Plos ONE: miR-26a Zavira rast tumorja in metastaz z usmerjanjem FGF9 v želodca Cancer

Povzetek

vlogi pokoj-26a v rakavih celicah zdelo sporno v prejšnjih študijah. Do zdaj je bila vloga pokoj-26a raka želodca ostaja neopredeljenih. V tej študiji smo ugotovili, da je bil miR-26a močno navzdol reguliranih raka želodca (PK) tkiv in celičnih linij in njegove stopnje izraženosti so bile povezane z bezgavkah metastazami in kliničnim odru, kot tudi celokupno preživetje in preživetje replase brez GC . tudi Ugotovili smo, da zunajmaternične izraz pokoj-26a zaviral GC celično proliferacijo in GC metastaze in vitro
in in vivo
. nadalje smo ugotovili nov mehanizem pokoj-26a za zatiranje rasti GC in metastaze. FGF9 je izkazalo, da je neposredni cilj pokoj-26a, s pomočjo luciferazno testa in Western blot. FGF9 overexpression v MIR-26a-izražanje celice lahko rešili invazijo in rasti pomanjkljivosti pokoj-26a. Poleg tega miR-26a izraz obratno povezana z ravnmi FGF9 beljakovin v GC. Skupaj, naši podatki kažejo, da miR-26A funkcije kot supresorski tumorja pri razvoju GC in napredovanje, in ima obljubo kot prognostični biomarkerja in potencialne terapevtske tarče za GC

Navedba. Deng M, Tang Hl, Lu XH, Liu My, Lu Xm, Gu YX et al. (2013) miR-26a Zavira rast tumorja in metastaz z usmerjanjem FGF9 želodčnega raka. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

Urednik: H. Sunny Sun, Inštitut za molekularno medicino, Tajvan

Prejeto: 29. marec, 2013; Sprejeto: 12 julij 2013; Objavljeno: 28. avgust 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz narave znanstvena fundacija Kitajske (81101526, 31100936) in Guangzhou Medical College zdravnik začel Foundation (2012C11). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

miRNAs so endogeno izražena, majhne nekodirano RNA, ki negativno uravnavajo izražanje genov, ki povzročajo razgradnjo ciljnih mRNA, zaviranje prevoda teh mRNA ali oboje [1]. miRNAs sodelujte v ključnih celičnih procesov, kot so stresni odziv, razvoj, diferenciacija, apoptoza in orožja [2]. Spremenjeni miRNA izraz so poročali v številnih raka, vključno raka dojke [3], [4], pljučni [5], jetra [6], želodca [7], kolona [8], možganske [9], levkemija [10] in limfom [11]. Vedno večje število študij, ki so pokazale, da lahko miRNAs delujejo kot onkogeni ali tumorskih razbijal, in so pogosto dysregulated v tumorjih [12], [13]. V zvezi s tem so onkogenih miRNAs pogosto molekul, medtem ko so s tumorjem zatiranje miRNAs navzdol reguliranih v tumorjih. Na primer, kaj-7 so poročali, da se underexpressed na pljučnega raka ter se osredotoči na onkogenega Ras [14], [15]. Smo že poročali, da je miR-216B močno navzdol reguliranih v nazofaringealnega karcinoma in zmanjša rast tumorja z usmerjanjem KRAS [16]. V nasprotju s tem pa so onkogeni miR-17-92 grozd miRNAs povečana pri različnih tumorja [17], in uveljavlja izraz teh miRNAs v dobro proučene Eμ-myc transgenih mišjem modelu limfomom B dramatično pospeši nastanek bolezni in napredovanje [18]. Vendar vloga miR-26a v rakavih celicah zdela sporna, saj je tumor supresorski v hepatocelularnega karcinoma [19], raka dojke [20] in nazofaringealnega karcinoma [21], [22], vendar je onkogen v gliomom [23 ] in holangiokarcinom [24]. Do sedaj je bila vloga miR-26 z rakom želodca neopredeljenih.

V tej študiji smo preučili miR-26a izraz v 40 seznanjene normalno in GC primerkov po kvantitativni RT-PCR analizo (QRT-PCR) . miR-26a bilo ugotovljeno, da je treba močno navzdol reguliranih v GC tkivih v primerjavi s tisto sosednjih normalnih želodčne tkiv. Ta rezultat je še dodatno potrjuje hibridizacija in situ na tkivnih mikromrež so sestavljeni iz 126 primerov GC tkiv in 41 primerov sosednjih normalnih tkivih. Poleg tega se je zmanjšala miR-26a je bila povezana s slabo prognozo in lahko neodvisno napovedujejo, celokupno preživetje (OS) in preživetje replase brez (RFS) v raka želodca. Funkcionalne študije so pokazale, da miR-26a zatreti rast GC celic in metastaz z usmerjanjem FGF9.

Rezultati

miR-26a je navzdol reguliranih v humani Rak želodca

Uporaba QRT-PCR Postopek, so bile ugotovljene vrednosti miR-26a v 40 parov želodca tkiv rakom in njihovih izravnanih sosednjih tkiv, kot tudi celičnih linij želodca. Med 40 bolniki z rakom želodca, približno 70% (28 od 40 bolnikov) tumorjev pokazala več kot dvakratno znižanje vrednosti miR-26a, z 5,76-kratno zmanjšanju glede sosednjih normalnih tkivih, kar kaže, da zmanjšanje miR -26a je bil pogost dogodek v človeški GC (Slika 1A). Poleg tega je miR-26a izraz zmanjša v vseh želodčnih raka celičnih linijah (podjetja MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, podjetja MKN-45, in BGC-823) v primerjavi z nemaligna želodca celične linije GES-1 (slika 1B). Da bi še dodatno preverijo rezultate v zvezi z biološko vlogo pokoj-26a v človeški želodčne rakotvornosti, smo zaposleni v situ hibridizacije oceniti miR-26a izraz v 126 GK in 41 ne-tumorskih tkivih na tkivnih mikromrež (TMAs). Rezultati so pokazali, da so bile izraz mnogo pokoj-26a znatno zmanjšal v GK v primerjavi z običajnimi tkiva (slika 1C). Dalje, smo ugotovili potencialne clinicopathological posledice spremenjeni miR-26a izražanja. Klinični vzorci so bili razdeljeni v nizki izražanja in visokih izražanja skupin na podlagi ocen miR-26a izraz večja ali manjša od mediane. Skladni s zgornjih podatkov, od 41 skupnih normalnih vzorcev v želodcu, 35 (85%) imela visoko ekspresijo miR-26a. Nasprotno pa 60% (76 126) želodčnih karcinoma osebkov imelo nizko negativnega ekspresije miR-26a. Od 126 posameznikov z GC, 38 so bili negativni na bezgavkah metastaze, in 45% teh bolnikov je imelo nizko negativnega izraza pokoj-26a (tabela 1). Osemdeset osem bolniki so bili pozitivni na bezgavkah metastaze, in 67% jih je pokazala downregulation ali izgubo pokoj-26a (tabela 1). Poleg tega smo ugotovili nizko izražanje pokoj-26a 37% in 77% želodčnih tumorjev razvrščene kot fazi I /II in faze III /IV, v tem zaporedju (tabela 1). Zato miR-26a izraz obratno korelira z bezgavkah metastaz in klinični fazi ( P
= 0,019 in P
< 0,001, v tem zaporedju). Vendar miR-26a ni bilo povezano s starostjo, spolom, diferenciacijo celic, ali globina invazije (fazi T). Ti rezultati kažejo, da lahko miR-26a ključno vlogo pri GC metastaz in napredovanje.

Zmanjšana miR-26a korelira z Poor Klinični prognozo

Da bi še dodatno analizira pomen pokoj-26a v smislu klinične prognozo, je bila analiza preživetja po Kaplan-Meier izvaja z uporabo pacientov celokupno preživetje in preživetje brez recidiva. Rezultati so pokazali, da so imeli bolniki z nizko miR-26a izražanja krajšo mediano OS in RFS kot bolniki z visoko miR-26a izražanja (21,6 meseca v primerjavi z 39,0 mesecev, P
< 0,001 za OS; 15,2 meseca v primerjavi z . 31,6 mesecev, P
= 0,002 za RFS; slika 1D). Uporabili smo Cox proporcionalni-nevarnosti poslabšanja nadalje oceni povezavo med miR-26a izražanja in prognozo. V univariantne analize bezgavk metastaz fazi TNM in ravni miR-26a so statistično pomembno povezane z OS in RFS (tabeli 2, 3). Končni multivariatne model, je pokazala, da je celotni čas preživetja močno odvisna od bezgavk metastaz fazi TNM in ravni miR-26a (tabela 2), in brez recidiva časa preživetja storila bezgavk metastaz in ravni miR-26a (tabela 3).

miR-26a Zavira GC rast in metastaz

Ob upoštevanju inverzno povezavo med ravnmi miR-26a in metastaz, smo raziskovali vpliv miR-26a ponovno izražanje o migraciji in invazijo sposobnosti GC celične linije. Dve GC celične linije (SGC-7901 in AGS), z relativno nizko bazalno izražanja pokoj-26a (slika 1B), so bili okuženi z obeh pokoj-26a ali nadzorni lentivirusom in izbrani s 5 mg /l puromicina za dva tedna. Dalje, pri celjenju ran test in transwell test smo opravili. Kot je bilo pričakovati, čezmernim pokoj-26a bistveno zatreti migracijo celic in invazijo sposobnosti (slika 2A, B, slika S1).

Za prikaz učinek pokoj-26a na rast GC smo izvedli GC testom proliferacije celic. Analizni Širjenje pokazala, da ektopična ekspresija miR-26a v SGC-7901 in AGS oslabljen proliferacijo celic v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 2C). Poleg tega, zunajmaternične miR-26a izraz zaviral kolonije nastanek sposobnosti v mehkem agarju (slika 2D). Nato smo izvedli analizo celične apoptoze in je pokazala, da miR-26a prekomerno v SGC-7901 inducirane celične apoptoze (slika 2E).

Nato smo preizkusili, ali bi miR-26a igrajo vlogo pri tumorigeneze z nude miške ksenotransplantskih modeli. Ugotovili smo, da je čezmerno miR-26a v SGC-7901 celic močno potlačene rast tumorja pri golih miših (slika 3A Slika S2). Nato smo SGC-7901 celice, okužene z eno miR-26a ali nadzor lentivirsus injicirali v repno veno golih miši preizkusiti pljuč metastaz. Kot je prikazano sliki 3B, je mogoče opaziti znatno manjše število makroskopskih pljučne metastaze v miR-26a prekomerno ekspresijo celic od kontrolnih celicah. Ti rezultati kažejo, da lahko miR-26a zatirajo rast GC in metastaze.

miR-26a Neposredno cilji in Zavira FGF9

Da bi razumeli, kako miR-26a zatira rast GC in metastaze, smo uporabili tri algoritme (Targetscan, Pictar in Miranda) za pomoč pri identifikaciji ciljev miR-26A v želodcu raka pri ljudeh. Od teh ciljnih genov, ki so bile predvidene v vseh treh algoritmov (tabela S1), FGF9 pritegnila našo pozornost takoj, kakor je bila vpletena v tumorigeneze ali metastaz [26] - [28]. kloniran smo FGF9 s polno dolžino 3'-UTR v luciferazno reporterskega vektor. Luciferaza testa so pokazali, da miR-26a, neposredno vezana na FGF9 3'-UTR, in s katero je izredno zmanjšala luciferazne aktivnosti (slika 4A). Vendar mutacije od domnevnih miR-26a mestih v 3'-UTR od FGF9 odpravljeno luciferazno dovzetnost za miR-26a (slika 4A). Neposredno oceniti učinek pokoj-26a na FGF9 izražanja, smo izvedli zahodni analizo blot. Kot je razvidno na sliki 4B, lentivirusni povzročil zunajmaternične miR-26a dramatično zatreti ravni FGF9 beljakovin v SCG-7901 in AGS celic. Poleg tega rasklapanje miR-26a, skozi transfekciji anti-pokoj-26a, v GES-1 celice povišane ravni FGF9 beljakovin (slika 4B; Slika S1). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da je FGF9 neposreden cilj navzdol za pokoj-26a v GC celicah. Zgornji rezultati nas je spodbudilo, da preveri, ali miR-26a zatira rast GC in metastaze skozi zatiranje FGF9 izraz. Za ta namen, FGF9 bila ponovno izražena v miR-26a-transfekciji SGC-7901 celic. V MIR-26a-izražanje celice, ponovno izraz FGF9 rešil napake invazije in rasti pokoj-26a (Slika 4c, D, E). Na koncu smo testirali, če miR-26a izraz povezana s stopnjami FGF9 beljakovin v GC. Obstaja inverzna korelacija med stopnjami FGF9 beljakovin, ki jih imunohistokemični barvanjem navedeno, in miR-26a izraz jih ocenili v situ hibridizacija v 126 GC tkivih na TMAs, kot se uporablja zgoraj (Slika 4F; Figure1C). Naše ugotovitve kažejo, da je miR-26a lastnosti skladne s funkcijo zaviralnih. Sposobnost za moduliranje ravni FGF9 lahko razloži, vsaj delno, zakaj miR-26a inhibira rast GC in metastaz.

Diskusija

miR-26a pripada miR-26 družine, ki vsebuje še član MIR-26b, ki sta hišo enako zaporedje, z izjemo 2 različnih nukleotidov v zrelih miRNAs. miR-26a je funkcionalna miRNA, da zasluži prejšnjo preiskavo [29]. Znano je, da ima miR-26a pomembno vlogo pri rasti, razvoju in celično diferenciacijo različnih tkiv [29]. Številne študije so pokazale, da je miR-26a izraz neurejeno v številnih človeških tumorjev [19], [22], [24], [30], [31]. Vendar nobeden od teh študij povezana z rakom želodca. V sedanji raziskavi smo uporabili QRT-PCR in ISH kažejo, da so bile koncentracije miR-26a v želodcu tkivih rakom bistveno nižje kot pri zunaj tumorskih tkiv. Poleg tega so bili nivoji miR-26a povezan s kliničnim fazi in prisotnost bezgavkah. Kaplan-Meier analiza preživetja je pokazala, da so imeli bolniki, pri katerih je prvi tumorji prikaže nizko izražanje pokoj-26a krajši OS in RFS v GC. Poleg tega Cox sorazmernih nevarnosti, regresijska analiza je pokazala, da je bila zmanjšana miR-26a v tumorjih močna in neodvisna napovednik krajše OS in RFS. Na podlagi podatkov, polj, je bilo že poročali, da je lahko kombinacija več miRNAs koristno kot prognostičnih označevalcev pri bolnikih z rakom želodca [32], [33]. Poleg tega pa z enim miRNK, kot miR-218, je lahko napovedni kazalnik [34]. Vendar pa so bile te miRNAs raziskovali v le nekaj bolnikov z rakom želodca. Tukaj lahko miR-26a uporaben kot prognostični označevalec napovedati preživetje in ponovitev raka želodca.

Ta študija je pokazala, da je zunajmaternična izraz pokoj-26a v GC celic oslabljeno migracijo, invazijo, proliferacijo in rast mikroorganizmov kot tudi inducirane apoptoze. Poleg tega, in vivo podatki pokazali miR-26a inhibira rast tumorjev in metastaz. Te in vitro in in vivo podatkov nadalje navedla, da miR-26A funkcije kot supresorski tumorjev pri raku želodca. Številne študije podpirajo naše rezultate. Na primer, je ta miRNA zmanjšal NPC tkivih in lahko zmanjšajo rast celic in tumorigeneze z usmerjanjem EZH2 [22]. Hepatocelularni karcinom kaže tudi zmanjšano izražanje pokoj-26a [19]. Sistemsko dajanje te miRNA v mišjem modelu HCC z uporabo Adenoasociiran virusni (AAV) rezultate inhibicije rakavih celic proliferacije, indukcijo tumorsko specifičnih apoptozo in dramatičen zaščito pred napredovanjem bolezni brez toksičnosti [35]. Vendar pa različne nedavne raziskave pokazale onkogenega vlogo miR-26a pri tumorjih kot glioma in holangiokarcinom. Huse et al. poročali, da je bil miR-26a izraženi pri gliomom visoke stopnje in se neposredno usmerjena [23] PTEN. Prav tako je bilo ugotovljeno, miR-26a se prekomerno v človeških holangiokarcinom tkiv in za pospeševanje rasti holangiokarcinom z aktivacijo B-catenin [24]. Ti spornih rezultati kažejo, da je bila vloga pokoj-26a morda tumor specifična in zelo odvisni od svojih ciljev v različnih rakavih celic. Različne študije so pokazale, da so PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 in ciklin E1 [37] morebitni nadaljnji ciljni geni pokoj-26a. V tej študiji, FGF9 nov neposredno in funkcionalno cilj miR-26a, je bila ugotovljena v GC. FGF9, znan tudi kot glialnih aktivacijskim faktor, je eden od 23 članov visoko ohranjenega družine FGF. Kot izločajo, glikoziliran 26-kDa protein, ima mitogene učinke na več različnih tipov celic [26]. FGF9 Dokazano je, da se vpleten v različnih rakavih obolenj, kot so jajčnikov endometrioid adenokarcinom [26], hepatocelularni karcinom [27] in karcinom prostate [28]. V naših raziskavah smo potrdili, da je FGF9 neposredna tarča miR-26a v GC celicah. Da bi ugotovili, ali miR-26a zatira rast GC in metastaze skozi zatiranje FGF9 izraz, smo ugotovili, da bi lahko FGF9 prekomerno reševanje invazijo in rasti pomanjkljivosti pokoj-26a. Ti rezultati kažejo, da miR-26a zavira rast GC in metastaze delno z usmerjanjem FGF9.

Če povzamemo, smo opazili downregulation Mir-26a v želodčnih rakave celice in dokazali, da lahko miR-26a deluje kot neodvisni napovedovalec OS in RFS. nadalje smo ugotovili, da ima miR-26a potenco za zaviranje rasti GC in metastaze z ureditvijo FGF9. Naše ugotovitve kažejo, miR-26A funkcije kot supresorski tumorja v PK in ima obljubo kot prognostični biomarkerja in potencialne terapevtske tarče za GC.

Materiali in metode

Cell Culture

želodca epitelnih celic linija GES-1 je bila kupljena z inštituta Pekingu za raziskave raka (Peking, Kitajska). GC celične linije MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, in BGC-823 so bili pridobljeni s kitajske akademije medicinske vede (Peking, Kitajska). Te celice so se ohranili pri 37 ° C v atmosferi s 5% CO _{2 v RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) ali F12 ( AGS) medij dopolnjen z 10% fetalnim govejim serumom, penicilin in streptomicin (Gibco BRL, NY, ZDA). Vse Transfekcije uporabljajo Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, ZDA)).}

Klinični vzorci

Vse vzorce tkiva, ki se uporabljajo v tej raziskavi so bili zbrani iz Hunan Provincial tumor Hospital (Changsha, Hunan je, Kitajska). Pisna privolitev je bila pridobljena iz vseh udeležencev raziskave. Ta študija je odobril Odbor za etiko Guangzhou Medical University Health organa. Zbiranje in uporaba tkiv upoštevali postopke, ki so v skladu z etičnimi standardi, oblikovanih v Helsinške deklaracije

tkivne vzorce iz 40 bolnikov želodca z rakom (23 moških in 17 žensk;. Mediana starost 59 let, razpon 40-84 let) so bile uporabljene za kvantitativno PCR v realnem času analize (QRT-PCR). Odstranjenimi rakave tkiva (tumorja) in v parih ujema normalne želodca tkiva (Normalno) so bili takoj zmanjšati, zamrznili v tekočem dušiku, in se hranijo pri -80 ° C do ekstrakcijo RNA.

mikromrež tkiva (TMAs), ki ga sestavljajo 126 GK in 41 sosednjih normalno želodec tkiva, so bili uporabljeni v analizi situ hibridizacije. Mediana starosti bolnikov z rakom želodca ob postavitvi diagnoze je bila 57 let (razpon 31-82). Mediana spremljanja čas za celokupno preživetje (OS) in brez recidiva preživetja (RFS) je bil 22 mesecev in 15 mesecev, v tem zaporedju. Vsi podatki o 126 GC vzorcev, vključno starost, spol, tumorja mestu, histološke zgradbe, globina invazije (fazi T), klinični fazi, in na bezgavkah metastaze so bili pridobljeni iz kliničnih in patoloških evidence in povzeti v dodatni tabeli 2.

Kvantitativne RT-PCR analiza

Total RNA je bila vzeta iz celic, ki uporabljajo TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, ZDA). Reverzno prepisovanje in QRT-PCR reakcije smo izvedli z uporabo qSYBR-zeleno PCR kit (Qiagen, Germantown, ZDA) in U6 snRNA bil uporabljen kot endogeni kontrolo. Krat sprememba je bila določena kot 2 ^{-ddCt. CT je število delnim cikel, pri katerem fluorescenčni vsakega vzorca prehaja fiksni prag. DdCt je bila izračunana tako, da se DCT referenčnega vzorca (paru ni tumorsko tkivo za kirurške vzorcev in GES-1 celica za šest želodca linije rakava celica) od DCT vsakega vzorca. Sekvence posebne primerji za miR-26a in U6 snRNA bili 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'in 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' oz.}

situ
hibridizacije in imunohistokemijo

Odkrivanje pokoj-26a, ki situ hibridizacija ki uporablja DIG-označenih zaklenjena nukleinske kisline (LNA), ki temelji sonda specifični za pokoj-26a (Exiqon, Vedbaek, Danska) je bila izvedena v skladu z navodili proizvajalca in U6 snRNA uporabimo kot pozitivno kontrolo. Brie fl y, tkiva mikromrež tobogani so deparaffinized, zdravljenih z proteinaze K (5 min pri 2 g /ml proteaze K), oprali v PBS in nato blokiral endogene peroksidaze dejavnost s 3% H _{2O 2. Hibridizacijo smo izvedli pri 52 ° C preko noči po dodatku 50 nM DIG-označenih LNA sond, čemur sledi strogosti pranje pri SSC blažilcev. Po blokiranje (2% ovce serum in 2 mg /ml BSA v PBS s Tween-20) pri sobni temperaturi, je bila sonda ciljno kompleks vizualizirali z uporabo protitelo anti-DIG-POD in DAB kompleks.}

imunohistokemija je bila izvedena na tkivo mikromrež odsekih, ki uporabljajo anti-FGF9 protitelesa (Santa Cruz, CA, ZDA). Kompleks smo vizualizirali s streptavidinom /peroksidazo in DAB kompleksa in jedra jih nasprotno s hematoksilinom. Situ bilo doseženih hibridizacija in imunohistokemijo rezultati intenzivnost (0-4) in odstotek obarvanjem (0 do 100%). Relativna izraz je bil pridobljen z množenjem intenzivnosti za odstotek. Diapozitivi so bili analizirani z dvema neodvisnima patologi.

rekombinantni vektor

rekombinantne lentiviruses vsebujejo miR-26A predhodnikov ali Scramble sekvence so bile kupljene od SunBio (Shanghai, Kitajska). Za luciferazno analizo, je celovečerni FGF9 3'-UTR ojačano iz človeške krvi genomske DNA in nato klonirali v regiji nižji stopnji za kresničkino luciferazno kaseto v pMIR-POROČILO luciferazno vektorja (Ambion, Austin, TX, ZDA). Ustrezne mutirane konstrukti, v kateri so v prvih šestih nukleotidov komplementarnih miR-26a semena območja mutiran s položajno usmerjeno mutagenezo (Stratagene, La Jolla, CA, ZDA). Zgraditi-FGF9 izražanje vektor je FGF9 ORF cDNA kupili od GeneCopeia (Rockville, MD, ZDA) in subklonirali v evkariotski ekspresijski vektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

luciferaza Reporter Vsebnost

miR-26a ali Utrka lentiviruses in pMIR-3'UTR vektor so co-transfektirali v HEK-293T celic. Renilla in firefly luciferazne aktivnosti so bile izmerjene z Dual-luciferaza Reporter sistema (Promega, Madison, WI), 24 ur po transfekciji. Firefly je luciferazno aktivnost preračuna Renilla luciferaze izražanja za vsak vzorec. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.

Western Blot

Western blot smo izvedli kot je bilo prej [16] opisano. Na kratko, beljakovinski lizati ločeni z 10% SDS-PAGE in elek-trophoretically prenese na PVDF (poliviniliden difluorid) membrane. Nato smo membrano inkubirali s mišjih protiteles proti anti-FGF9 protitelesa (Santa Cruz, CA, ZDA), ki mu sledi HO (hrenovo peroksidazo) označenega kozjega protimišja IgG (Santa Cruz, CA, ZDA) in zazna kemiluminescence. β-aktin uporabimo kot kontrolo protein nalaganja.

Cell Proliferation Vsebnost

Celice smo nanesli na 12 vdolbinami pri želenih koncentracijah celic. Celic smo ocenili s trypsinizing celice in izvajanje analiz z uporabo Coulterjevega Counter (Beckman Coulter, Fullerton, ZDA) v navedenih časovnih točkah v treh izvodih.

Cell migracije in invazije Testi

migracija celic je preučila uporabo celjenje rane testov. Umetno "rana" je bila ustanovljena na zraščene celic enoplastni a in fotografije so bile posnete z uporabo obrnjeno mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska) v 24 urah.

Za celično invazijo testu smo celice zasejali v bazalne membrane matrica prisoten v vložku kulture plošči 24 vdolbinami (ES matrica, Chemicon, Temecula, CA) in fetalni goveji serum dodamo k spodnji komori kot chemoattractant. Po nadaljnjih 48 urah smo brez vdrla celice in ES matriko previdno odstranimo z vato. Invazivne celice, ki se nahajajo na spodnji strani komore smo obarvali s kristal vijoličnim, prešteti in posneli.

Colony Ustanovitveni Vsebnost

Six-jamicami so bili prekriti s plastjo 0,6% agarja na gojišču dopolnjen z 20% fetalnega govejega seruma. Celice (1 x 10 ^{4) pripravimo iz 0,3% agarja in zasejali v treh izvodih. Po smo plošče inkubirali pri 37 ° C za dva tedna, preštejemo kolonije.}

apoptoza Analiza

apoptotske celice smo ovrednotili z aneksinom V-FITC in propidijevim jod barvanja (BD, ZDA ) in analizirali z FACS Calibur instrumenta (BD, ZDA). Zbrani podatki so bili analizirani s pomočjo FlowJosoftware.

Mouse ksenotransplantskih Model

želodca Model raka pri golih miših je bila zgrajena kot je opisano prej [25]. Da bi ocenili vlogo pokoj-26a v nastanka tumorjev, so SGC-7901 celice, okužene z miR-26a ali Scramble virusi razmnožujejo in podkožno vcepimo v hrbtnih boki golih miškah (5 v vsaki skupini). Velikost tumorja smo merili vsakih 5 dni. Po 30 dneh smo ubili miši, smo izvedli obdukcijo mrtve in jih stehtali tumorji. Obseg tumorja smo določili po naslednji formuli: A x B ^{2/2, kjer je A največji premer in B je premer pravokotna A. testom učinek MIR-26a je na tumorske metastaze, okuženih SGC-7901 celice z smo miR-26a ali Utrka virusi injicirali v repno veno golih miši (6 v vsaki skupini). Po 45 dneh smo opravili obdukcijo mrtve. Število micrometastases v pljučih na HE-obarvajo oddelek v posameznih miši smo analizirali z opazovanjem morfologije. Eksperimentalne protokoli so bili odobreni Odbor za živali raziskovalnega varstvo Guangzhou Medical University. Sledila standardne smernice za varstvo živali in laboratorijske.}

Statistična analiza

Primerjave med skupinami smo analizirali z t-
test in x ^{2 testa. Splošni krivulje preživetja in krivulje brez recidiva so narisane po metodi Kaplan-Meier, s testom log-ranga, ki se uporablja za primerjavo. Preživetje je merjena od dneva operacijo. Spremenljivke, katerih vrednost je P
< 0,05 glede na univariatno analizo so bili uporabljeni pri kasnejšem multivariatne analize, ki temelji na Cox sorazmernih tveganj modela. korelacijske preskuse Spearman je bila uporabljena za oceno parne izraz korelacijo med pokoj-26a in FGF9 v GC tkivih. Vse razlike so bile statistično značilne na ravni P
≤0.05. Statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS15.0 programske opreme.}

Podpora Informacije
Slika S1.
QRT-PCR so merili raven izražanja miR-26a SGC-7901 in AGS celice okužene z miR-26a lentivirusom kot tudi celice ges-1 transfekciji z zaviralci miR-26a
doi:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001
(IOD)
Slika S2.
QRT-PCR so merili raven miR-26A izražanja tumorskih tkiv, pridobljenih iz golih miših 30. dan po injiciranju rakavih celic. Vsi podatki so prikazani kot povprečje ± s.e.m
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002
(IOD)
Tabela S1.
Ciljne geni, ki so napovedovali vsi trije algoritmi (Targetscan, Pictar in Miranda)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
tabeli S2.
Značilnosti bolnikov z rakom želodca
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Priznanja

Zahvaljujemo J Ma in CK Wang za njihovo tehnično pomoč.

• Plos ONE: ERCC1 in ERCC2 Variante Napovedati preživetje želodčnega raka bolnikov
• Plos ONE: Klinični Pomen MYT1L genski polimorfizmi v kitajskih bolnikov z želodčnim rakom