PLoS ONE: miR-26a onderdrukt tumorgroei en metastase door zich te richten FGF9 in Gastric Cancer

Abstract

De rol van miR-26a in kankercellen leek controversieel in eerdere studies. Tot nu toe is de rol van miR-26a bij maagkanker blijft ongedefinieerd. In deze studie hebben we vastgesteld dat miR-26a sterk was downgereguleerd in maagkanker (GC) weefsels en cellijnen, en de expressieniveaus zijn geassocieerd met lymfeklier en klinisch stadium, en met de totale overleving en replase overleving GC . We vonden ook dat ectopische expressie van miR-26a remde proliferatie GC cel en GC metastase In vitro Kopen en In vivo
. Verder hebben we identificeerden een nieuw mechanisme van miR-26a groei en metastase GC onderdrukken. FGF9 werd bleek een direct doelwit van miR-26a, met behulp van luciferase test en western blot. FGF9 overexpressie in miR-26a-expressie brengen kon redden invasie en groeistoornissen van miR-26a. Bovendien, miR-26a expressie omgekeerd gecorreleerd met FGF9 eiwitgehalten in GC. Tezamen suggereren onze data dat miR-26a functioneert als een tumor suppressor in GC ontwikkeling en progressie, en houdt belofte als een prognostische biomarker en potentieel therapeutisch doel voor GC

Visum:. Deng M, Tang Hl, Lu Xh, Liu My, Lu Xm, Yx Gu, et al. (2013) miR-26a onderdrukt tumorgroei en metastase door zich te richten FGF9 bij maagkanker. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662

Uitgever: H. Sunny Zon, Institute of Molecular Medicine, Taiwan

Ontvangen: 29 maart 2013; Aanvaard: 12 juli 2013; Gepubliceerd: 28 augustus 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nature Scientific Foundation of China (81101526, 31100936) en Guangzhou Medical College Doctor Start Foundation (2012C11). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

miRNAs zijn endogeen tot expressie, kleine niet-coderende RNA's die negatief reguleren genexpressie door het veroorzaken van afbraak van doelwit mRNA, remming van de translatie van mRNA of deze beide [1]. miRNAs nemen deel aan belangrijke cellulaire processen zoals de stressrespons, ontwikkeling, differentiatie, apoptose en proliferatie [2]. Veranderde miRNA expressie gerapporteerd in vele tumoren, waaronder borst [3], [4], long [5], lever [6], maag [7], colon [8], hersenen [9], leukemie [10], en lymfoom [11]. Een toenemend aantal studies hebben aangetoond dat miRNAs kan functioneren als oncogenen of tumor suppressors, en zij worden vaak verstoord bij tumoren [12], [13]. In dit opzicht zijn oncogene miRNAs vaak opgereguleerd, terwijl de tumor-onderdrukkende miRNAs zijn downregulated in tumoren. Zo is let-7 gemeld worden underexpressed bij longkanker en richten het oncogene Ras [14], [15]. We hebben eerder gemeld dat miR-216b sterk neerwaarts gereguleerd in nasofarynxcarcinoom en verzwakt tumorgroei door zich te richten KRAS [16]. In tegenstelling, de oncogene miR-17-92 cluster van miRNAs opgereguleerd in verschillende tumor [17] en gedwongen expressie van deze miRNAs in de goed onderzochte Eg-myc transgeen muismodel van B-cellymfoom aanzienlijk versnelt ziekte begin en verloop [18]. De rol van miR-26a in kankercellen leek controversieel, aangezien het een tumor suppressor in hepatocellulaire carcinoma [19], borstkanker [20] en nasofaryngeale carcinomen [21], [22], maar een oncogen bij glioom [23 ] en cholangiocarcinoom [24]. Tot nu toe is de rol van miR-26 bij maagkanker was undefined.

In de huidige studie onderzochten we miR-26a expressie in 40 gepaarde normale en GC exemplaren door middel van kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) analyse . miR-26a bleek sterk neerwaarts gereguleerd in GC weefsels vergeleken met die van aangrenzende normale weefsels maag. Dit resultaat werd bevestigd door in situ hybridisatie op tissue microarrays bestaande uit 126 gevallen van GC weefsels en 41 gevallen van aangrenzend normaal weefsel. Bovendien verminderde miR-26a werd geassocieerd met een slechte prognose en kunnen onafhankelijk algehele overleving (OS) en replase overleving (RFS) bij maagkanker voorspellen. Functionele studies bleek dat miR-26a onderdrukte groei GC cel en metastase door zich te richten FGF9.

Resultaten

miR-26a wordt neerwaarts gereguleerd in Human MaagKanker

Met behulp van een qRT-PCR methode, miR-26a niveaus werden gedetecteerd in 40 paren maagkanker weefsels en bij elkaar passende aangrenzende weefsels, evenals maag cellijnen. Van de 40 patiënten met maagkanker, ongeveer 70% (28 van de 40 patiënten) tumoren toonde een meer dan tweevoudige verlaging van miR-26a niveaus, met een 5,76-voudige verlaging ten opzichte van aangrenzend normaal weefsel suggereert dat verlaging van miR -26a was een frequente gebeurtenis uit de GC (Figuur 1A). Bovendien werd miR-26a expressie verlaagd in alle maagkanker cellijnen (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, en BGC-823) in vergelijking met de niet-kwaadaardige maag-cellijn GES-1 (Figuur 1B). Om de resultaten met betrekking tot de biologische rol van miR-26a in menselijke maagkanker verder te verifiëren, gebruikten we in situ hybridisatie aan miR-26a expressie evalueren 126 GC en 41 niet-tumorweefsels on tissue microarray (TMA). Uit de resultaten bleek dat de expressie scores van miR-26a aanzienlijk GC werden afgenomen ten opzichte van normale weefsels (figuur 1C). Vervolgens bepaalden wij het potentieel klinisch-pathologische gevolgen van de veranderde miR-26a expressie. Klinische monsters werden verdeeld in lage en hoge expressie expressie groepen op basis van scores miR-26a expressie groter of kleiner dan de mediaan. In overeenstemming met de bovenstaande gegevens van de 41 totale normale maag monsters, 35 (85%) hadden een hoge expressie van miR-26a. In tegenstelling tot 60% (76 van de 126) van maagcarcinoom exemplaren had een lage tot negatieve expressie van miR-26a. Van de 126 personen met GC, 38 waren negatief voor lymfeklier metastase, en 45% van deze patiënten had een lage tot negatieve expressie van miR-26a (tabel 1). Achtentachtig patiënten waren positief voor lymfeklieren metastase, en 67% van hen toonde downregulatie of verlies van miR-26a (tabel 1). Bovendien vonden we lage expressie van miR-26a in 37% en 77% van maag tumoren geclassificeerd als fase I /II en stadium III /IV, respectievelijk (Tabel 1). Daarom miR-26a expressie omgekeerd correleert met lymfeklier metastase en klinische fase ( P
= 0,019 en P Restaurant < 0,001, respectievelijk). Echter, miR-26a niet correleren met leeftijd, geslacht, celdifferentiatie, of invasie diepte (T-stadium). Deze resultaten suggereren dat de miR-26a een cruciale rol zou kunnen spelen bij de GC metastase en progressie.

Verminderde miR-26a correleert met Poor Clinical Prognose

Om de betekenis van miR-26a verder te analyseren op het gebied van de klinische prognose, werd Kaplan-Meier survival analyse uitgevoerd met behulp van de patiënt algehele overleving en recidief-vrije overleving. De resultaten toonden aan dat patiënten met een lage miR-26a expressie hadden kortere mediane OS en RFS dan patiënten met een hoge miR-26a expressie (21,6 maanden versus 39,0 maanden, P Restaurant < 0,001 voor OS; 15,2 maanden vs . 31,6 maanden, P
= 0,002 voor RFS Figuur 1D). We gebruikten Cox proportionele-risico's regressie naar de associatie tussen miR-26a expressie en prognose verder te evalueren. In univariate analyse lymfekliermetastase, TNM en miR-26a niveaus waren significant geassocieerd met het OS en RFS (Tabel 2, 3). De uiteindelijke multivariate model is gebleken dat de totale overleving significant afhankelijk van lymfeklier metastase, TNM stadium, en miR-26a niveaus (tabel 2), en recidief-vrije overleving tijd deed op lymfeklier metastase en miR-26a niveaus (tabel 3).

miR-26a onderdrukt GC groei en metastase

Wijzend op de inverse correlatie tussen miR-26a levels en metastase, we het effect van miR-26a re-expressie onderzocht op de migratie en invasie mogelijkheden van GC cellijnen. GC twee cellijnen (SGC-7901 en AGS) met een relatief lage basale expressie van miR-26a (Figuur 1B) werden geïnfecteerd met ofwel miR-26a of control lentivirus en geselecteerd met 5 mg /l puromycine gedurende twee weken. Vervolgens wondgenezing assay en transwell assay werden uitgevoerd. Zoals verwacht, overexpressie van miR-26a onderdrukt significant celmigratie en invasie capaciteiten (Figuur 2A, B; figuur S1).

Om het effect van miR-26a van GC groei tonen, voerden we GC celproliferatieassay. De proliferatie test toonde aan dat ectopische expressie van miR-26a in SGC-7901 en AGS verzwakt celproliferatie vergeleken met controle-cellen (figuur 2C). Bovendien, buitenbaarmoederlijke miR-26a expressie remde kolonie vorming vermogen in zachte agar (figuur 2D). Vervolgens hebben we uitgevoerd cel apoptose analyse en bleek dat miR-26a overexpressie in SGC-7901-geïnduceerde apoptose (figuur 2E).

Vervolgens hebben we getest of miR-26a een rol bij het ontstaan ​​van tumoren zou kunnen spelen met behulp van naakt muis xenograft modellen. We vonden dat overexpressie van miR-26a in SGC-7901 cellen significant onderdrukt tumorgroei in naakt muizen (figuur 3A; Figuur S2). Vervolgens SGC-7901 cellen geïnfecteerd met hetzij miR-26a of control lentivirsus werden geïnjecteerd in de staartader van naakt muizen longmetastasen onderzoeken. Zoals getoond Figuur 3B, kan een aanzienlijk lager aantal macroscopische longmetastasen worden waargenomen in miR-26a overexpressie cellen dan controlecellen. Deze resultaten geven aan dat miR-26a groei GC en metastase kunnen onderdrukken.

miR-26a Direct Doelen en remt FGF9

Om te begrijpen hoe miR-26a onderdrukt groei GC en metastase, gebruikten we drie algoritmes (Targetscan, PicTar en Miranda) te helpen identificeren miR-26a targets in menselijke maagkanker. Van deze doelgenen die werden voorspeld door alle drie algoritmen (Tabel S1), FGF9 onze aandacht onmiddellijk als het is betrokken bij het ontstaan ​​van tumoren en metastase [26] - [28]. Wij gekloneerd volledige lengte FGF9 3'-UTR in een luciferase reporter vector. Luciferase assay bleek dat miR-26a direct gebonden aan FGF9 3'-UTR, en waardoor zij bijzonder verminderde luciferase activiteiten (Figuur 4A). Echter, mutatie van het vermeende miR-26a sites in de 3'-UTR van FGF9 ingetrokken luciferase respons op miR-26a (Figuur 4A). Om het effect van miR-26a op FGF9 expressie direct evalueren, voerden we Western blotanalyse. Zoals blijkt uit figuur 4B, lentivirale geïnduceerde ectopische miR-26a dramatisch onderdrukt de FGF9 eiwitgehalten in SCG-7901 en AGS cellen. Bovendien knockdown van miR-26a, door middel van transfectie van anti-miR-26a, in GES-1-cellen verhoogde FGF9 eiwitgehalte (Figuur 4B Figuur S1). Samengenomen geven deze resultaten aan dat FGF9 een direct stroomafwaarts doelwit voor miR-26a GC cellen. De bovenstaande resultaten voor ons aanleiding om te onderzoeken of miR-26a onderdrukt groei GC en metastase door middel van het onderdrukken van FGF9 expressie. Hiertoe FGF9 werd opnieuw gebracht in miR-26a-getransfecteerde SGC-7901 cellen. In miR-26a-expressie brengen, re-expressie van FGF9 redde de invasie en groeistoornissen van miR-26a (Figuur 4C, D, E). Tot slot hebben we getest als miR-26a expressie gecorreleerd met FGF9 eiwitgehalten in GC. Er was een omgekeerde correlatie tussen de FGF9 eiwitniveaus aangeduid door immunohistochemische kleuring en miR-26a expressie bepaald door in situ hybridisatie in 126 GC weefsels op TMA zoals hierboven (figuur 4F; Figure1C) gebruikt. Onze bevindingen tonen aan dat miR-26a heeft eigenschappen in overeenstemming met tumor suppressor functie. De mogelijkheid om moduleren FGF9 niveau zou kunnen verklaren, althans ten dele, waarom miR-26a GC groei en metastase kan remmen.

Discussie

miR-26a behoort tot de miR-26 familie, die bevat een ander lid miR-26b, die beide huisvesten identieke sequentie met uitzondering van de 2 verschillende nucleotiden in mature miRNAs. miR-26a is een functionele miRNA dat vorige onderzoek [29] heeft verdiend. Het is bekend dat miR-26a een belangrijke rol in de groei, ontwikkeling en celdifferentiatie van verschillende weefsels [29] speelt. Verschillende studies hebben aangetoond dat miR-26a expressie ontregeld in verschillende humane tumoren [19], [22], [24], [30], [31]. Echter, geen van deze studies met betrekking tot maagkanker. In de huidige studie, gebruikten we qRT-PCR en ISH aantonen dat miR-26a niveaus in weefsels maagkanker significant lager dan die in niet-tumorweefsels. Bovendien waren de miR-26a die samenhangen met de klinische fase en de aanwezigheid van lymfkliermetastasen. Kaplan-Meier survival analyse toonde aan dat patiënten bij wie de primaire tumoren weergegeven lage expressie van miR-26a had een kortere OS en RFS in GC. Bovendien, Cox proportional-hazards regressie analyse toonde aan dat miR-26a verlaagd in tumoren was een sterke en onafhankelijke voorspeller van kortere OS en RFS. Gebaseerd op matrix gegevens werd eerder gemeld dat een combinatie van verschillende miRNAs nuttig als prognostische merkmiddelen bij maagkanker [32] kan zijn, [33]. Bovendien, een miRNA, zoals miR-218, kan een prognostische indicator [34] zijn. Echter, deze miRNAs onderzocht in enkele maag kankerpatiënten. Hier kan miR-26a nuttig zijn als een prognostische marker voor overleving en recidive te voorspellen bij maagkanker zijn.

Deze studie toonde aan dat ectopische expressie van miR-26a in GC cellen aangetast migratie, invasie, proliferatie en kolonie groei en geïnduceerde apoptose. Bovendien, in vivo gegevens tonen miR-26a remde tumorgroei en metastase. Deze in vitro en in vivo gegevens verder aan dat miR-26a functioneert als een tumor suppressor bij maagkanker. Verschillende studies ondersteunen onze resultaten. Zo wordt dit miRNA afgenomen NPC weefsels en kunnen celgroei en tumorigenese verzwakken doelwit EZH2 [22]. Leverkanker vertoont ook een verminderde expressie van miR-26a [19]. Systemische toediening van dit miRNA in een muismodel van HCC gebruik van een adeno-geassocieerd virus (AAV) resulteert in remming van kanker celproliferatie, inductie van tumor-specifieke apoptose en dramatische bescherming tegen ziekteprogressie zonder toxiciteit [35]. Echter, in verschillende recente studies bleek de oncogene rol van miR-26a in tumoren zoals glioom en cholangiocarcinoma. Huse et al. gemeld dat miR-26a in hooggradig glioom werd tot overexpressie gebracht en direct gerichte PTEN [23]. Evenzo werd miR-26a gevonden dat overexpressie in menselijke weefsels en galwegkanker cholangiocarcinoom groei te bevorderen door het activeren van B-catenine [24]. Deze omstreden resultaten suggereerden dat de rol van miR-26a was misschien tumorspecifieke en sterk afhankelijk is van zijn doelen in verschillende kankercellen. Diverse studies hebben aangetoond dat PTEN [23], EZH2 [21], [22], Smad1 [36], CDK6 en cycline E1 [37] zijn potentiële downstream doelwit genen van miR-26a. In deze studie, FGF9, een nieuwe directe en functionele doel van miR-26a, werd geïdentificeerd in GC. FGF9, ook bekend als gliale activerende factor, een van 23 leden van de FGF-familie sterk geconserveerd. Als uitgescheiden geglycosyleerde 26 kDa-eiwit heeft mitogene effecten op een grote verscheidenheid aan celtypen [26]. FGF9 is aangetoond dat een rol bij verschillende kankers zoals eierstokkanker endometrioïde adenocarcinoom [26], hepatocellulair carcinoom [27] en prostaatkanker [28]. In onze studies, we bevestigd dat FGF9 was een direct doelwit van miR-26a in GC cellen. Om te bepalen of miR-26a onderdrukt groei GC en metastase door middel van repressie FGF9 meningsuiting, vonden we dat FGF9 overexpressie invasie en groeistoornissen van miR-26a kon redden. Deze resultaten suggereren dat miR-26a remt groei GC en metastase deels door zich te richten FGF9.

Bij elkaar genomen, zagen we downregulatie van miR-26a bij maagkanker cellen en toonden aan dat miR-26a kan fungeren als een onafhankelijke voorspeller van OS en RFS. We vinden verder dat miR-26a bezit de potentie om de groei GC en metastase te onderdrukken door het reguleren van FGF9. Onze bevindingen suggereren miR-26a functioneert als een tumor suppressor in GC en houdt belofte als een prognostische biomarker en potentieel therapeutisch doel voor GC.

Materialen en methoden

Cell Culture

de maag epitheliale cellijn GES-1 werd gekocht van het Beijing Institute for Cancer Research (Beijing, China). De GC-cellijnen MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, en BGC-823 werden verkregen van de Chinese Academie van Medische Wetenschappen (Beijing, China). Deze cellen werden bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO _{2 in RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) of F12 gehandhaafd ( AGS) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline en streptomycine (Gibco BRL, NY, USA). Alle transfecties gebruikt Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).}

klinische monsters

Alle weefselmonsters die in de huidige studie werden verzameld uit de Hunan Provinciaal Tumor Hospital (Changsha, Hunan, China). Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle deelnemers aan de studie. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Guangzhou Medical University Health Authority. Het verzamelen en gebruiken van weefsels volgde de procedures die in overeenstemming zijn met de ethische normen zoals geformuleerd in de Verklaring van Helsinki

​​weefselmonsters van 40 maagkanker patiënten (23 mannen en 17 vrouwen;. Mediane leeftijd 59 jaar; range 40-84 jaar) werden gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR-analyse (qRT-PCR). Gereseceerd kankerweefsel (Tumor) en gekoppeld gematched normale gastrische weefsels (Normaal) werden onmiddellijk gesneden, ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA-extractie.

De tissue microarray (TMA), bestaande uit 126 GC en 41 aangrenzend normaal weefsel maag, werden gebruikt voor in situ hybridisatie analyse. De mediane leeftijd van de patiënten met maagkanker bij diagnose was 57 jaar (range 31-82). De mediane follow-up tijd voor de totale overleving (OS) en recidief-vrije overleving (RFS) was 22 maanden en 15 maanden, respectievelijk. Alle gegevens van 126 GC monsters, zoals leeftijd, geslacht, tumor, histologische graad, invasie diepte (T-stadium), klinische fase en lymfeklier werden verkregen uit klinische en pathologische platen en samengevat in tabel 2. aanvullende

Kwantitatieve RT-PCR-analyse

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). Reverse transcriptie en qRT-PCR reacties werden uitgevoerd met behulp van een qSYBR pers PCR kit (Qiagen, Germantown, USA) en U6 snRNA werd gebruikt als endogene controle. Voudige verandering werd bepaald als 2 ^{-ddCt. De Ct is het fractionele cyclusnummer waarbij de fluorescentie van elk monster de vaste drempel. De DDCT werd berekend door de DCT van de referentiemonster (gepaarde niet-tumorweefsel voor chirurgische monsters en GES-1 cel zes maagkanker cellijnen) vanaf de DCT van elk monster. De sequenties van de primers voor specifieke miR-26a en U6 snRNA waren 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'en 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' resp.}

In situ hybridisatie en immunohistochemie

Detectie van miR-26a door in situ hybridisatie met gebruikmaking van de DIG-gemerkte vergrendeld nucleïnezuur (LNA) gebaseerde specifiek voor miR-26a sonde (Exiqon, Vedbaek, Denemarken) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en U6 snRNA werd gebruikt als een positieve controle. Kort in, tissue microarray objectglaasjes werden van paraffine ontdaan, behandeld met proteinase K (5 min bij 2 ug /ml protease K), gewassen in PBS en vervolgens geblokkeerd endogene peroxidase-activiteit met 3% H _{2O 2. Hybridisatie werd uitgevoerd bij 52 ° C geïncubeerd na toevoeging van 50 nM DIG-gelabelde probes LNA, gevolgd door een wassing in SSC buffers. Na het blokkeren (2% schapen serum en 2 mg /ml BSA in PBS met Tween-20) bij kamertemperatuur, werd de probe-target complex gevisualiseerd met gebruikmaking van een anti-DIG-POD antilichaam en DAB complex.}

immunohistochemie werd uitgevoerd op secties weefsel microarray met behulp van anti-FGF9 antilichaam (Santa Cruz, CA, USA). Het complex werd gevisualiseerd met streptavidine /peroxidase en DAB complexe en kernen tegengekleurd met hematoxyline. In situ hybridisatie en immunohistochemie werden resultaten gescoord door intensiteit (0-4) en het percentage kleuring (0 tot 100%). Relatieve expressie werd verkregen door het vermenigvuldigen van de intensiteit door percentage. De dia's werden geanalyseerd door twee onafhankelijke pathologen.

Recombinant Vector

Recombinant lentivirussen bevatten miR-26a voorloper of scramble sequenties werden gekocht van SunBio (Shanghai, China). Voor luciferase analyse de volledige lengte FGF9 3'-UTR werd geamplificeerd uit humaan bloed genomisch DNA en gekloneerd in het stroomafwaartse gebied van een vuurvlieg luciferase cassette PMIR-REPORT luciferase vector (Ambion, Austin, TX, USA). De overeenkomstige mutant constructen, waarin de eerste zes nucleotiden complementair zijn aan de miR-26a seed-gebied gemuteerd door plaatsgerichte mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Naar FGF9 expressie vectorconstruct werd FGF9 ORF cDNA verkregen van GeneCopeia (Rockville, MD, USA) en gesubkloneerd in de eukaryotische expressievector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

miR-26a of scramble lentivirussen en PMIR-3'UTR vector werd co-getransfecteerd in HEK-293T-cellen. Renilla luciferase en vuurvlieg activiteiten werden met de Dual-Luciferase Reporter systeem (Promega, Madison, WI) 24 uur na transfectie. Vuurvlieg luciferase activiteit werd genormaliseerd naar Renilla luciferase uitdrukking voor elk monster. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.

Western Blot

Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder [16] beschreven. In het kort werden eiwit lysaten gescheiden door 10% SDS-PAGE en elektro-trophoretically overgebracht naar PVDF (polyvinylideendifluoride) membraan. Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met antilichaam tegen muizen anti-FGF9 antilichaam (Santa Cruz, CA, USA) gevolgd door HRP (horseradish peroxidase) -gemerkte geit-antimuis IgG (Santa Cruz, CA, USA) en gedetecteerd door chemiluminescentie. β-actine werd gebruikt als een proteïne-beladingscontrole.

Cell Proliferation Assay

Cellen werden uitgeplaat op 12-well platen in de gewenste cel concentraties. Celtellingen werden geschat door trypsinizing de cellen en het uitvoeren van analyses met behulp van een Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) op de aangegeven tijdstippen in drievoud.

celmigratie en invasie assays

Celmigratie werd onderzocht met behulp van wondgenezing assays. Een kunstmatige "wond" is gecreëerd op een confluente monolaag en foto's werden genomen met behulp van een omgekeerde microscoop (Olympus, Tokyo, Japan) en 24 uur.

Voor celinvasie test werden cellen gezaaid op het basismembraan matrix aanwezig in de insertie van een 24-well kweekplaat (EG matrix, Chemicon, Temecula, CA) en foetaal runderserum werd toegevoegd aan de onderste kamer als een chemoattractant toegevoegd. Na nog eens 48 uur werden de niet-binnendringende cellen en EG matrix voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Invasieve cellen die zich aan de onderzijde van de kamer werden gekleurd met kristalviolet, geteld en afgebeeld.

Kolonie Formatie Assay

Zes putjes werden bedekt met een laag van 0,6% agar in medium aangevuld met 20% foetaal runderserum. Cellen (1 x 10 ^{4) werden bereid in 0,3% agar en gezaaid in drievoud. Nadat de platen bij 37 ° C gedurende twee weken werden geïncubeerd, werden de kolonies geteld.}

Apoptose analyse

De apoptotische cellen werden geëvalueerd door Annexine V-FITC en propidiumjodide kleuring (BD, USA ) en geanalyseerd met een FACS Calibur instrument (BD, USA). De verzamelde gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJosoftware.

Mouse xenotransplantaatmodel

De maagkanker model in naakt muizen werd geconstrueerd zoals eerder beschreven [25]. Om de rol van miR-26a in tumorvorming geëvalueerd werden SGC-7901 cellen geïnfecteerd met miR-26a of scramble virussen gepropageerd en subcutaan geïnoculeerd in de dorsale flank van naakt muizen (5 per groep). Tumorgrootte werd elke 5 dagen gemeten. Na 30 dagen werden de muizen gedood, necropsie uitgevoerd en werden de tumoren gewogen. Tumor volumina werden bepaald volgens de volgende formule: A x B ^{2/2, waarbij A de grootste diameter en B de diameter loodrecht op A. Aan effect miR-26a op tumormetastase testen, SGC-7901 cellen geïnfecteerd met miR-26a of scramble virussen werden geïnjecteerd in de staartader van naakt muizen (6 in elke groep). Na 45 dagen werden lijkschouwingen verricht. Nummers van micrometastasen in de longen per HE-gekleurde coupe in individuele muizen werden geanalyseerd door morfologie observatie. De experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Research Committee Bescherming van Guangzhou Medical University. Standard verzorging van dieren en het laboratorium richtlijnen werden gevolgd.}

Statistische analyse

Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van de t- Electronics Test en x ^{2-test. Overall survival curves en recidief-vrije curves werden uitgezet met behulp van de Kaplan-Meier-methode, met de log-rank test aangevraagd vergelijking. Overleving werd gemeten vanaf de dag van de operatie. Variabelen met een waarde van P
< 0,05 volgens de univariate analyse werden in aansluitende multivariate analyse op basis van het Cox proportional hazards model. Spearman correlatie testen werden gebruikt om de expressie paarsgewijze correlatie tussen miR-26a en FGF9 GC weefsels evalueren. Alle verschillen waren statistisch significant bij het niveau van de P
≤0.05. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS15.0 software.}

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
qRT-PCR gemeten van de miR-26a expressie niveaus in SGC-7901 en AGS-cellen geïnfecteerd met miR-26a lentivirus evenals GES-1-cellen die met miR-26a remmers
doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
Figuur S2.
qRT-PCR gemeten miR-26a expressieniveaus van tumorweefsels onttrokken naakt muizen op de 30e dag na injectie kankercellen. Alle gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.E.M.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Tabel S1.
Target genen die werden voorspeld door alle drie algoritmen (Targetscan, PicTar en Miranda)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
tabel S2.
Kenmerken van patiënten met maagkanker
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Dankwoord

Wij danken J Ma en CK Wang voor hun technische bijstand.

• PLoS ONE: ERCC1 en ERCC2 Varianten Voorspel Survival bij maagkankerpatiënten
• PLoS ONE: Klinische betekenis van MYT1L polymorfismen in het Chinees Patiënten met maagkanker