadinu. Budući da je glavna razlika između te dvije vrste sublini je metastatski sposobnost, geni koji se razlikuju između njih treba dobro koreliraju s metastazama. Osim toga, naša metoda je u stanju razlikovati invazije faze s metastazama i omogućuje proučavanje određenih koraka u metastaza, što se ne može ocijeniti u live-u životinjskom modelu. Pregled

Nedavno miRNAs su izvijestili da promicanje [49] [50] ili potisnuti [51] - [54] metastaze tumora, pružajući novu perspektivu na metastatski proces. Ipak, uloga miRNAs u GC metastaza nedostaje. U ovom izvješću, istraživali smo i dobili po prvi put 45 metastaza povezanih miRNAs u GC na temelju dobro uhodanom modelu metastaze stanica. Otkriće da Mir-218 je regulirani u metastatskog GC je intrigantna, kao i smanjena razina Mir-218 su zabilježene u nekoliko vrsta solidnih tumora [24] - [27], [55], što znači da je gubitak Mir-218 može biti zajednički događaj u nastanku tumora. U ovom istraživanju, usredotočeni smo na učinak Mir-218 na GC metastaza i pokazala da Mir-218 djeluje kao supresor tumora u GC metastaza. Obnova Mir-218 migracije smanjene stanice i invaziju In vitro pregled i metastaze tumora in vivo pregled. Do nastanka stabilnih staničnih linija koje prekomjerno ekspresivne miR-218, što su transfektirane MKN28-M stanica s miR-218 plazmida i pomoću G418. Odabrali smo dvanaest stanica kolonije u Mir-218 transfektiranoj grupe i našli 10 od 12 kolonija izlaže izvanredno jedinstvena, stabilna i izraz visokoj razini Mir-218. Osim toga, tri slučajno odabrana monoklonska stanične linije izložene slično smanjenje invazivnih ablility. Međutim, plazmid transfekcije strategije često rezultiraju manje učinkovitosti integracije u odnosu na virusne izražavanja dovodi do mogućnosti odabira stohastičkog rijetkih funkcionalno heterogenih varijante od početne rasute stanovništva. Stoga je budućnost korištenje virusne ekspresije treba stvoriti više nepristran početnu populaciju testirati hipotezu. Pregled

U sklopu našeg istraživanja o tome kako je gubitak Mir-218 utječe na GC metastaza, pokazali smo da Robo1 je kritična nizvodni cilj Mir-218. Poznato je da Robo je receptor usmjeravanje aksona iz proreza i konzervirana u životinja u rasponu od muhe sisavcima. U sisavaca, tri prorez (Slit1-3) i četiri Robo (Robo1-4) gena su opisani [56], [57]. Prorez-Robo interakcije prenose signale koji posreduju odbojne znakove na aksona i kukova rasta tijekom živčanog razvoja i sudjelovati u T stanica i monocita kemotaksije [58] - [64]. Što se tiče drugih razvojnih putova, ekspresiji proreza -
Robo geni uočen u različitim vrstama tumora [65] - [68]. Na primjer, u uzorcima karcinoma dojke tkiva, Robo1 je pokazala da prekomjerno ekpresivne, te je pokazano da izazivaju migraciju stanične linije raka dojke [37]. Slit2-Robo1 signaliziranje olakšava gliom stanične migracije [36] i uključen u angiogenezu povećanjem gustoće mikrožila tumora i mase u modelu tumora ksenografta [30]. Wang et al. Pregled pokazala da je prekomjerna ekspresija Robo1 u novih krvnih žila u tumorima potiče raka neovaskularizacije i rast putem interakcije Robo1 i njegov ligand, Slit2. Oni su također identificirani, fosfoinozitid-3-kinaze (PI-3 k) kao nizvodni efektor Slit2 /Robo1 signalizaciju. To sugerira da postoji u obliku proreza Robo1-PI-3K kaskadu koja može dovesti do stvaranja fosfoinozitola-3,4,5-trifosfata i zatim aktivaciju malih GTP koji posreduju kretanje stanica i remodeliranje aktinskog citoskeleta [30] [35]. Nasuprot tome, druge studije tvrde da je regulacija od Robo1 uzrokovane brisanja ili epigenetičkim modifikacije mogu igrati ulogu u progresiji tumora [69] - [73]. Predlažemo da postoji određeno tkivo ekspresije za prorez-Robo gena. Pregled

U trenutnoj studiji, otkrili smo da Robo1 često se izrazio u visokim razinama u invazivnih stanica i na niskim razinama u neinvazivnim stanica , dok je mir-218 prikazuje suprotan izraz uzorak. Kada smo transfektirane Mir-218-vektor ekspresije i zabranjivanje oligonukleotida u MKN28-M i MKN28-NM stanica, odnosno, inverzni ekspresije zabilježena je između Mir-218 i Robo1, koja je, ako je Mir-218 je izraz lica bio visok, Robo1 izraz lica bio je nizak i obrnuto. Taj rezultat je bio dalje potvrđuju kliničkim uzorcima i u testovima aktivnost luciferaze. Također smo primijetili da indukcija ekspresije Robo1 od Robo1 konstrukcija mutanta bez miR-218 veznog mjesta može preokrenuti miR-218-posredovanu supresiju invazije tumorskih stanica. Nasuprot tome, obaranje ekspresije gena Robo1 RNAi imao utjecaj na smanjenje invaziju tumorskih stanica sličan onome obnove Mir-218, iako same Robo1 obaranje pokazao slab učinak. To bi moglo biti zbog Robo1 nije jedina meta Mir-218 koji je relevantan za metastaze tumora. Ovi rezultati pokazuju da je invazija potiskivanje učinak Mir-218 je barem djelomično posredovana smanjenja Robo1 izražavanja. To je ujedno i prvo istraživanje koje pokazuje da je tumorski gen Robo1 negativno reguliran je Mir-218 preko određene ciljne stranice (nt 971-978) u roku od 3 'UTR. Robo1 receptor je ključno za odgovor na izvanstanične signale i staničnih fenotipskih promjena; dakle, čvrsto regulacija Robo1 receptora strane Mir-218 može olakšati robusniji prijenosu signala. Anti-Robo1 monoklonsko antitijelo je izvijestila da biti učinkovit tretman za rak Robo1-izražavanje [30], [33]. U ovom istraživanju, otkrili smo novi inhibitor Robo1, Mir-218, koji se možda mogu koristiti za liječenje nekih vrsta raka. Pregled

Kao što je gore spomenuto, Slit1, Slit2 i Slit3 obuhvaćaju obitelj prorez proteina. Iako su geni preklapaju, njihovo izražavanje uzorci i funkcije su različita. Dosadašnji dva proteina su poznati da se uključe u aksona smjernice i migraciju stanica [37], [74], dok Slit3 je uključen u razvoj organa i organskih sustava, uključujući dijafragmu i bubrega [75]. U dogovoru s tim podacima, otkrili smo da Slit2, ali ne Slit3, u interakciji s Robo1 promovirati GC invazije. Pregled

Osim toga, pokazali smo da su Mir-218 geni koji kodiraju nalazi u i prepisao zajedno sa slit genima koji su Robo1 ligandi, stvarajući negativna povratna sprega koja regulira emisije mjehurića /Robo1 signalizaciju. Sailen Barik pokazali da intronske Mirna, Mir-338, ušutkao gene koji su funkcionalno antagonistički na njegovu domaćin genskog produkta, stvarajući pozitivnu povratnu petlju koja pomaže u fiziološkoj ulozi gena domaćina [76].