PLOS ONE: miR-26a Supprime la croissance tumorale et les métastases en ciblant FGF9 dans gastrique Cancer

Résumé

Le rôle de miR-26a dans les cellules cancéreuses semblait controversée dans les études précédentes. Jusqu'à présent, le rôle de miR-26a dans le cancer gastrique reste indéfini. Dans cette étude, nous avons constaté que miR-26a a été fortement downregulated dans le cancer gastrique (GC) des tissus et des lignées cellulaires, et ses niveaux d'expression ont été associés à des métastases des ganglions lymphatiques et le stade clinique, ainsi que la survie globale et la survie sans replase-GC . Nous avons également constaté que l'expression ectopique de miR-26a a inhibé la prolifération des cellules GC et GC métastase in vitro
et in vivo
. Nous avons identifié en outre un nouveau mécanisme de miR-26a pour supprimer la croissance de GC et les métastases. FGF9 a été prouvé être une cible directe de miR-26a, utilisant un dosage luciférase et western blot. FGF9 surexpression dans des cellules-26a exprimant miR pourrait sauver l'invasion et la croissance des défauts de miR-26a. En outre, l'expression de miR-26a inversement corrélée avec les taux de protéine dans le FGF9 GC. Pris ensemble, nos données suggèrent que les fonctions miR-26a comme un suppresseur de tumeur dans le développement de GC et de la progression, et détient la promesse comme un biomarqueur pronostique et cible thérapeutique potentielle pour GC

Citation:. Deng M, Tang Hl, Lu Xh, Liu Ma, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a Supprime la croissance tumorale et les métastases en ciblant FGF9 dans le cancer gastrique. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662

Editeur: H. Ensoleillé Sun, Institut de médecine moléculaire, Taiwan

Reçu le 29 Mars 2013; Accepté 12 Juillet 2013; Publié: 28 Août 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Deng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de la Fondation scientifique Nature de la Chine (81101526, 31100936) et la Fondation Guangzhou Medical College Doctor Démarrer (2012C11). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

miARN sont exprimés de manière endogène, de petits ARN non codants qui régulent négativement l'expression du gène en provoquant la dégradation de l'ARNm cible, une inhibition de la traduction de ces ARNm ou les deux [1]. miARN prennent une part dans les processus cellulaires essentiels tels que la réponse au stress, le développement, la différenciation, l'apoptose et la prolifération [2]. expression miRNA Altered a été rapportée dans de nombreuses tumeurs malignes, notamment du sein [3], [4], du poumon [5], le foie [6], de l'estomac [7], du côlon [8], le cerveau [9], la leucémie [10], et le lymphome [11]. Un nombre croissant d'études ont démontré que les miARN peuvent fonctionner comme oncogènes ou suppresseurs de tumeurs, et ils sont souvent dérégulée dans les tumeurs [12], [13]. A cet égard, les miRNAs oncogènes sont fréquemment régulés à la hausse, tandis que les miARN suppresseurs de tumeurs sont régulés à la baisse dans les tumeurs. Par exemple, let-7 a été signalé à être dans le sous-exprimés cancer du poumon et de cibler l'oncogène Ras [14], [15]. Nous avons précédemment rapporté que miR-216b est fortement downregulated dans le carcinome du nasopharynx et atténue la croissance de la tumeur en ciblant KRAS [16]. En revanche, l'oncogène miR-17-92 groupe de miARN sont régulés à la hausse dans une variété de tumeurs [17], et appliqué l'expression de ces miARN dans le modèle Eμ-myc souris transgénique bien étudié de lymphome à cellules B accélère considérablement l'apparition et de progression de la maladie [18]. Cependant, le rôle de miR-26a dans les cellules cancéreuses a semblé controversé car il est un gène suppresseur de tumeur dans le carcinome hépatocellulaire [19], le cancer du sein [20] et le cancer du nasopharynx [21], [22], mais est un oncogène dans les gliomes [23 ] et cholangiocarcinome [24]. Jusqu'à présent, le rôle de miR-26 dans le cancer gastrique était indéfini.

Dans la présente étude, nous avons examiné l'expression de miR-26a dans 40 échantillons appariés normaux et GC par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) . miR-26a a été trouvée être fortement régulée à la baisse dans les tissus GC par rapport à celle des tissus normaux adjacents à l'estomac. Ce résultat a été confirmé par hybridation in situ sur les matrices tissulaires, comprenant des 126 cas de tissus GC et 41 cas de tissus normaux adjacents. En outre, une diminution de miR-26a a été associée à un mauvais pronostic et pourrait indépendamment prédire la survie globale (OS) et la survie sans replase (RFS) dans le cancer gastrique. Des études fonctionnelles ont révélé que miR-26a supprimé la croissance des cellules GC et les métastases en ciblant FGF9.

Résultats

miR-26a est downregulated dans Human Cancer gastrique

L'utilisation d'un qRT-PCR méthode, les niveaux de miR-26a ont été détectés dans 40 paires de tissus gastriques du cancer et leurs tissus adjacents appariés, ainsi que des lignées de cellules gastriques. Parmi les 40 patients atteints d'un cancer gastrique, environ 70% (28 patients sur 40) des tumeurs a révélé une réduction de plus de deux fois dans les niveaux de miR-26a, avec une réduction de 5,76 fois par rapport à des tissus normaux adjacents, ce qui suggère que la réduction de miR -26a est un événement fréquent dans GC humaine (figure 1A). En outre, l'expression de miR-26a a été réduite dans toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, et BGC-823) par rapport à la lignée cellulaire gastrique nonmalignant GES-1 (Figure 1B). Pour vérifier davantage les résultats concernant le rôle biologique de miR-26a dans la carcinogenèse gastrique humaine, nous avons utilisé l'hybridation in situ pour évaluer l'expression de miR-26a dans 126 CG et 41 tissus non-tumorales sur des microréseaux de tissus (AGT). Les résultats ont révélé que les scores d'expression de miR-26a ont été significativement diminuées chez GCS par rapport aux tissus normaux (Figure 1C). Ensuite, nous avons déterminé les implications potentielles de clinicopathologiques modifié l'expression de miR-26a. Les échantillons cliniques ont été divisés en faible expression et des groupes d'expression élevés sur la base de l'expression de miR-26a scores plus ou moins que la médiane. En accord avec les données ci-dessus, sur 41 échantillons d'estomac normaux totaux, 35 (85%) avaient une expression élevée de miR-26a. En revanche, 60% (76 sur 126) des spécimens de carcinome gastrique avait une faible à l'expression négative de miR-26a. Sur les 126 individus avec GC, 38 étaient négatifs pour les métastases ganglionnaires, et 45% de ces patients avaient une faible à l'expression négative de miR-26a (tableau 1). Quatre-vingt-huit patients ont été positifs pour les métastases ganglionnaires, et 67% d'entre eux ont montré une régulation négative ou la perte de miR-26a (tableau 1). De plus, nous avons trouvé une faible expression de miR-26a dans 37% et 77% des tumeurs gastriques classés comme stade I /II et de phase III /IV, respectivement (tableau 1). Par conséquent, l'expression de miR-26a est en corrélation inverse avec les métastases des ganglions lymphatiques et le stade clinique ( P
= 0,019 et P
< 0,001, respectivement). Cependant, miR-26a n'a pas en corrélation avec l'âge, le sexe, la différenciation cellulaire, ou la profondeur d'invasion (stade T). Ces résultats suggèrent que le miR-26a pourrait jouer un rôle crucial dans la métastase de GC et de la progression.

Diminution de miR-26a corrèle avec un mauvais pronostic clinique

Pour analyser plus l'importance de miR-26a en termes de pronostic clinique, Kaplan-Meier analyse de survie a été réalisée à l'aide de la survie globale des patients et la survie sans rechute. Les résultats ont démontré que les patients atteints de faible expression miR-26a avaient plus court OS médiane et RFS que les patients présentant une expression élevée miR-26a (21,6 mois vs 39,0 mois, P
< 0,001 pour OS; 15,2 mois vs . 31,6 mois, P
= 0,002 pour RFS; Figure 1D). Nous avons utilisé Cox à risques proportionnels de régression pour évaluer davantage l'association entre l'expression de miR-26a et le pronostic. En analyse univariée, métastases ganglionnaires, stade TNM, et les niveaux miR-26a étaient significativement associés à l'OS et RFS (tableau 2, 3). Le modèle multivarié a révélé que le temps de survie globale dépendait de manière significative sur les métastases ganglionnaires, stade TNM, et les niveaux miR-26a (tableau 2), et le temps de survie sans rechute fait sur métastases ganglionnaires et niveaux miR-26a (tableau 3).

miR-26a Elimine GC croissance et métastase

Notant la corrélation inverse entre les niveaux miR-26a et les métastases, nous avons étudié l'effet de miR-26a ré-expression sur les migrations et l'invasion de capacités des lignées de cellules GC. Deux lignées de cellules GC (SGC-7901 et AGS) relativement faible expression basale de miR-26a (figure 1B) ont été infectées avec miR-26a ou le contrôle lentivirus et sélectionnés avec 5 mg /l puromycine pendant deux semaines. Ensuite, cicatrisation des plaies dosage et le dosage Transwell ont été réalisées. Comme on s'y attendait, la surexpression de miR-26a a supprimé de manière significative la migration cellulaire et l'invasion des capacités (figure 2A, B; Figure S1).

Pour démontrer l'effet de miR-26a sur la croissance du CPG, nous avons effectué des test de prolifération des cellules GC. Le dosage de prolifération a montré que l'expression ectopique de miR-26a-CGT 7901 et AGS atténué la prolifération cellulaire par rapport aux cellules témoins (figure 2C). En outre, l'expression ectopique de miR-26a inhibée colonie la capacité de formation dans la gélose molle (figure 2D). Nous avons ensuite effectué une analyse de l'apoptose cellulaire et a révélé que miR-26a surexpression dans SGC-7901 cellulaire induite par l'apoptose (Figure 2F).

Ensuite, nous avons testé si miR-26a pourrait jouer un rôle dans la tumorigenèse en utilisant xénogreffe de souris nude des modèles. Nous avons découvert que la surexpression de miR-26a dans les cellules CGT-7901 significativement supprimées la croissance tumorale chez des souris nude (figure 3A, la figure S2). Ensuite, les cellules SGC-7901 infectées soit avec miR-26a ou de contrôle lentivirsus ont été injectés dans la veine de la queue de souris nues pour examiner les métastases du poumon. Comme le montre la figure 3B, un nombre significativement plus faible de métastases pulmonaires macroscopiques a pu être observée dans miR-26a cellules surexprimant que les cellules témoins. Ces résultats indiquent que miR-26a peut réprimer la croissance de la GC et les métastases.

miR-26a cible directement et inhibitions FGF9

Pour comprendre comment miR-26a supprime la croissance des GC et des métastases, nous avons utilisé trois algorithmes (Targetscan, Pictar et Miranda) pour aider à identifier les cibles miR-26a dans les cancers gastriques humaines. Ces gènes cibles qui ont été prédites par les trois algorithmes (tableau S1), le FGF9 a attiré notre attention immédiatement car il a été impliquée dans la tumorigenèse et les métastases [26] - [28]. Nous avons cloné la pleine longueur FGF9 3'-UTR dans un vecteur rapporteur de la luciférase. dosage de la luciférase a révélé que miR-26a directement lié à FGF9 3 'UTR, et par laquelle elle remarquablement réduite des activités de la luciférase (figure 4A). Cependant, la mutation des sites miR-26a putatifs dans l'extrémité 3 'UTR du FGF9 abrogeait réaction luciférase miR-26a (figure 4A). Pour évaluer directement l'effet de miR-26a sur l'expression de FGF9, nous avons effectué une analyse Western blot. Comme on le voit sur la figure 4B, lentivirale induite par miR-26a ectopique considérablement supprimé les taux de protéine dans le FGF9 SCG-7901 et les cellules AGS. En outre, knockdown de miR-26a, par le biais de la transfection d'anticorps anti-miR-26a, dans GES-1 des cellules a augmenté les taux de protéine FGF9 (figure 4B, la figure S1). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le FGF9 est une cible en aval directe pour miR-26a dans des cellules GC. Les résultats ci-dessus nous ont incités à examiner si miR-26a supprime la croissance des GC et des métastases à travers la répression expression FGF9. A cet effet, le FGF9 a été ré-exprimé dans les cellules CGT-7901 miR-26a-transfectées. Dans les cellules-26a exprimant miR, ré-expression de FGF9 a sauvé l'invasion et la croissance des défauts de miR-26a (figure 4C, D, E). Enfin, nous avons testé si l'expression de miR-26a en corrélation avec les taux de protéine FGF9 en GC. Il y avait une corrélation inverse entre les taux de protéine FGF9, indiquée par une coloration immunohistochimique, et l'expression de miR-26a évaluée par hybridation in situ dans les tissus 126 du GC sur AGT tel qu'il est utilisé ci-dessus (figure 4F; Figure1C). Nos résultats démontrent que miR-26a a des propriétés compatibles avec la fonction de suppresseur de tumeur. La capacité à moduler les niveaux de FGF9 pourraient expliquer, au moins en partie, pourquoi miR-26a peut inhiber la croissance de GC et les métastases.

Discussion

miR-26a appartient à la miR-26 famille, contient un autre élément de miR-26b, les deux qui abritent une séquence identique à l'exception de 2 nucléotides différents dans miARN matures. miR-26a est un miARN fonctionnel qui a mérité enquête précédente [29]. Il est connu que miR-26a joue un rôle important dans la différenciation de croissance, du développement et de cellules des différents tissus [29]. Plusieurs études ont montré que l'expression de miR-26a est désordonné dans un certain nombre de tumeurs humaines [19], [22], [24], [30], [31]. Cependant, aucune de ces études est liée à un cancer gastrique. Dans l'étude actuelle, nous avons utilisé qRT-PCR et ISH pour montrer que les niveaux miR-26a dans les tissus de cancer gastrique ont été nettement inférieurs à ceux dans les tissus non tumoraux. En outre, les niveaux de miR-26a étaient associés au stade clinique et la présence de métastases de ganglions lymphatiques. Kaplan-Meier analyse de survie a révélé que les patients dont les tumeurs primaires affiché une faible expression de miR-26a avaient un système d'exploitation plus court et RFS en GC. En outre, l'analyse de Cox à risques proportionnels de régression a montré que réduite miR-26a dans les tumeurs était un prédicteur fort et indépendant du système d'exploitation plus court et RFS. Sur la base de données de tableau, il a été précédemment rapporté qu'une combinaison de plusieurs miARN peuvent être utiles comme marqueurs pronostiques dans le cancer gastrique [32], [33]. En outre, un seul miARN, comme miR-218 peut être un indicateur de pronostic [34]. Cependant, ces miARN ont été étudiés en seulement quelques patients atteints de cancer gastrique. Ici, miR-26a peut être utile en tant que marqueur pronostique pour prédire la survie et de rechute dans le cancer gastrique.

Cette étude a montré que l'expression ectopique de miR-26a dans les cellules GC altéré la migration, l'invasion, la prolifération et la croissance de la colonie ainsi que l'apoptose induite. De plus, des données in vivo ont démontré miR-26a a inhibé la croissance tumorale et les métastases. Ceux-ci in vitro et in vivo des données ont en outre indiqué que les fonctions miR-26a comme un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique. Plusieurs études appuient nos résultats. Par exemple, cette miARN est diminuée dans les tissus NPC et peut atténuer la croissance cellulaire et la tumorigenèse en ciblant EZH2 [22]. Le carcinome hépatocellulaire présente également une expression réduite de miR-26a [19]. L'administration systémique de ce miRNA dans un modèle murin de carcinome hépatocellulaire en utilisant un virus adéno-associé (AAV) se traduit par une inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses, l'induction de l'apoptose spécifique de la tumeur et une protection considérable de la progression de la maladie sans toxicité [35]. Cependant, diverses études récentes ont révélé le rôle oncogénique de miR-26a dans les tumeurs telles que le gliome et le cholangiocarcinome. Huse et al. a rapporté que miR-26a a été surexprimé dans gliome de haut grade et directement ciblé PTEN [23]. De même, miR-26a a été trouvé pour être surexprimé dans les tissus cholangiocarcinome humaines et de promouvoir la croissance de cholangiocarcinome en activant B-caténine [24]. Ces résultats controversés ont suggéré que le rôle de miR-26a était peut-être une tumeur spécifique et très dépendante de ses cibles dans des cellules cancéreuses différentes. Diverses études ont montré que PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 et cycline E1 [37] sont des gènes potentiels cibles en aval de miR-26a. Dans cette étude, FGF9, une nouvelle cible directe et fonctionnelle de miR-26a, a été identifié en GC. FGF9, également connu comme le facteur d'activation gliale, est l'un des 23 membres de la famille des FGF hautement conservée. En tant que sécrété, glycosylé protéine de 26 kDa, elle a des effets mitogéniques sur une variété de différents types de cellules [26]. FGF9 a été montré être impliqué dans différents cancers tels que l'ovaire adénocarcinome endométrioïde [26], le carcinome hépatocellulaire [27] et le cancer de la prostate [28]. Dans nos études, nous avons confirmé que FGF9 était une cible directe de miR-26a dans les cellules du GC. Pour déterminer si miR-26a supprime la croissance des GC et des métastases à travers la répression expression FGF9, nous avons constaté que FGF9 surexpression pourrait sauver l'invasion et la croissance des défauts de miR-26a. Ces résultats suggèrent que miR-26a inhibe la croissance des GC et des métastases en partie par le ciblage FGF9.

Pris ensemble, nous avons observé une régulation négative de miR-26a dans les cellules de cancer gastrique et a démontré que miR-26a peut agir comme un facteur prédictif indépendant de OS et RFS. Nous avons en outre constaté que miR-26a possède la puissance pour supprimer la croissance de GC et les métastases en régulant FGF9. Nos résultats suggèrent fonctions miR-26a comme un suppresseur de tumeur en GC et tient la promesse comme un biomarqueur pronostique et cible thérapeutique potentielle pour GC.

Matériel et méthodes

Culture
Cell

la lignée cellulaire épithéliale gastrique GES-1 a été acheté auprès de l'Institut de recherche sur le cancer (Beijing, Chine) Beijing. Les lignées de cellules GC MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, et BGC-823 ont été obtenus à partir de l'Académie chinoise des sciences médicales (Beijing, Chine). Ces cellules ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO _{2 dans RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) ou F12 ( AGS) additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine (Gibco BRL, NY, USA). Toutes les transfections utilisés Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, États-Unis)).}

Des échantillons cliniques

Tous les échantillons de tissus utilisés dans la présente étude ont été recueillies à partir de la tumeur hôpital provincial de Hunan (Changsha, Hunan, Chine). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université médicale de Guangzhou Autorité de santé. La collecte et l'utilisation de tissus ont suivi les procédures qui sont en conformité avec les normes éthiques telles qu'elles sont formulées dans la Déclaration d'Helsinki

Des échantillons de tissus de 40 patients atteints de cancer gastrique (23 hommes et 17 femmes;. Âge médian 59 ans; intervalle 40-84 ans) ont été utilisés pour quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR). tissus exérèse cancéreuses (tumorales) et appariés appariés tissus gastriques normales (normales) ont été immédiatement coupées, congelées dans l'azote liquide et conservés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ARN.

Les microarrays de tissu (AGT), composé de 126 CG et 41 tissus normaux adjacents à l'estomac, ont été utilisés pour une analyse par hybridation in situ. L'âge médian des patients atteints de cancer gastrique au moment du diagnostic était de 57 ans (extrêmes 31-82). La durée médiane de suivi de la survie globale (OS) et la survie sans récidive (RFS) était de 22 mois et 15 mois, respectivement. Toutes les données de 126 échantillons de GC, y compris l'âge, le sexe, le site de la tumeur, le grade histologique, la profondeur d'invasion (stade T), le stade clinique, et des métastases ganglionnaires ont été obtenues à partir des dossiers cliniques et pathologiques et résumés dans le tableau supplémentaire 2.

RT-PCR quantitative Analyse

ARN total a été extrait des cellules en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). La transcription inverse et les réactions qRT-PCR ont été effectuées en utilisant un kit qSYBR vert PCR (Qiagen, Germantown, États-Unis) et U6 snRNA a été utilisé comme un contrôle endogène. Pliez le changement a été déterminé comme 2 ^{-ddCt. Le Ct est le nombre de cycles fractionnaire à laquelle la fluorescence de chaque échantillon passe le seuil fixé. Le DDCT a été calculé en soustrayant le dCt de l'échantillon de référence (de tissu non-tumeur appariés pour les échantillons chirurgicaux et GES-1 cellule pour six lignées de cellules de cancer gastrique) du dCt de chaque échantillon. Les séquences des amorces spécifiques pour le miR-26a et U6 snRNA sont CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC 5'-3 'et 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', respectivement.}

in situ
immunohistochimie et hybridation

la détection de miR-26a par hybridation in situ en utilisant le au DIG marqué immobilisé un acide nucléique (LNA) à base de sonde spécifique de miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Danemark) a été réalisée selon les instructions du fabricant et U6 snARN a été utilisé comme témoin positif. Brièvement, les lames de microréseaux de tissus ont été déparaffinées, traitée avec de la proteinase K (5 min à 2 pg /protéase ml K), lavé dans du PBS et ensuite bloqué l'activité de peroxydase endogène avec 3% de H _{2O 2. L'hybridation a été effectuée à 52 ° C pendant une nuit après addition de 50 nM de sondes LNA marquée à la DIG, suivie d'un lavage à stringence dans des tampons SSC. Après blocage (sérum de 2% de mouton et de 2 mg /ml de BSA dans du PBS avec du Tween-20) à la température ambiante, le complexe sonde-cible a été visualisé en utilisant un anticorps anti-DIG-POD et un complexe DAB.}

immunohistochimie a été effectuée sur des coupes de microréseaux de tissus à l'aide d'anticorps anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, USA). Le complexe a été visualisé avec de la streptavidine /peroxydase et complexe DAB, et les noyaux de contraste avec l'hématoxyline. L'hybridation in situ et immunohistochimie résultats ont été marqués par l'intensité (0-4) et le pourcentage de coloration (0 à 100%). Expression relative a été obtenue par l'intensité en multipliant par pourcentage. Les lames ont été analysés par deux pathologistes indépendants.

vecteur recombinant

lentivirus recombinants contenant miR-26a précurseurs ou scramble séquences ont été achetés à SunBio (Shanghai, Chine). Pour l'analyse de la luciférase, la pleine longueur FGF9 3'-UTR a été amplifié à partir de l'ADN génomique de sang humain puis cloné dans la région en aval d'une cassette de luciférase de luciole dans le vecteur PMIR-REPORT luciférase (Ambion, Austin, TX, USA). Les constructions mutantes correspondantes, dans lequel les six premiers nucléotides complémentaires de la miR-26a semences région ont été mutés par mutagenèse dirigée (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Pour construire le vecteur de FGF9 exprimant, FGF9 ORF ADNc a été acheté chez GeneCopeia (Rockville, MD, USA) et sous-cloné dans le eucaryote pcDNA3.1 vecteur d'expression (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

miR-26a ou lentivirus scramble et PMIR-3'UTR vecteur ont été co-transfectés dans des cellules HEK-293T. Renilla et les activités luciférase de luciole ont été mesurés avec la Dual-Luciferase système rapporteur (Promega, Madison, WI) 24 h après la transfection. Luciole l'activité de luciférase a été normalisée pour l'expression de Renilla luciférase pour chaque échantillon. Chaque expérience a été réalisée en triple.

Western Blot

Western blot a été effectuée comme décrit précédemment [16]. En bref, les lysats de protéines ont été séparées par 10% de SDS-PAGE et transférés trophoretically elec-PVDF (difluorure de polyvinylidène) membrane. Ensuite, la membrane a été incubée avec un anticorps de souris contre l'anticorps anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, USA) suivie par HRP (peroxydase de raifort) marqué au chèvre antisouris IgG (Santa Cruz, CA, USA) et détecté par chimioluminescence. β-actine a été utilisée comme témoin de protéine de chargement.

Essai de prolifération des cellules

Des cellules ont été étalées sur des plaques à 12 puits aux concentrations cellulaires souhaitées. Les comptages de cellules ont été estimées par trypsinisation des cellules et effectuer une analyse en utilisant un compteur Coulter (Beckman Coulter, Fullerton, Etats-Unis) aux points de temps indiqués en triple.

Migration cellulaire et

La migration des cellules de Invasion Assays a été examinée en utilisant des essais de cicatrisation. Une «plaie» artificiel a été créé sur une monocouche de cellules confluentes, et des photographies ont été prises en utilisant un microscope inversé (Olympus, Tokyo, Japon) à 24 heures.

Pour le dosage de l'invasion des cellules, les cellules ont été ensemencées sur la membrane basale matrice présent dans l'insert d'une plaque de culture à 24 puits (matrice CE, Chemicon, Temecula, CA) et du sérum de foetus bovin a été ajouté à la chambre inférieure en tant que facteur chimiotactique. Après 48 heures supplémentaires, les cellules non-invasion et de la matrice CE ont été doucement enlevé avec un coton-tige. cellules envahissantes situées sur la face inférieure de la chambre ont été colorées avec du cristal violet, comptés et imagées.

Formation Colony Assay

Plaques Six puits ont été recouvertes d'une couche de 0,6% de gélose en milieu supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 20%. Les cellules (1 x 10 ^{4) ont été préparées dans 0,3% d'agar et ensemencées en triple. Une fois que les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant deux semaines, les colonies ont été comptées.}

Analyse de l'apoptose

Les cellules apoptotiques ont été évaluées par l'annexine V-FITC et l'iodure de propidium coloration (BD, USA ) et analysées avec un instrument FACS Calibur (BD, USA). Les données recueillies ont été analysées en utilisant FlowJosoftware.

Souris modèle de xénogreffe

Le modèle de cancer gastrique chez la souris nude a été construit comme décrit précédemment [25]. Afin d'évaluer le rôle de miR-26a dans la formation de tumeurs, les cellules CGT-7901 infectés par des virus ou miR-26a embrouillage ont été propagées et inoculées par voie sous- cutanée dans le flanc dorsal de souris nudes (5 dans chaque groupe). La taille des tumeurs a été mesurée tous les 5 jours. Au bout de 30 jours, les souris ont été tuées, des autopsies ont été réalisées et les tumeurs ont été pesées. Les volumes des tumeurs ont été déterminées selon la formule suivante: A x B ^{2/2, où A est le diamètre le plus grand et B est le diamètre perpendiculaire à A. Pour analyser l'effet de miR-26a sur les métastases tumorales, les cellules CGT-7901 infectées avec des virus ou miR-26a embrouillage ont été injectées dans la veine caudale de souris nude (6 dans chaque groupe). Après 45 jours, les nécropsies ont été effectuées. Nombre de micrométastases dans les poumons par HE-tachés section chez les souris individuelles ont été analysées par l'observation de la morphologie. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de recherche de l'Université médicale de Guangzhou. directives de protection des animaux et de laboratoire standard ont été suivies.}

Analyse statistique

Les comparaisons entre les groupes ont été analysés par le T-
tests et x ^{Test 2. Les courbes de survie globale et courbes sans rechute ont été tracées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier, avec le test du log-rank appliqué à titre de comparaison. La survie a été mesuré à partir du jour de l'intervention chirurgicale. Les variables avec une valeur de P
< 0,05 selon l'analyse univariée ont été utilisées dans l'analyse multivariée ultérieure basée sur le modèle de Cox des risques proportionnels. Les tests de corrélation de Spearman ont été utilisés pour évaluer la corrélation entre les paires d'expression miR-26a et FGF9 dans les tissus GC. Toutes les différences étaient statistiquement significatives au niveau de P
≤0.05. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel SPSS15.0.}

Informations complémentaires
Figure S1.
qRT-PCR a mesuré les niveaux d'expression de miR-26a dans SGC-7901 et les cellules AGS infectées par le miR-26a lentivirus ainsi que GES-1 des cellules transfectées avec des inhibiteurs de miR-26a
doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
Figure S2.
qRT-PCR a mesuré les niveaux d'expression de miR-26a de tissus tumoraux extraits de souris nude le 30e jour après l'injection des cellules cancéreuses. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± S.E.M.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Tableau S1. gènes
cibles qui ont été prédites par les trois algorithmes (Targetscan, Pictar et Miranda)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
Tableau S2.
Caractéristiques des patients atteints de cancer gastrique
doi: 10.1371. /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Remerciements

Nous remercions J Ma et CK Wang pour leur assistance technique.

• PLOS ONE: ERCC1 et ERCC2 Variantes prédire la survie dans l'estomac Cancer Patients
• PLOS ONE: Importance clinique du MYT1L gène polymorphismes chez les patients chinois atteints de cancer gastrique