PLoS ONE: Pasaulis-26a Stabdo navikų augimą ir metastazes nukreipiant FGF9 skrandžio vėžio

Anotacija

miR-26a vėžiu ląstelių vaidmuo atrodė prieštaringai ankstesniuose tyrimuose. Iki šiol miR-26a vaidmuo skrandžio vėžiu išlieka neapibrėžta. Šiame tyrime mes nustatėme, kad Pasaulis-26a buvo stipriai downregulated skrandžio vėžiu (GC) audinių ir ląstelių linijų, o jo išraiška koncentracija buvo susijusi su limfmazgių metastazių ir klinikinės stadijos, taip pat bendro išgyvenamumo ir išlikimo GC replase be , Mes taip pat nustatė, kad negimdinis išraiška miR-26a slopinamas GC ląstelių proliferaciją ir GC metastazių in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Mes taip pat nustatė, kad romanas mechanizmą PPN-26a slopinti GC augimą ir metastazes. FGF9 buvo įrodyta, kad būti tiesioginis taikinys miR-26a, naudojant liuciferazės tyrimą ir Vakarų dėmė. FGF9 ekspresija MIR-26A-išreikšti ląstelių gali išgelbėti invazija ir augimo defektai PPN-26a. Be to, PPN-26a išraiška atvirkščiai koreliuoja su FGF9 baltymų kiekiai GC. Kartu paėmus, mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-26A funkcijas kaip auglio slopinamojo GC plėtros ir progresavimo, ir turi pažadą kaip prognostinis biologinis žymuo ir galimą terapinį tikslą GC

nurodomoji dalis:. Dan, M, Tango HL Lu xh Liu Mano Lu Xm, Gu Yx et al. (2013) Pasaulis-26a Stabdo navikų augimą ir metastazes nukreipiant FGF9 skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (8): e72662. Doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

redaktorius H. Giedra Saulė instituto Molekulinės medicinos Taivanas

Įstojo: Kovo 29, 2013 m Priimta 12 Liepos 2013 m Paskelbta rugpjūčio 28, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Dan et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš gamtos Mokslo fondo Kinijos (81.101.526, 31.100.936) ir Guangzhou medicinos koledžo daktaras Pradėti fondo (2012C11). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

miRNAs yra organizme išreiškiamas, maži nekoduojamame RNR, kad neigiamai reguliuoti genų ekspresiją sukelia skilimą tikslinių mRNR, slopina šių mRNR vertimo arba abu [1]. miRNAs imtis svarbiausiose korinio procesų dalis, kaip antai stresas, plėtros, diferenciacija, apoptozės ir proliferacija [2]. Pakeista mirna išraiška buvo pastebėta daugelio piktybinių navikų, įskaitant krūties [3], [4], plaučių [5], kepenų [6], skrandžio [7], gaubtinės žarnos [8], [9] smegenų, leukemija [10], ir limfoma [11]. Daugėja tyrimų įrodė, kad miRNAs gali veikti kaip onkogenų ar naviko slopintuvai, ir jie dažnai dysregulated navikuose [12], [13]. Atsižvelgiant į tai, onkogeninėmis miRNAs dažnai aktyvinama, o naviko sulaiko miRNAs yra downregulated navikuose. Pavyzdžiui, leiskite-7 buvo pranešta, kad underexpressed plaučių vėžio ir nukreipti onkogeninio Ras [14], [15]. Mes anksčiau pranešė, kad Pasaulis-216B yra stipriai downregulated į nosiaryklės karcinomą ir sumažina naviko augimą nukreipiant KRAS [16]. Priešingai, onkogeninė Pasaulis-17-92 klasteris miRNAs yra aktyvinama įvairiausių naviko [17], ir vykdomi išraiška šių miRNAs į gerai ištirtas Eμ-myc transgeninių pelių modelis B ląstelių limfoma dramatiškai pagreitina ligos pasireiškimo laiką bei eigą [18]. Tačiau miR-26a vėžiu ląstelių vaidmuo atrodė prieštaringas, nes ji yra navikas slopintuvas į kepenų ląstelių karcinoma [19], krūties vėžio [20] ir nosiaryklės karcinomą [21], [22], bet yra gliomos onkogeną [23 ] ir cholangiokarcinomos [24]. Iki šiol miR-26 vaidmuo skrandžio vėžio buvo neapibrėžta.

Šiame tyrime mes išnagrinėjo Pasaulis-26a raiška 40 suporuotas normalus ir GC pavyzdžius kiekybiniais RT-PCR (KRL-PGR) analizė , Buvo nustatyta, miR-26a-būti tvirtai downregulated GC audinių, palyginti su gretimų įprastomis skrandžio audiniuose. Šis rezultatas buvo dar kartą patvirtino in situ hibridizacijos ant audinių mikrogardelių sudaro 126 atvejus GC audinių ir 41 atvejais gretimuose normaliuose audiniuose. Be to, sumažėjo Pasaulis-26a buvo susijęs su blogos prognozės ir gali savarankiškai prognozuoti bendrą išgyvenimą (OS) ir išlikimą replase be (RFS) skrandžio vėžys. Funkciniai tyrimai parodė, kad Pasaulis-26a slopino GC ląstelių augimą ir metastazes nukreipiant FGF9.

Rezultatai

Pasaulis-26a yra Downregulated žmogiškųjų skrandžio vėžys

Naudojant KRL PGR metodas, miR-26a lygiai buvo aptikta 40 porų skrandžio vėžio audinių ir jų suderintų gretimuose audiniuose, taip pat skrandžio ląstelių linijų. Tarp 40 pacientų, kurių skrandžio vėžio, maždaug 70% (28 iš 40 pacientų) auglių atskleidė daugiau nei du kartus sumažinant miR-26A lygių, su 5,76-kartus sumažinti, palyginti su gretimų normaliuose audiniuose, tai rodo, kad miR sumažinti -26a buvo dažnas įvykis žmogaus GC (1a pav.) Be to, PPN-26a išraiška buvo sumažintas visose skrandžio vėžio ląstelių linijų (MKN-28, SGC-7901, AGS, MSV-803, MKN-45 ir bgc-823), palyginti su nonmalignant skrandžio ląstelių linijos GES-1 (pav 1B). Norėdami dar kartą patikrinti rezultatus, susijusius su biologinės vaidmenį PPN-26a į žmogiškąjį skrandžio kancerogenezėje, mes įdarbinti in situ hibridizacijos įvertinti Pasaulis-26a išraišką 126 GCS ir 41 ne navikų audiniuose, dėl audinių mikrogardelių (TMA). Tyrimo rezultatai atskleidė, kad sąvoka balų PPN-26a buvo žymiai sumažėjo GCS palyginti su sveikų audinių (1c pav.) Be to, mes nustatyti galimus klinikos pasekmes pakeisti Pasaulis-26a išraiška. Klinikiniai mėginiai buvo suskirstyti į mažas raiškos ir aukštos raiškos grupes remiantis Pasaulis-26a išraiška balais didesnis arba mažesnis už medianą. Sutampa su pirmiau pateiktais duomenimis, iš 41 viso normaliomis skrandžio mėginius, 35 (85%) turėjo aukštą raišką PPN-26a. Priešingai, 60% (76 iš 126) skrandžio karcinoma egzempliorių turėjo mažai neigiamos išraiškos PPN-26a. Iš 126 asmenų su GC, 38 buvo neigiami limfmazgių metastazių, o 45% šių pacientų buvo mažai neigiamos išraiškos PPN-26a (1 lentelė). Aštuoniasdešimt aštuoni pacientai buvo teigiami limfmazgių metastazių, o 67% iš jų parodė downregulation arba nuostolį PPN-26a (1 lentelė). Be to, mes nustatėme, žemos raiškos PPN-26a 37% ir 77% skrandžio auglių, priskiriamų I etapas /II ir III etapas /IV, atitinkamai (1 lentelė). Todėl, PPN-26a išraiška atvirkščiai koreliuoja su limfmazgių metastazių ir klinikinės stadijos ( P
= 0,019 ir P
< 0,001, atitinkamai). Tačiau, PPN-26a nebuvo koreliuoja su amžiumi, lytimi, ląstelių diferenciacijos, ar invazijos gylio (T stadijos). Šie rezultatai rodo, kad Mir-26a gali vaidinti lemiamą vaidmenį GC metastazių ir progresavimą.

Sumažėjo Pasaulis-26a koreliuoja su prasta Klinikinė prognozavimo

toliau analizuoti PPN-26a reikšmę požiūriu klinikinio prognozės, Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė buvo atliekama naudojant pacientų bendras išgyvenamumas ir išgyvenamumas atkryčio nemokamai. Rezultatai parodė, kad pacientams, sergantiems mažo Pasaulis-26a išraiška turėjo trumpesnę BI mediana ir RFS nei padarė pacientus, sergančius didelio Pasaulis-26a išraiška (21,6 mėnesio, palyginti su 39.0 mėnesių, P
< 0,001 OS; 15,2 mėnesių vs . 31,6 mėnesių P
= 0,002 už RFS; 1D pav.) Mes naudojome Cox proporcinio pavojų regresijos išsamiau įvertinti tarp Pasaulis-26a saviraiškos ir prognozės asociacija. Be požymį analizė, limfmazgių metastazių, TNM etape, bei Pasaulis-26A lygiais buvo reikšmingai susijęs su OS ir RFS (2 lentelė, 3). Galutinis daugiamatis modelis atskleidė, kad bendras išgyvenamumas laikas žymiai priklausė nuo limfmazgių metastazių, TNM etape, bei Pasaulis-26A lygių (2 lentelė) ir atkryčio be išlikimo laiką darė limfmazgių metastazių ir Pasaulis-26A lygiais (3 lentelė).

Pasaulis-26a Stabdo GC augimas ir metastazės

pažymėdamos atvirkštinę koreliaciją tarp Pasaulis-26A lygius ir metastazių, mes tyrė Pasaulis-26a naujo raiškos poveikį migracijos ir invazija gebėjimų GC ląstelių linijos. Du GC ląstelių linijas (SGC-7901 ir AGS) su santykinai mažu baziniu išraiškos PPN-26a (1b paveikslas) buvo užsikrėtę arba miR-26a arba valdymo lentiviruso ir atrinkti 5 mg /l puromicino dvi savaites. Be to, žaizdų gijimo tyrimas ir transwell tyrimas buvo atliktas. Kaip ir tikėtasi, raiška miR-26a reikšmingai slopino ląstelių migraciją ir invazija gebėjimus (2a pav, B; S1 pav.)

Jei įrodyti PPN-26a poveikį GC augimo, mes atliekame GC ląstelių proliferaciją tyrimą. Platinimas tyrimas parodė, kad negimdinis išraiška miR-26a ir SGC-7901 ir AGS susilpnintas ląstelių proliferaciją, lyginant su kontrolinės ląstelių (2c pav.) Be to, negimdinis Pasaulis-26a išraiška slopinamas kolonijų formavimo gebėjimus minkštu agaro (2d pav.) Tada atliekamas ląstelių apoptozę analizę ir paaiškėjo, kad Pasaulis-26a ekspresija SGC-7901 sukelta ląstelių apoptozę (2E pav.)

Be to, mes patikrinome, ar Pasaulis-26a galėtų atlikti svarbų vaidmenį Tumorigenesis naudojant nuogas pelės ksenografiniuose modeliai. Mes nustatėme, kad PPN-26a raiška į SGC-7901 ląstelių reikšmingai slopino naviko augimas nuogas pelėmis (3a paveiksle; S2 pav). Tada užsikrėtę arba Pasaulis-26A arba kontrolės lentivirsus SGC-7901 ląstelės buvo švirkščiamas į uodegos veną nuogas pelių ištirti plaučių metastazių. Kaip parodyta 3B pav, gali būti pastebėta Pasaulis-26a ekspresija ląsteles nei kontrolinių ląstelių žymiai mažesnis skaičius makroskopinių metastazių plaučiuose. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-26a gali slopinti GC augimą ir metastazes.

Pasaulis-26a Tiesiogiai tikslai ir slopina FGF9

Norėdami suprasti, kaip Pasaulis-26a slopina GC augimą ir metastazes, mes panaudojome tris algoritmus (Targetscan, Pictar ir Miranda) padėti identifikuoti Pasaulis-26A tikslus žmogaus skrandžio vėžio. Iš šių tikslinių genų, kurie buvo prognozuojama visų trijų algoritmų (lentelė S1), FGF9 traukia mūsų dėmesį iš karto, nes jis buvo susijęs Tumorigenesis ar metastazių [26] - [28]. Mes klonuoti pilnametražis FGF9 3'-UTR į liuciferazės reporteris vektorių. Liuciferazė tyrimas atskleidė, kad Pasaulis-26a tiesiogiai jungiasi su FGF9 3'-UTR, ir ji stebėtinai sumažintas liuciferazės veiklą (4a paveikslas). Tačiau mutacija iš tariamų Pasaulis-26A svetainių 3'-UTR iš FGF9 panaikinta liuciferazės reaguoja PPN-26a (4a pav.) Tiesiogiai įvertinti PPN-26a poveikį FGF9 išraiška, mes atliekame Vakarų dėmė analizė. Kaip matyti 4B paveiksle, lentiviruso sukeltas negimdinis Pasaulis-26a dramatiškai slopino FGF9 baltymų kiekį SCG-7901 ir AGS ląsteles. Be to, nokdaunas miR-26a, per transfekciją anti-miR-26a, visų GES-1 ląstelės padidėjo FGF9 baltymų kiekis (4B paveiksle; S1 paveiksle). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad FGF9 yra tiesioginis pasroviui tikslas Mir-26a GC ląsteles. Pirmiau pateikti rezultatai paskatino mus išsiaiškinti, ar Pasaulis-26a slopina GC augimą ir metastazes per represuoti FGF9 išraiška. Šiam tikslui, FGF9 buvo iš naujo išreikštas ir miR-26a-transfekuotų SGC-7901 ląstelių. Be MIR-26A-išreikšti ląstelių, iš naujo išraiška FGF9 išgelbėjo invazija ir augimo defektai PPN-26a (4c paveikslas, D, E). Galiausiai, mes išbandyti, jeigu Pasaulis-26a išraiška koreliuoja su FGF9 baltymų kiekiai GC. Ten buvo atvirkštinė koreliacija tarp FGF9 baltymų koncentracijos, imunohistocheminiu dažymo nurodyta ir Pasaulis-26a išraiška vertinamas in situ hibridizacijos 126 GC audinių ant TMA naudojamas didesnis (4F, skaičių; Figure1C). Mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-26a turi savybes, atitinkančias auglio slopinamojo funkcija. Gebėjimas moduliuoti FGF9 lygiai gali paaiškinti, bent jau iš dalies, kodėl ir miR-26a gali slopinti GC augimą ir metastazes.

Aptarimas

miR-26a siejamas su miR-26 šeimos, kuri yra kitoje valstybėje MIR-26b, kurios abi įsikurs identišką seka su 2 skirtingų nukleotidų subrendusių miRNAs išimtis. Pasaulis-26a yra funkcinis Mirna, kuri nusipelnė ankstesnę tyrimą [29]. Ji yra žinoma, kad miR-26a vaidina svarbų vaidmenį augimo, vystymosi ir ląstelių diferenciacijos skirtingų audinių [29]. Keli tyrimai parodė, kad miR-26a išraiška yra netvarkiose į žmogaus navikų skaičius [19], [22], [24], [30], [31]. Tačiau, nė vienas iš šių tyrimų yra susijęs su skrandžio vėžio. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, mes panaudojome KRL-PGR ir ish parodyti, kad Pasaulis-26a lygiai skrandžio vėžio audiniuose buvo gerokai mažesni, nei ne navikų audiniuose. Be to, miR-26a lygiai buvo susijęs su klinikiniu etape, ir jo buvimas metastazių limfmazgiuose. Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė parodė, kad pacientams, kurių pirminis navikas rodomas mažas išraišką PPN-26a turėjo trumpesnį OS ir RFS GC. Be to, Cox proporcinio pavojai regresinė analizė parodė, kad sumažintos Pasaulis-26a navikuose buvo stipri ir nepriklausoma prognozuoti trumpesnį OS ir RFS. Remiantis matricų duomenimis, buvo anksčiau pranešė, kad iš kelių miRNAs derinys gali būti naudinga, nes prognostinių žymenų skrandžio vėžio [32], [33]. Be to, vienas-mirna, pavyzdžiui, miR-218, gali būti prognostinę rodiklį [34]. Tačiau šie miRNAs buvo tirtos tik keletą skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Čia, PPN-26a, gali būti naudinga kaip prognostinis persekiotoją prognozuoti išlikimą ir atkryčio skrandžio vėžio.

Šis tyrimas parodė, kad negimdinis išraiška miR-26a GC ląstelių sumažėja migracija, invazija, platinimu ir kolonijų augimą, taip pat sukeltos apoptozės. Be to, in vivo duomenys parodė, miR-26a slopinamas naviko augimą ir metastazes. Tai in vitro ir in vivo duomenų taip pat nurodė, kad miR-26A funkcijas kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio. Keli tyrimai paremti mūsų rezultatus. Pavyzdžiui, tai mirna yra sumažėjo NPC audinių ir gali sumažinti ląstelių augimą ir tumorigenezei nukreipiant EZH2 [22]. Kepenų ląstelių karcinoma, taip pat eksponuoja sumažinto išraišką PPN-26a [19]. Sisteminė administracija šio Mirna A pelės modelio HCC, naudojant adeno susijęs virusas (AAV) rezultatų slopinimu vėžio ląstelių proliferaciją, indukcijos naviko konkrečių apoptozės ir dramos apsaugos nuo ligos progresavimo be toksinio poveikio [35]. Tačiau įvairūs naujausi tyrimai atskleidė onkogeninio vaidmenį PPN-26a navikuose, pavyzdžiui, gliomos ir cholangiokarcinoma. HUSE ir kt. Pranešama, kad Pasaulis-26a buvo ekspresija aukštos kokybės glioma ir tiesiogiai nukreipta [23] PTEN. Panašiai, buvo nustatyta, miR-26a-būti aktyvuojami žmogaus cholangiokarcinomos audiniuose, kuriuose yra skatinti cholangiokarcinomos augimą, aktyvuojant B-kateninai [24]. Šie prieštaringų rezultatai rodo, kad miR-26a vaidmuo buvo galbūt specifinį naviką, ir labai priklauso nuo jos tikslų įvairiose vėžio ląsteles. Įvairūs tyrimai parodė, kad PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 ir cikloniniai E1 [37] yra potencialūs pasroviui tikslinės genai PPN-26a. Šiame tyrime FGF9, nauja tiesioginio ir funkcionalus tikslas miR-26a, buvo nustatytas GC. FGF9, taip pat žinomas kaip glijos aktyvuojančio faktoriaus, yra viena iš 23 narių labai konservatyvių FGF šeimos. Kaip sekretuojamas, glikozilinto 26-kDa baltymą, ji turi mitogeninę poveikį įvairių tipų ląstelių [26] įvairovė. FGF9 buvo įrodyta, kad būti susijęs įvairių vėžio, pavyzdžiui, kiaušidžių endometrioid adenokarcinoma [26], kepenų ląstelių karcinoma [27] ir prostatos karcinoma [28]. Mūsų tyrimų, mes patvirtino, kad FGF9 buvo tiesioginė tikslinė miR-26a GC ląsteles. Norėdami nustatyti, ar Pasaulis-26a slopina GC augimą ir metastazes per represuoti FGF9 išraišką, mes nustatėme, kad FGF9 raiška gali išgelbėti invazija ir augimo defektai PPN-26a. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-26a slopina GC augimą ir metastazes iš dalies nukreipiant FGF9.

Visi kartu mes nustatėme downregulation PPN-26a skrandžio vėžio ląsteles ir parodė, kad Pasaulis-26a gali veikti kaip nepriklausoma prognozuoti OS ir RFS. Mes taip pat nustatė, kad Pasaulis-26a turi potenciją slopinti GC augimą ir metastazes reguliuojant FGF9. Mūsų rezultatai rodo, Pasaulis-26A funkcijas kaip auglio slopinamojo GC ir turi pažadą kaip prognostinis biologinis žymuo ir galimą terapinį tikslą GC.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra

skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1 buvo įsigytas iš Pekino vėžio tyrimų instituto (Pekinas, Kinija). GC ląstelių linijos MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45 ir bgc-823 buvo gauti iš Kinijos mokslų akademijos medicinos mokslų (Pekinas, Kinija). Šios ląstelės buvo palaikoma 37 ° C 5% CO _{2 RPMI-1640 (MSV-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) arba F12 atmosferoje ( MAA) vidutinio papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, penicilino ir streptomicino (Gibco BRL, NY, JAV). Visi transfekcija naudojami Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Karlovi Varai, JAV)).}

klinikinius mėginius

Visi naudojami šiame tyrime audinio mėginiai buvo imami iš Hunan provincijos auglio ligoninė (Changsha, Hunan, Kinija). Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų tyrimo dalyvių. Šis tyrimas patvirtino Etikos komiteto Guangdžou medicinos universiteto Sveikatos tarnyba. Rinkimas ir naudojimas audinių po procedūros, kurios laikantis etinių standartų, suformuluotų Helsinkio deklaraciją

Audinių mėginiai iš 40 skrandžio vėžiu sergančių pacientų (23 vyrų ir 17 moterų;. Amžiaus mediana 59 metai; diapazonas 40-84 metų amžiaus) buvo naudojamas kiekybinis realaus laiko PGR (KRL-PGR) analizė. Rezekcijos vėžiniai audiniai (naviko) ir poriniai atitiko normalus skrandžio audiniai (Normal) buvo iš karto supjaustyti, užšaldyti skystame azote ir saugomi -80 ° C iki RNR gavyba.

audinio mikrogardelių (TMA), susidedantis iš 126 GCS ir 41 gretimų normalus skrandžio audiniai, buvo naudojami in situ hibridizacijos analizės. Vidutinis amžius skrandžio vėžiu sergančių pacientų diagnozės buvo 57 metai (svyravo nuo 31-82). Mediana tolesnių laikas bendro išgyvenamumo (OS) ir atkryčio-free survival (RFS) buvo 22 mėnesių ir 15 mėnesių, atitinkamai. Visi 126 GC mėginių, įskaitant amžių, lytį, auglio vietą, histologinio laipsnio, invazijos gylio (T stadija), klinikinės stadijos ir limfmazgių metastazių duomenys buvo gauti iš klinikinių ir patologinių įrašų ir apibendrinti papildomą lentelę 2.

Kiekybinė PGR analizė

viso RNR buvo išskirta iš ląstelių naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, JAV). Atvirkštinę transkripciją ir KRL-PGR reakcijos buvo atliktas naudojant qSYBR-žalią PGR rinkinys (Qiagen, GERMANTOWN, JAV) ir U6 snRNA buvo naudojamas kaip endogeninio kontrolės. Sulenkite pokytį lėmė kaip 2 ^{-ddCt. CT yra trupmeninė ciklas numeris, kuriame kiekvieno mėginio fluorescencija eina nei nustatyta riba. DdCt buvo apskaičiuojamas atimant ataskaitinio mėginio DCT (suporuotas ne naviko audinių chirurgijos pavyzdžius ir GES-1 ląstelių šešis skrandžio vėžio ląstelių linijų) iš kiekvieno mėginio DCT. Konkrečių gruntams Mir-26a ir U6 snRNA sekos buvo 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 "ir 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3", atitinkamai.}

situ pervežimas hibridizacijos ir imunohistocheminis

aptikimas miR-26a in situ hibridizacijos naudojant Dig žymėto užrakinta nukleino rūgšties (LNA) pagrįstų zondas specifinis mir-26a (Exiqon, Vedbaek, Danija) buvo atliekamas pagal gamintojo nurodymus ir U6 snRNA buvo naudojamas kaip teigiama kontrole. Brie FL y audinio mikrogardeliq skaidres buvo deparaffinized, gydomi proteinazės K (5 minutės 2 mikrogramai /ml proteazės K), išplauti PBS, o vėliau užblokuotas endogeninio peroksidazės aktyvumo su 3% H _{2O 2. Buvo atliekama hibridizacija 52 ° C temperatūroje per naktį po to, kai 50 nM dig-žymėtųjų LNA zondai, po kurio seka griežtumas plovimo SSC buferių to. Po blokavimo (2% avies serumo ir 2 mg /ml BSA PBS su Tween-20) kambario temperatūroje, zondas-taikinys kompleksas buvo vizualizuojami naudojant anti-dig-POD antikūną, ir DAB kompleksą.}

imunohistocheminis buvo atliktas audinio microarray skyriuose naudojant anti-FGF9 antikūnas (Santa Cruz, CA, JAV). Kompleksas buvo ryškinamos su streptavidino /peroksidazės ir DAB komplekso ir branduoliai counterstained hematoksilinu. In situ hibridizacijos ir imunohistocheminiu rezultatai buvo įmušė intensyvumo (0-4) ir dažymo (nuo 0 iki 100%) procentiniu dydžiu. Santykinis išraiška buvo gaunama padauginus intensyvumą procentais. Skaidrės buvo analizuojami dviejų nepriklausomų patologai.

Rekombinantinis Vektorius

Rekombinaciniai lentiviruses kurių sudėtyje Pasaulis-26A pirmtakų arba peštynės sekas buvo įsigytas iš SunBio (Šanchajus, Kinija). Dėl liuciferazės analize, pilnametražis FGF9 3'-UTR sustiprino iš žmogaus kraujo genomo DNR ir tada klonuoti į vartotojų regionui, Firefly liuciferazės kasetę į pMIR-ATASKAITA liuciferazės vektoriaus (Ambion, Austin, TX, USA). Atitinkami mutantas konstruoja, į kurio pirmieji šeši nukleotidai, kurios yra komplementarios miR-26a sėklos regione buvo mutuotos sait-mutagenezės (Stratagenas, La Jolla, CA, USA). Statyti FGF9 ekspresija vektorių, FGF9 ORF kDNR buvo įsigytas iš GeneCopeia (Rockville, MD, JAV) ir subklonuotas į eukariotinių išraiška vektoriaus pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

liuciferazės Žurnalistė Analizės

"Pasaulis-26a arba kepti plaktą lentiviruses ir pMIR-3'UTR vektorius buvo bendrai perkeltų į HEK-293T ląstelių. Renilla ir Firefly luciferase veikla buvo matuojamas Dvejopo liuciferazės Reporter sistemos (Promega, Madison, WI), po 24 valandų transfekciją. "Firefly liuciferazė veikla buvo standartizuoti Renilla liuciferazės išraiškos kiekvieno mėginio. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

Western Blot

imunoblotingu buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [16]. Trumpai tariant, baltyminiai fragmentai buvo atskirtas nuo 10% SDS-PAGE ir elektros-trophoretically perduota PVDF (polivinilideno difluoridą) membrana. Tada membrana buvo inkubuojami su pelės antikūnų, nukreiptų prieš priešpėstinių FGF9 antikūnas (Santa Cruz, CA, JAV), po to HRP (krienų peroksidazės) žymėto ožkų antimouse IgG (Santa Krusas, Kalifornija, JAV), ir nustatoma cheminės liuminescencijos. β-aktino buvo naudojamas kaip baltymų-krovimo valdymu.

Mobilaus ryšio proliferacijos tyrimu

Ląstelės buvo padengtu 12-duobučių lėkštelėse galėtų būti nukreiptas norimu ląstelių koncentracija. Ląstelių skaičius buvo apskaičiuotas trypsinizing ląsteles ir atliekant analizę, naudojant Coulter skaitiklis (Beckman Coulter, Fullerton, JAV) ne nurodytu laiku kiekis tris kartus.

Mobilusis Migracija ir invazija tyrimai

Mobilusis migracija buvo tiriama naudojant žaizdų gijimo tyrimų. Dirbtinis "žaizda" buvo sukurtas ant susiliejantis ląstelių monosluoksnio ir nuotraukos buvo imtasi naudojant apverstą mikroskopą ( "Olympus", Tokijas, Japonija) po 24 valandų.

ląstelių invazija tyrimas, ląstelės buvo pasėtos ant pamatinės membranos matrica esančių pasibaigiant 24-šulinėlių auginimo plokštelės įdėklu (EB matrica, Chemicon, Temecula, CA) ir vaisiaus jaučio serumo buvo įtraukta į apatinę kamerą kaip chemoattractant. Dar po 48 valandų, kad ne užplūsta ląsteles ir EB matrica buvo švelniai pašalinti su medvilniniu tamponu. įsikūręs ant apatinės kameros Invazinės ląstelės buvo tamsintas su violetinei suskaičiuoti ir nufotografuota.

kolonija formavimas Analizės

Šešių bei plokštelės buvo padengta 0,6% agaro sluoksnyje terpėje papildytas 20% vaisiaus galvijų serumo. Ląstelės (1 × 10 ^{4) buvo parengta 0,3% agaro ir pasėjamos trimis egzemplioriais. Po to, kai plokštės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje dvi savaites, bičių buvo skaičiuojami.}

Apoptozę analizė

apoptoziniu ląstelės buvo įvertintas ir prie aneksino V-FITC ir propidiumo jodo dažymo (BD, JAV ) ir analizuojami su FACS Calibur priemonės (BD, JAV). Surinkti duomenys buvo analizuojami naudojant FlowJosoftware.

Pelės ksenografiniuose Modelis

skrandžio vėžio modelis nuogas pelių buvo apskaičiuota, kaip aprašyta anksčiau [25]. Įvertinti PPN-26a vaidmenį navikų susidarymo, užsikrėtę Pasaulis-26A arba plaktai virusų SGC-7901 ląstelės buvo dauginami ir oda pasėta į nugaros šonus nuo nuogas pelių (5 kiekvienoje grupėje). Naviko dydis buvo matuojamas kas 5 dienas. Po 30 dienų, pelės buvo nužudyti, buvo atliktas lavonų skrodimai ir navikai buvo pasverti. Naviko apimtis buvo nustatyta pagal šią formulę: a × b punktas ^{2/2, kur A yra didžiausias skersmuo ir B yra skersmuo statmenai A. Norėdami bandinys MIR-26A anketa poveikį naviko metastazių, SGC-7901 ląstelių užsikrėtę su Pasaulis-26a arba kepti plaktą virusai buvo švirkščiamas į uodegos veną nuogas pelėmis (6 kiekvienoje grupėje). Po to, kai 45 dienų, buvo atliktas lavonų skrodimai. Skaičiai mikrometastazių į plaučius per HE-tamsintas skyrius atskirų pelių buvo analizuojami morfologija stebėjimu. Eksperimentiniai protokolai buvo patvirtinti gyvūnų tyrimų apsaugos komiteto Guangdžou medicinos universitete. buvo stebimi Standartiniai gyvūnų priežiūros ir laboratorinių tyrimų gairės.}

Statistinė analizė

palyginimai tarp grupių buvo analizuojami T- pervežimas bandymo ir x ^{2 testą. Bendras išgyvenamumas kreivės ir atkryčių be kreivės buvo brėžiamas naudojant Kaplan-Meier metodu, su log-rank testas taikomas palyginimui. Išlikimo buvo matuojamas nuo operacijos dieną. Kintamieji, kurių vertė yra P
< 0,05 pagal vieną požymį analizę buvo naudojami tolesniame Dispersinės analizės remiantis Cox proporciniai pavojų modelį. Spearman koreliacijos testai buvo naudojami įvertinti Porinis išraiška koreliaciją tarp miR-26a ir FGF9 GC audiniuose. Visi skirtumai buvo statistiškai reikšmingi ne iš P
≤0.05 lygiu. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS15.0 programinę įrangą.}

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
KRL-PGR matuojamas Mir-26A raiškos lygį SGC-7901 ir AGS ląsteles užsikrėtę Pasaulis-26a lentiviruso taip pat Ges-1 ląstelių transfektuotose Pasaulis-26A inhibitorių
Doi:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
S2 pav.
KRL-PGR matuojamas Mir-26A raiškos lygius navikų audiniuose, išgauti iš nuogas pelių 30 dieną ant vėžinių ląstelių injekcija. Visi duomenys yra parodyta kaip vidurkis ± s.e.m
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
lentelė S1.
Tikslinės genai, kurie buvo prognozuojama visų trijų algoritmų (Targetscan, Pictar ir Miranda)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003
(xls)
S2 lentelėje.
Charakteristikos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Padėka

Mes dėkojame J MA ir KK Wang jų techninę pagalbą.

• PLoS ONE: ERCC1 ir ERCC2 Variantai Spėkite išlikimo skrandžio vėžys Patients
• PLoS ONE: klinikinė reikšmė MYT1L Gene polimorfizmas Kinijos sergantys skrandžio vėžio