PLoS ONE: miR-26a Unterdrückt Tumorwachstum und Metastasierung von FGF9 Targeting in Gastric Cancer

Abstrakt

Die Rolle der miR-26a in Krebszellen schien umstritten in früheren Studien. Bisher bleibt die Rolle der miR-26a in Magenkrebs nicht definiert. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass miR-26a stark bei Magenkrebs (GC) Geweben und Zelllinien nach unten reguliert wurde, und ihre Expressionsniveaus wurden mit Lymphknotenmetastasen und klinischen Stadium verbunden sind, sowie das Gesamtüberleben und replase freie Überleben von GC . Wir fanden auch, dass die ektopische Expression von miR-26a gehemmt GC Zell-Proliferation und GC Metastase In-vitro-
und in vivo
. Wir ferner einen neuen Mechanismus der miR-26a identifiziert GC Wachstum und die Metastasierung zu unterdrücken. FGF9 wurde erwies sich als ein direktes Ziel von miR-26a zu sein, Luciferase-Assay und Western-Blot unter Verwendung. FGF9 Überexpression in miR-26a-exprimierenden Zellen könnten Invasion und Wachstumsstörungen von miR-26a retten. Darüber hinaus umgekehrt miR-26a-Expression mit FGF9-Proteinspiegel in der GC korreliert. Zusammengenommen unsere Daten deuten darauf hin, dass miR-26a fungiert als Tumorsuppressor in GC Entwicklung und Progression, und hält Versprechen als prognostischer Biomarker und mögliches therapeutisches Ziel für die GC

Citation:. Lu Deng M, Tang Hl, Xh, Liu My, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a Unterdrückt Tumorwachstum und Metastasierung von FGF9 Targeting in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662

Herausgeber: H. Sunny Sun, Institut für Molekulare Medizin, Taiwan

Empfangen: 29. März 2013; Akzeptiert: 12. Juli 2013 beginnen; Veröffentlicht: 28. August 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Natur Scientific Foundation of China (81101526, 31100936) und Guangzhou Medical College Arzt beginnen Foundation (2012C11) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

miRNAs sind endogen exprimiert, kleine nicht-kodierende RNAs, die sich negativ durch die Genexpression regulieren was zu einer Verschlechterung der Ziel-mRNAs, die Hemmung der Translation dieser mRNAs oder beide [1]. miRNAs nehmen einen Teil in wichtigen zellulären Prozessen wie der Stressantwort, Entwicklung, Differenzierung, Apoptose und Proliferation [2]. Veränderte miRNA-Expression wurde in zahlreichen Malignitäten berichtet, einschließlich Brust [3], [4], der Lunge [5], Leber [6], Magen [7], Kolon [8] Gehirn [9], Leukämie [10], und Lymphom [11]. Eine wachsende Zahl von Studien haben gezeigt, dass miRNAs als Onkogene oder Tumorsuppressoren funktionieren kann, und sie werden oft in Tumoren [12], [13] dysreguliert. In dieser Hinsicht sind onkogene miRNAs häufig hochreguliert, während Tumor-unterdrück miRNAs in Tumoren herunterreguliert werden. Zum Beispiel let-7 berichtet worden in Lungenkrebs unterexprimiert werden und der onkogenen Ras [14] Ziel, [15]. Wir bereits berichtet, dass miR-216b stark in Nasopharynxkarzinom nach unten reguliert wird und dämpft das Tumorwachstum von KRAS-Targeting [16]. Im Gegensatz dazu werden die onkogenen miR-17-92 Cluster von miRNAs in Vielzahl von Tumor aufreguliert [17] und erzwungene Expression dieser miRNAs in der gut untersuchtes Eu-myc transgenen Mausmodell von B-Zell-Lymphom dramatisch beschleunigt Krankheit Beginn und Fortschreiten [18]. Allerdings schien die Rolle von miR-26a in Krebszellen umstritten, da sie ein Tumorsuppressor in hepatozellulärem Karzinom ist [19], Brustkrebs [20] und Nasopharynxkarzinom [21], [22], aber ist ein Onkogen in Gliom [23 ] und cholangiocarcinoma [24]. Bisher war nicht definiert die Rolle der miR-26 in Magenkrebs.

In der vorliegenden Studie haben wir miR-26a-Expression in 40 normalen und GC Proben durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Analyse gepaart geprüft . miR-26a wurde stark nach unten reguliert werden in GC Geweben wie mit der angrenzenden normalen Magen Gewebe verglichen. Dieses Ergebnis wurde durch auf Tissue Microarrays in-situ-Hybridisierung bestätigt, bestehend aus 126 Fälle von GC Gewebe und 41 Fälle von benachbarten normalen Geweben. Darüber hinaus verringerten sich miR-26a wurde mit einer schlechten Prognose assoziiert und könnten unabhängig Gesamtüberleben (OS) und replase freie Überleben (RFS) bei Magenkrebs vorherzusagen. Funktionelle Untersuchungen ergaben, dass miR-26a GC Zellwachstum unterdrückt und die Metastasierung von FGF9 Targeting.

Ergebnisse |

miR-26a ist nach unten reguliert in menschlichen Magenkrebs

Mit einem qRT-PCR Verfahren, miR-26a-Spiegel wurden in 40 Paare von Magenkrebs-Gewebe und deren abgestimmte benachbarte Gewebe sowie Magen-Zelllinien nachgewiesen. Unter den 40 Patienten mit Magenkrebs, etwa 70% (28 von 40 Patienten), von Tumoren zeigten eine mehr als zweifache Verminderung in miR-26a Ebenen, mit einer 5,76-fachen Reduktion relativ zu benachbarten normalen Gewebe, was darauf hindeutet, daß die Reduktion von miR -26a war ein häufiges Ereignis in der menschlichen GC (1A). Darüber hinaus wurde miR-26a Expression in allen Magenkrebs-Zelllinien (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, und BGC-823) reduziert, verglichen mit dem nicht-maligne Magenzelllinie GES-1 (Abbildung 1B). Zur weiteren Überprüfung der Ergebnisse in Bezug auf die biologische Rolle von miR-26a in menschlichen Magen Karzinogenese beschäftigten wir in-situ-Hybridisierung miR-26a-Expression in 126 GCs und 41 Nicht-Tumor-Gewebe auf Gewebe-Mikroarrays (TMA) zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression Noten von miR-26a wurden in GCs im Vergleich zu normalen Geweben (1C) signifikant verringert. Als nächstes haben wir festgestellt, die potenziellen klinisch-pathologischen Auswirkungen der veränderten miR-26a Ausdruck. Klinische Proben wurden in niedrige Expression aufgeteilt und hohe Expression Gruppen auf Basis von miR-26a Ausdruck Scores größer oder kleiner als der Median. In Übereinstimmung mit den oben genannten Daten von 41 gesamt normalen Magen-Proben, 35 (85%) hatten eine hohe Expression von miR-26a. Im Gegensatz dazu 60% (76 von 126) des Magenkarzinoms Proben hatten geringe negative Expression von miR-26a. Der 126 Personen mit GC wurden 38 für Lymphknotenmetastase negativ, und 45% dieser Patienten zu negativen Expression von miR-26a (Tabelle 1) war gering. Achtundachtzig Patienten waren für Lymphknotenmetastasen positiv, und 67% von ihnen zeigten Herabregulation oder den Verlust von miR-26a (Tabelle 1). Darüber hinaus fanden wir geringe Expression von miR-26a in 37% und 77% der Magentumoren als Stufe I klassifiziert /II und Stufe III /IV (Tabelle 1). Daher invers miR-26a-Expression korreliert mit Lymphknotenmetastasen und klinischen Stadium ( P
= 0,019 und P
< 0,001). Allerdings hat miR-26a nicht mit dem Alter, Geschlecht, Zelldifferenzierung oder Invasionstiefe (T-Stadium) korrelieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die miR-26a könnte eine wichtige Rolle bei der GC-Metastasierung und Progression spielen.

Verminderte miR-26a korreliert mit einer schlechten klinischen Prognose

weiter Um die Bedeutung von miR-26a analysieren im Hinblick auf die klinische Prognose wurde Kaplan-Meier-Überlebensanalyse mit Patienten Gesamtüberleben und das rezidivfreie Überleben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Patienten mit niedrigem miR-26a Ausdruck hatte kürzere mediane OS und RFS als Patienten haben mit hoher miR-26a Ausdruck (21,6 Monate vs. 39,0 Monate, P
< 0,001 für OS; 15,2 Monate vs . 31,6 Monate, P
= 0,002 für RFS; 1D). Wir verwendeten Cox Proportional-Hazards-Regression, um die Assoziation zwischen miR-26a-Expression und Prognose zu bewerten. In univariate Analyse Lymphknotenmetastase, TNM-Stadium und miR-26a-Spiegel wurden signifikant mit dem OS zugeordnet und RFS (Tabelle 2, 3). Die endgültige multivariaten Modell ergab, dass die Gesamtüberlebenszeit signifikant auf Lymphknotenmetastasen abhing, TNM-Stadium und miR-26a Ebenen (Tabelle 2), und das rezidivfreie Überlebenszeit haben auf Lymphknotenmetastasen und miR-26a Ebenen (Tabelle 3).

miR-26a Unterdrückt GC Wachstum und die Metastasierung

die inverse Korrelation zwischen miR-26a Ebenen und Metastasierung Kenntnis nehmend, wir die Wirkung von miR-26a Wieder Ausdruck auf die Migration und Invasion Fähigkeiten untersucht GC-Zelllinien. Zwei GC-Zelllinien (SGC-7901 und AGS) mit relativ niedrigen Grundexpression von miR-26a (1B) wurden entweder mit miR-26a oder Steuer Lentiviren infiziert und ausgewählt mit 5 mg /l Puromycin für zwei Wochen. Weiter Wundheil Assay und Transwell-Assay durchgeführt wurden. Wie erwartet, die Überexpression von miR-26a signifikant die Zellmigration unterdrückt und Invasion Fähigkeiten (2A, B; Abbildung S1).

Um die Wirkung von miR-26a auf GC Wachstum zeigen, führten wir GC-Zellproliferationstest. Der Proliferationstest zeigte, dass die ektopische Expression von miR-26a in SGC-7901 und AGS Zellproliferation abgeschwächt im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 2C). Außerdem ektopische miR-26a Ausdruck Koloniebildung Fähigkeit, in Soft-Agar (2D) gehemmt. Wir führten dann Analyse-Zell-Apoptose und zeigte, dass miR-26a-Überexpression in SGC-7901 induziert Zell-Apoptose (Abbildung 2E).

Als nächstes testeten wir, ob miR-26a eine Rolle bei der Tumorentstehung durch Verwendung von nackten Maus Xenograft spielen könnte Modelle. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von miR-26a in SGC-7901-Zellen signifikant unterdrückt das Tumorwachstum in Nacktmäusen (3A; Abbildung S2). Dann SGC-7901-Zellen, infiziert mit entweder miR-26a oder Steuer lentivirsus wurden in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert Lungenmetastasen zu untersuchen. Wie gezeigt 3B, konnte eine deutlich geringere Anzahl von makroskopischen Lungenmetastasen in beobachtet werden miR-26a-Zellen als Kontrollzellen überexprimiert,. Diese Ergebnisse zeigen, dass miR-26a kann GC Wachstum und die Metastasierung unterdrücken.

miR-26a Direkt Ziele und Hemmt FGF9

Um zu verstehen, wie miR-26a GC Wachstum und die Metastasierung unterdrückt, haben wir drei Algorithmen (Targetscan, Pictar und Miranda) zu helfen, miR-26a Ziele in menschlichen Magenkrebserkrankungen zu identifizieren. Von diesen Zielgene, die von allen drei Algorithmen (Tabelle S1) vorhergesagt wurden, zog FGF9 unsere Aufmerksamkeit sofort, wie es bei der Tumorentstehung oder Metastasierung beteiligt ist [26] - [28]. Wir geklont in voller Länge FGF9 3'-UTR in ein Luciferase-Reportervektor. Luziferase-Assay ergab, dass miR-26a direkt gebunden an FGF9 3'-UTR, und durch die sie merklich reduziert Luziferaseaktivitäten (4A). Allerdings Mutation der mutmaßlichen miR-26a Stellen in der 3'-UTR von FGF9 außer Kraft gesetzt Luciferase Reaktion auf miR-26a (4A). Um direkt die Wirkung von miR-26a auf FGF9 Ausdruck beurteilen, führten wir Western-Blot-Analyse. Wie in 4B zu sehen ist, lentivirale induziert ektopische miR-26a unterdrückt dramatisch die FGF9-Proteinspiegel in SCG-7901 und AGS-Zellen. Darüber hinaus Zuschlags von miR-26a, durch Transfektion von anti-miR-26a, in GES-1-Zellen erhöht FGF9-Proteinspiegel (4B; Abbildung S1). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass eine direkte FGF9 stromabwärtigen Ziel für miR-26a in GC-Zellen ist. Die obigen Ergebnisse veranlassten uns zu prüfen, ob miR-26a GC Wachstum und die Metastasierung durch Unterdrückung FGF9 Ausdruck unterdrückt. Zu diesem Zweck wurde FGF9 in miR-26a-transfizierten SGC-7901-Zellen wieder zum Ausdruck gebracht. In miR-26a-exprimierenden Zellen, re-expression von FGF9 rettete die Invasion und Wachstum von Defekten miR-26a (4C, D, E). Schließlich haben wir getestet, ob miR-26a-Expression mit FGF9-Proteinspiegel in GC korreliert. Es gab eine inverse Korrelation zwischen den FGF9-Proteinspiegel, durch Immunhistochemie Färbung angegeben und miR-26a-Expression beurteilt durch in situ Hybridisierung in 126 GC Geweben auf TMAs wie oben verwendet (4F; Abbildung 1C). Unsere Ergebnisse zeigen, dass miR-26a hat Eigenschaften, die mit Tumor-Suppressor-Funktion. Die Fähigkeit, FGF9 Ebenen zu modulieren können, zumindest teilweise erklären, warum miR-26a GC Wachstum und die Metastasierung hemmen kann.

Diskussion

miR-26a gehört zur miR-26-Familie, die miR-26b enthält ein anderes Mitglied, die beide mit der Ausnahme von zwei verschiedenen Nucleotide in reifen miRNAs identische Sequenz beherbergen. miR-26a ist ein funktionelles miRNA, die vorherige Untersuchung verdient hat [29]. Es ist bekannt, dass miR-26a eine wesentliche Rolle bei dem Wachstum spielt, der Entwicklung und der Zelldifferenzierung von verschiedenen Geweben [29]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass miR-26a-Expression in einer Reihe von menschlichen Tumoren ungeordnet ist [19], [22], [24], [30], [31]. Jedoch keiner dieser Studien wird auf Magenkrebs im Zusammenhang. In der aktuellen Studie verwendeten wir qRT-PCR und ISH zu zeigen, dass miR-26a Spiegel im Gewebe Magenkrebs als die signifikant niedriger waren in Nicht-Tumorgewebe. Darüber hinaus wurden die miR-26a Ebenen mit dem klinischen Stadium und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen assoziiert. Kaplan-Meier-Überlebensanalyse zeigte, dass Patienten, deren Primärtumoren angezeigt geringe Expression von miR-26a eine kürzere OS und RFS in GC hatte. Darüber hinaus zeigte Cox Proportional-Hazards-Regression-Analyse, dass reduzierte miR-26a in Tumoren eine starke und unabhängige Prädiktor für kürzere OS und RFS war. Basierend auf Felddaten, wurde bereits berichtet, dass eine Kombination von mehreren miRNAs als prognostische Marker bei Magenkrebs nützlich sein kann [32], [33]. Zusätzlich ist ein Single-miRNA, wie miR-218, kann ein prognostischer Indikator sein [34]. Allerdings haben diese miRNAs wurden in nur wenigen Magenkrebs-Patienten untersucht. Hier kann miR-26a als prognostischer Marker nützlich sein, um vorherzusagen, das Überleben und Rezidiv bei Magenkrebs.

Diese Studie zeigte, dass die ektopische Expression von miR-26a in GC-Zellen beeinträchtigt Migration, Invasion, Proliferation und Koloniewachstum als und induziert Apoptose. Außerdem in vivo Daten zeigten, miR-26a Tumorwachstum und Metastasierung inhibiert. Diese in-vitro und in-vivo-Daten angegeben ist weiter, dass miR-26a fungiert als Tumorsuppressor in Magenkrebs. Mehrere Studien unterstützen unsere Ergebnisse. Zum Beispiel wird diese miRNA in NPC Gewebe verringert und kann durch Targeting EZH2 [22] das Zellwachstum und die Tumorgenese dämpfen. Das hepatozelluläre Karzinom zeigt auch eine verminderte Expression von miR-26a [19]. Systemische Verabreichung dieser miRNA in einem Mausmodell der HCC ein adeno-assoziiertes Virus (AAV) führt zu einer Hemmung der Krebszellproliferation, Induktion von tumorspezifischen Apoptose verwendet und dramatischen Schutz vor Krankheitsverlauf ohne Toxizität [35]. in letzter Zeit verschiedene Studien zeigten jedoch die onkogene Rolle der miR-26a in Tumoren wie Gliomen und cholangiocarcinoma. Huse et al. berichtet, dass miR-26a in hochgradigen Gliomen überexprimiert und direkt PTEN gezielte [23]. In ähnlicher Weise wurde miR-26a gefunden in menschlichen Geweben cholangiocarcinoma überexprimiert wird und cholangiocarcinoma Wachstum zu fördern, indem B-Catenin [24] aktiviert. Diese kontroverse Ergebnisse legten nahe, dass die Rolle von miR-26a war möglicherweise tumorspezifischen und stark abhängig von ihrer Ziele in verschiedenen Krebszellen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 und Cyclin E1 [37] sind potentielle Downstream-Zielgene von miR-26a. In dieser Studie FGF9, eine neue direkte und funktionelle Ziel von miR-26a, wurde im GC identifiziert. FGF9, die auch als glial-Aktivierungsfaktor bekannt ist, ist eine der 23 Mitglieder der FGF-Familie hoch konserviert. Als sekretiertes, glykosylierte 26-kDa-Protein, hat es mitogene Wirkung auf eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen [26]. FGF9 wurde in verschiedenen Krebsarten wie Eierstock- Adenokarzinom endometrioid [26], hepatozelluläres Karzinom [27] und Prostatakarzinom [28] zu Verbindung gebracht gezeigt. In unseren Studien haben wir bestätigt, dass FGF9 ein direktes Ziel von miR-26a in GC-Zellen war. Um zu bestimmen, ob miR-26a GC Wachstum und die Metastasierung durch Unterdrückung FGF9 Expression unterdrückt, fanden wir, dass die Überexpression FGF9 könnte Invasion und Wachstum von Defekten miR-26a retten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-26a GC Wachstum und die Metastasierung hemmt teilweise durch FGF9 Targeting.

Zusammengenommen wir Herabregulation von miR-26a in Magenkrebszellen beobachtet und gezeigt, dass miR-26a als unabhängiger Prädiktor wirken kann von OS und RFS. Wir fanden ferner, dass miR-26a die Potenz besitzt durch Regulierung FGF9 GC Wachstum und die Metastasierung zu unterdrücken. Unsere Ergebnisse legen nahe, miR-26a fungiert als Tumorsuppressor in GC und hält Versprechen als prognostischer Biomarker und mögliches therapeutisches Ziel für die GC.

Materialien und Methoden

Cell Culture

die Magen-epithelialen Zelllinie GES-1 wurde aus dem Peking-Institut für Krebsforschung (Beijing, China) erworben. Die GC-Zelllinien MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, und BGC-823 wurden von der chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (Peking, China) erhalten. Diese Zellen wurden bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO _{2 in RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901) gehalten, DMEM (GES-1) oder F12 ( AGS) Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin (Gibco BRL, NY, USA) ergänzt. Alle Transfektionen verwendet Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).}

klinischen Proben

Alle Gewebeproben in der vorliegenden Studie verwendet wurden aus der Provinz Hunan Tumor Krankenhaus gesammelt (Changsha, Hunan, China). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Guangzhou Health Authority zugelassen. Die Sammlung und Verwendung von Gewebe folgte den Verfahren, die in Übereinstimmung mit den ethischen Normen wie in der Erklärung von Helsinki formuliert

Gewebeproben von 40 Patienten mit Magenkrebs (23 männlich und 17 weiblich;. Durchschnittsalter 59 Jahre, Bereich 40-84 Jahre) wurden für die quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Analyse verwendet. Reseziert Krebsgewebe (Tumor) und gepaart abgestimmt normalen Magengewebe (Normal) wurden sofort geschnitten, in flüssigem Stickstoff eingefroren und aufbewahrt bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion.

Die Gewebe-Mikroarrays (TMA), bestehend aus 126 GCs und 41 angrenzenden normalen Magen Gewebe wurden für die in situ-Hybridisierungsanalyse verwendet. Das mittlere Alter der Patienten mit Magenkrebs bei Diagnose betrug 57 Jahre (Bereich 31-82). Die mediane Nachbeobachtungszeit für das Gesamtüberleben (OS) und das rezidivfreie Überleben (RFS) war 22 Monate und 15 Monate. Alle Daten von 126 GC-Proben, einschließlich Alter, Geschlecht, Tumorlokalisation, histologischen Grad, Invasionstiefe (T-Stadium), im klinischen Stadium, und Lymphknotenmetastasen wurden aus klinischer und pathologischer Aufzeichnungen erhalten und in ergänzenden Tabelle 2 zusammengefasst

Quantitative RT-PCR-Analyse

Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA). Reverse Transkription und qRT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines qSYBR-green PCR-Kit (Qiagen, Germantown, USA) und U6 snRNA wurde als endogene Kontrolle verwendet durchgeführt. Falten Änderung wurde als 2 ^{-ddCt bestimmt. Der Ct ist die fraktionierte Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz jeder Probe, welche die feste Schwelle durchläuft. Die DDCT wurde durch Subtrahieren der dCt der Referenzprobe (gepaart Nicht-Tumorgewebe für chirurgische Proben und GES-1-Zellen für sechs Magenkrebszelllinien) von der dCt jeder Probe berechnet. Die Sequenzen der spezifischen Primern für miR-26a und U6 snRNA waren 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'und 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', respectively.}

In situ Hybridisierung und Immunhistochemie

der Nachweis von miR-26a durch in-situ-Hybridisierung der DIG-markierten gesperrt Nukleinsäure verwendet (LNA) -Basis für miR-26a-spezifische Sonde (Exiqon, Vedbaek, Dänemark) nach durchgeführt wurde, um den Anweisungen des Herstellers und U6 snRNA wurde als positive Kontrolle verwendet. Brie fl y, Gewebe-Mikroarray-Objektträger wurden entparaffiniert, behandelt mit Proteinase K (5 min in 2 ug /ml Protease K), in PBS gewaschen und anschließend blockiert endogene Peroxidase-Aktivität mit 3% H _{2 O 2. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 52 ° C durchgeführt, nach der Zugabe von 50 nM DIG-markierten LNA-Sonden, gefolgt von einem stringenten Wasch in SSC-Puffer. Nach dem Blockieren (2% Schafserum und 2 mg /ml BSA in PBS mit Tween-20) bei Raumtemperatur wurde das Sonden-Target-Komplex sichtbar gemacht eines Anti-DIG-POD-Antikörper und DAB-Komplex verwendet wird.}

Die Immunhistochemie wurde an Gewebemikroarray-Sektionen durchgeführt unter Verwendung von anti-FGF9-Antikörper (Santa Cruz, CA, USA). Der Komplex wurde mit Streptavidin /Peroxidase und DAB-Komplex sichtbar gemacht, und Kerne mit Hämatoxylin gegengefärbt. In situ-Hybridisierung und Immunhistochemie Ergebnisse wurden durch Intensität (0-4) und der Prozentsatz der Färbung (0 bis 100%) erzielt. Relative Expression wurde durch die Multiplikation Intensität prozentual erhalten. Die Folien wurden von zwei unabhängigen Pathologen untersucht.

Recombinant Vector

Recombinant Lentiviren enthält miR-26a-Vorstufe oder Scramble-Sequenzen wurden von SunBio (Shanghai, China) erworben. Für Luciferase-Analyse wurde die Volllängen-FGF9 3'-UTR wurde aus menschlichem Blut genomische DNA amplifiziert und dann in den stromabwärtigen Bereich einer Glühwürmchen-Luciferase-Kassette, kloniert in PMIR-REPORT-Luciferase-Vektor (Ambion, Austin, TX, USA). Die entsprechenden mutierten Konstrukte, in denen die ersten sechs Nukleotide komplementär zu der miR-26a Saatgut-Region durch ortsgerichtete Mutagenese mutiert wurden (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Zu FGF9-exprimierenden Vektor, FGF9 ORF cDNA wurde aus GeneCopeia (Rockville, MD, USA) erworben und subkloniert in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay
konstruieren

miR-26a oder Gerangel Lentiviren und PMIR-3'UTR Vektor wurden in HEK-293T-Zellen cotransfiziert. Renilla-Luciferase und Glühwürmchen-Aktivitäten wurden mit dem Dual-Luciferase-Reporter-System (Promega, Madison, WI) 24 h nach der Transfektion gemessen. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde normalisiert Renilla Luciferase-Expression für jede Probe. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Western Blot

Western-Blot wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [16]. Kurz gesagt, Protein-Lysate wurden durch 10% SDS-PAGE getrennt und Elek-trophoretically auf PVDF (Polyvinylidendifluorid) -Membran überführt. Dann wurde die Membran mit Maus-Antikörper gegen Anti-FGF9-Antikörper (Santa Cruz, CA, USA), gefolgt von HRP (Meerrettich-Peroxidase) -markierten Ziege-Anti-Maus-IgG (Santa Cruz, CA, USA) und detektiert durch Chemilumineszenz inkubiert. β-Actin wurde als Protein-Ladekontrolle verwendet.

Cell Proliferation Assay

Die Zellen wurden plattiert auf 12-Well-Platten in den gewünschten Zellkonzentrationen. Zellzählungen wurden durch Trypsinisierung der Zellen geschätzt und Durchführung Analyse eines Coulter-Zählers (Beckman Coulter, Fullerton, USA) zu den angegebenen Zeitpunkten in dreifacher Ausfertigung mit.

Zellmigration und Invasion Assays

Die Zellmigration mit Wundheilungsassays untersucht. Eine künstliche "Wunde" wurde auf einer konfluenten Zellschicht erstellt und Fotografien wurden mit einem inversen Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) bei 24 Stunden in Anspruch genommen.

Für die Zellinvasionstest wurden die Zellen auf die Basalmembran ausgesät vorliegenden Matrix in dem Einsatz eines 24-Well-Kulturplatte (EC matrix, Chemicon, Temecula, CA) und fötalem Rinderserum wurde als chemoattractant in die untere Kammer gegeben. Nach weiteren 48 Stunden wurden die nicht-eindringenden Zellen und EC-Matrix vorsichtig mit einem Wattestäbchen entfernt. Invasive auf der unteren Seite der Kammer befindlichen Zellen wurden mit Kristallviolett, gezählt und abgebildet gefärbt.

Koloniebildungstest

Sechs-Well-Platten mit einer Schicht von 0,6% Agar in Medium bedeckt waren mit 20% fötalem Rinderserum ergänzt war. Die Zellen (1 × 10 ^{4) wurden in dreifacher Ausfertigung in 0,3% Agar und entkernt hergestellt. Nachdem die Platten bei 37 ° C zwei Wochen lang inkubiert wurden, wurden die Kolonien gezählt.}

Apoptosis Analysis

Die apoptotischen Zellen durch Annexin V-FITC und Propidiumiodid-Färbung (BD, USA ausgewertet ) und mit einem FACS Calibur Instrument (BD, USA) analysiert. Die gesammelten Daten wurden mit FlowJosoftware analysiert.

Mouse Xenograftmodell

Der Magenkrebs-Modell in Nacktmäusen wurde konstruiert wie vor [25] beschrieben. Zur Auswertung wurden die Rolle der miR-26a in Tumorbildung, SGC-7901-Zellen, infiziert mit miR-26a oder Scramble Viren vermehrt und subkutan in die dorsale Flanken von Nacktmäusen (5 in jeder Gruppe) beimpft. Die Tumorgröße wurde alle 5 Tage gemessen. Nach 30 Tagen wurden die Mäuse getötet wurden necropsies durchgeführt und wurden die Tumore gewogen. Die Tumorvolumina wurden nach der folgenden Formel bestimmt: A × B ^{2/2, wobei A der größte Durchmesser und B ist der Durchmesser, senkrecht zu A. miR-26a durch ihren Effekt auf die Tumormetastasierung assay, SGC-7901-Zellen, infiziert mit miR-26a oder Scramble-Viren wurden in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert (6 in jeder Gruppe). Nach 45 Tagen wurden necropsies durchgeführt. Zahlen von Mikrometastasen in Lunge pro HE-gefärbten Abschnitt in einzelnen Mäusen durch Morphologie Beobachtung analysiert. Die experimentellen Protokolle wurden von der Animal Research Protection Committee von Guangzhou Medical University genehmigt. Standard-Tierpflege und Laborrichtlinien wurden befolgt.}

Statistische Analyse

Vergleiche zwischen den Gruppen analysiert wurden von der t-
Test und x ^{2-Test. Die Gesamtüberlebenskurven und rezidivfreie Kurven wurden mit der Kaplan-Meier-Methode aufgetragen, mit dem Log-Rank-Test zum Vergleich angewendet. Das Überleben wurde vom Tag der Operation gemessen. Variablen mit einem Wert von P
< 0,05 nach der univariaten Analyse wurden in den folgenden multivariaten Analyse auf der Grundlage der Cox-Proportional-Hazards-Modell verwendet. Spearman-Korrelationstests wurden verwendet, um die paarweise Ausdruck Korrelation zwischen miR-26a und FGF9 in GC Gewebe zu bewerten. Alle Unterschiede waren statistisch signifikant auf dem Niveau von P
≤0.05. Statistische Analysen wurden mit SPSS15.0 Software.}

Grundinformationen
Abbildung S1.
qRT-PCR gemessen, um die miR-26a-Expressionsniveaus in SGC-7901 und AGS-Zellen infiziert mit miR-26a Lentiviren sowie GES-1-Zellen, die mit miR-26a-Inhibitoren
doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
Abbildung S2.
qRT-PCR gemessen, um die miR-26a Expression von Tumor aus nackten Mäusen extrahiert Gewebe am 30. Tag nach der Injektion von Krebszellen. Alle Daten sind als Mittelwert ± s.e.m gezeigt
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Tabelle S1.
Zielgene, die von allen drei Algorithmen vorhergesagt wurden (Targetscan, Pictar und Miranda)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
Tabelle S2.
Merkmale von Patienten mit Magenkrebs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Acknowledgments

Wir danken J Ma und CK Wang für ihre technische Unterstützung.

• PLoS ONE: ERCC1 und ERCC2 Varianten Predict Überleben in Patienten mit Magenkrebs
• PLoS ONE: Klinische Bedeutung von MYT1L Gen-Polymorphismen in der chinesischen Patienten mit Magenkrebs