Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от природы научного фонда Китая (81101526, 31100936) и Гуанчжоу медицинского колледжа доктор Start Foundation (2012C11). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> микроРНК эндогенно выражены, малые некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов, вызывая деградацию мРНК мишеней, ингибирование перевода этих мРНК или обоих [1]. микроРНК принять участие в важнейших клеточных процессах, таких как стресс-реакции, развития, дифференциации, апоптоза и пролиферации [2]. Измененная экспрессия микроРНК сообщалось в многочисленных злокачественных заболеваний, в том числе молочной железы [3], [4], легких [5], печени [6], желудка [7], толстой кишки [8], мозг [9], лейкоз [10], и лимфома [11]. Все большее число исследований показали, что микроРНК может функционировать в качестве онкогенов или супрессоров опухолей, и они часто дизрегуляции в опухолях [12], [13]. В связи с этим, онкогенных микроРНК часто позитивно регулируется, в то время как подавления роста опухолей микроРНК подавляются в опухолях. Например, пусть-7 было сообщено быть underexpressed при раке легкого и целевой онкогенного Ras [14], [15]. Ранее мы сообщали, что микроРНК-216b сильно подавляются в карциномы носоглотки и затухает рост опухоли путем охвата KRAS [16]. В противоположность этому, онкогенными микроРНК-17-92 кластер микроРНК усиливается в различных опухоли [17], и исполнение экспрессию этих микроРНК в хорошо изученной Eμ-Myc трансгенной модели мыши клетки лимфомы значительно ускоряет начало заболевания и прогрессирования [18]. Тем не менее, роль микроРНК-26а в раковых клетках, казалось спорным, так как это супрессоров опухоли в гепатоцеллюлярной карциномы [19], рак молочной железы [20] и носоглотки [21], [22], но онкоген в глиомы [23 ] и холангиокарциному [24]. До сих пор, роль микроРНК-26 при раке желудка не было определено.
<Р> В настоящем исследовании, мы исследовали экспрессию микроРНК-26а в 40 парных нормальных и ГХ образцов с помощью количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR) анализ , микроРНК-26а было обнаружено, что сильно подавлена в дс тканях по сравнению с соседних нормальных тканей желудка. Этот результат был в дальнейшем подтвержден гибридизация на тканевых микрочипов, состоящих из 126 случаев ГЦ тканей и 41 случая соседних нормальных тканей. Кроме того, снижение микроРНК-26а был связан с плохим прогнозом и может самостоятельно предсказать общую выживаемость (OS) и выживаемость replase свободных (RFS) при раке желудка. Функциональные исследования показали, что микроРНК-26а подавляется рост GC клеток и метастазирование путем ориентации FGF9.
микроРНК-26а подавляются в рака желудка человека Для дальнейшего анализа значимости MIR-26а с точки зрения клинического прогноза, анализ выживаемости Каплана-Мейера проводилось с использованием пациента общей выживаемости и безрецидивной выживаемости. Результаты исследования показали, что пациенты с низкой экспрессии микроРНК-26а имел более короткую медиану ОС и RFS чем у пациентов с высокой экспрессии микроРНК-26а (21,6 месяцев против 39,0 месяцев, P микроРНК-26а Подавляет GC Рост и метастазирование Культура клеток Ткань микрочипов (ТМА), состоящий из 126 ШС и 41 смежных нормальные ткани желудка, были использованы для анализа гибридизация. Средний возраст больных раком желудка на момент постановки диагноза составил 57 лет (диапазон 31-82). Средний срок наблюдения для общей выживаемости (OS) и безрецидивной выживаемости (RFS) было 22 месяцев и 15 месяцев соответственно. Все данные 126 проб GC, включая возраст, пол, место опухоли, гистологической степени, глубина инвазии (T стадия), клинической стадии и метастазов в лимфатических узлах были получены из клинических и патологических записей и обобщены в таблице 2. дополнительном Количественный анализ оТ-ПЦР Клеточные Анализ пролиферации Миграция клеток и инвазии АНАЛИЗЫ Шесть-луночные планшеты были покрыты слоем 0,6% агара в среде с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки (1 × 10 4) готовили в 0,3% агаром и засевают в трех повторностях. После того, как планшеты инкубировали при 37 ° С в течение двух недель, колонии подсчитывают. Выражение признательности
<р> Использование QRT-PCR метод, уровни микроРНК-26a были обнаружены в 40 пар желудочных раковых тканей и их совпавших прилегающих тканей, а также желудочных клеточных линий. Среди 40 пациентов с раком желудка, примерно 70% (28 из 40 пациентов) опухолей выявлены более чем в два раза снижение уровней микроРНК-26а, с 5,76-кратное снижение по отношению к соседних нормальных тканей, предполагая, что снижение MIR -26a был частым событием в человеческом GC (Рисунок 1А). Кроме того, экспрессия микроРНК-26а была снижена во всех желудочных линий раковых клеток (MKN-28, СГК-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, и BGC-823) по сравнению с незлокачественной желудочный клеточной линии ГЭС-1 (рис 1В). Для дополнительной проверки результатов о биологической роли микроРНК-26а в канцерогенезе желудка человека, мы использовали на месте гибридизация, чтобы оценить экспрессию микроРНК-26а в 126 ШС и 41 неопухолевых тканей на микрочипы ткани (TMAS). Результаты показали, что выражение десятки MIR-26а были значительно уменьшились в ШС по сравнению с нормальными тканями (рис 1C). Далее, мы определили потенциальные последствия клинико-измененную экспрессию микроРНК-26а. Клинические образцы были разделены на низкой экспрессии и групп высокого экспрессии на основе экспрессии микроРНК-26а баллов больше или меньше, чем медиана. В соответствии с приведенными выше данными, из 41 полных нормальных образцов желудка, 35 (85%) имели высокий уровень экспрессии микроРНК-26а. В отличие от этого, 60% (76 из 126) желудочных образцов карциномы была низкой отрицательной экспрессии микроРНК-26а. Из 126 лиц с GC, 38 были отрицательными для метастазов в лимфатических узлах, и 45% этих пациентов имели от низкого до отрицательного экспрессии микроРНК-26а (таблица 1). Восемьдесят восемь пациентов были положительными для метастазов в лимфатических узлах, а 67% из них показали Подавление или утрата MIR-26а (таблица 1). Более того, мы обнаружили низкую экспрессию микроРНК-26а в 37% и 77% опухолей желудка, классифицируемых как стадии I /II и стадии III /IV, соответственно (таблица 1). Таким образом, выражение микроРНК-26а обратно коррелирует с метастазов в лимфатических узлах и клинической стадии ( P
= 0,019 и P
&л; 0,001, соответственно). Тем не менее, микроРНК-26а не коррелировала с возрастом, полом, клеточной дифференцировки, или глубины инвазии (T стадия). Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-26а может играть решающую роль в GC метастазирования и прогрессии.
Снижение микроРНК-26а коррелируют с плохим клиническим прогнозом
&л; 0,001 OS; 15,2 месяцев против . 31.6 месяцев, P
= 0,002 для RFS; Рисунок 1D). Мы использовали Кокса пропорционального риска регрессии для дальнейшей оценки связи между экспрессией микроРНК-26а и прогноз. В одномерном анализе, узел метастаза лимфатический, стадии TNM и уровни микроРНК-26а были значительно связаны с ОС и RFS (таблица 2, 3). Окончательный многомерная модель показала, что общая продолжительность жизни существенно зависит от узла метастаза лимфатический, TNM стадии и уровни микроРНК-26а (таблица 2) и безрецидивной выживаемости делали на метастаз лимфатических узлов и уровней микроРНК-26а (таблица 3).
<р> отмечая обратную корреляцию между уровнями микроРНК-26а и метастазирования, мы исследовали влияние микроРНК-26а повторного выражения на миграции и инвазии способностей GC клеточные линии. Две клеточные линии GC (SGC-7901 и AGS) с относительно низкой базальной экспрессии микроРНК-26а (рис 1B) были заражены либо MIR-26а или управления лентивирусов и выбраны с 5 мг /л пуромицин в течение двух недель. Далее, ранозаживляющие проводили анализ и анализ Transwell. Как и следовало ожидать, избыточная экспрессия микроРНК-26а значительно подавлена миграцию клеток и инвазию способности (фиг.2А, В; рис S1).
<Р> Для демонстрации эффекта микроРНК-26а на рост GC, мы проводили ГХ анализа клеточной пролиферации. Анализ пролиферации показали, что эктопическая экспрессия микроРНК-26а в SGC-7901 и AGS ослабляется пролиферацию клеток по сравнению с контрольными клетками (рис 2С). Кроме того, эктопическая экспрессия микроРНК-26а тормозится колонии способность образования в мягком агаре (рис 2D). Затем мы провели анализ клеточного апоптоза и показали, что микроРНК-26а избыточная экспрессия в SGC-7901 индуцированных апоптоза клеток (рис 2E).
<р> Далее, мы проверили, может ли микроРНК-26а играть определенную роль в онкогенеза с использованием обнаженной ксенотрансплантата мыши моделей. Мы обнаружили, что избыточная экспрессия микроРНК-26а в SGC-7901 клетках значительно подавляли рост опухоли у голых мышей (рис 3А, рисунок S2). Затем, СГК-7901 клетки, инфицированные либо микроРНК-26а или контрольных lentivirsus вводили в хвостовую вену безволосых мышей для изучения метастазов в легких. Как показано на фиг.3В, можно было наблюдать значительно меньшее число макроскопических легочных метастазов в микроРНК-26а гиперэкспрессией клеток, чем контрольные клетки. Эти результаты указывают на то, что микроРНК-26а может подавлять рост и метастазирование GC.
микроРНК-26а Непосредственно Цели и Угнетает FGF9
<р> Чтобы понять, как микроРНК-26а подавляет рост и метастазирование GC, мы использовали три алгоритма (TargetScan, Pictar и Миранда), чтобы помочь идентифицировать микроРНК-26а целей при раке желудка человека. Из этих генов-мишеней, которые были предсказаны всеми тремя алгоритмами (таблица S1), FGF9 привлекли наше внимание сразу же, как это было вовлечено в онкогенеза или метастазирования [26] - [28]. Мы клонировали полноразмерную FGF9 3'-UTR в люциферазы вектор репортера. Люциферазы показали, что микроРНК-26а непосредственно связан с FGF9 3'-UTR, и с помощью которого она значительно снижена люциферазные мероприятия (диаграмма 4A). Однако мутация предполагаемых сайтов микроРНК-26а в 3'-UTR из FGF9 аннулировал люциферазы реагирования на микроРНК-26а (рис 4A). Для того, чтобы непосредственно оценить влияние микроРНК-26а на экспрессию FGF9, мы провели Вестерн-блоттинга. Как видно на рисунке 4B, лентивирусов индуцированное внематочной микроРНК-26а резко подавляются уровни FGF9 белка в SCG-7901 и AGS клеток. Кроме того, нокдаун микроРНК-26а, через трансфекции анти-MIR-26а, в GES-1 клеток повышенные уровни FGF9 белка (рис 4В; Рис S1). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что FGF9 является прямым нижестоящей мишенью для микроРНК-26а в GC клетки. Приведенные выше результаты побудили нас исследовать подавляет ли микроРНК-26а рост и метастазирование GC через подавление экспрессии FGF9. Для этой цели была вновь выражена FGF9 в микроРНК-26а-трансфицированных SGC-7901 клеток. В MIR-26A-экспрессирующих клеток, повторно выражение FGF9 спас вторжения и роста дефектов MIR-26а (рис 4C, D, E). Наконец, мы проверили, если выражение микроРНК-26а коррелирует с уровнями FGF9 белка в GC. Был обратная корреляция между уровнями FGF9 белка, указывает иммуногистохимического окрашивания, и экспрессия микроРНК-26а оценивали гибридизация в 126 тканях ГХ на ТМА, используемое выше (рис 4F; Figure1C). Наши результаты показывают, что микроРНК-26а обладает свойствами в соответствии с функцией супрессора опухолей. Способность модулировать уровни FGF9 может объяснить, по крайней мере частично, почему микроРНК-26а может ингибировать рост GC и метастазирование.
Обсуждение
<р> микроРНК-26а принадлежит к семейству микроРНК-26, который содержит еще один член MIR-26b, оба из которых разместится идентичную последовательность за исключением 2-х различных нуклеотидов в зрелых микроРНК. микроРНК-26а представляет собой функциональную микроРНК, которая заслуживает предыдущее исследование [29]. Известно, что микроРНК-26а играет значительную роль в росте, развитии и дифференциации клеток различных тканей [29]. Несколько исследований показали, что экспрессия микроРНК-26а неупорядоченных в ряде опухолей человека [19], [22], [24], [30], [31]. Тем не менее, ни один из этих исследований не связано с раком желудка. В настоящем исследовании мы использовали QRT-PCR и ISH, чтобы показать, что уровни микроРНК-26а в желудочном раковых тканей были значительно ниже, чем в неопухолевых тканях. Кроме того, уровни микроРНК-26а были связаны с клинической стадией и наличием метастазов в лимфатических узлах. Kaplan-Meier анализ выживаемости показал, что пациенты, у которых первичная опухоль отображается низкой экспрессии микроРНК-26а имел более короткую ОС и RFS в GC. Кроме того, Кокса пропорционального риска регрессионный анализ показал, что восстановленный микроРНК-26а в опухолях был сильным и независимым предиктором более короткой ОС и RFS. На основе массива данных, ранее сообщалось, что сочетание нескольких микроРНК может быть полезным в качестве прогностических маркеров при раке желудка [32], [33]. Кроме того, один-микроРНК, например, микроРНК-218, может быть прогностическим индикатором [34]. Тем не менее, эти микроРНК были исследованы лишь в нескольких больных раком желудка. Здесь микроРНК-26а может быть полезным в качестве прогностического маркера для прогнозирования выживаемости и рецидивов при раке желудка.
<Р> Это исследование показало, что эктопическая экспрессия микроРНК-26а в GC клетках нарушается миграция, вторжение, пролиферацию и рост колоний как а также индуцированный апоптоз. Кроме того, данные в естественных условиях показали, микроРНК-26а ингибирует рост опухоли и метастазирование. Они в пробирке и в естественных условиях данных дополнительно указано, что функции микроРНК-26а как подавитель опухоли при раке желудка. Несколько исследований поддерживают наши результаты. Например, эта микроРНК уменьшается в тканях NPC и может ослабить рост клеток и онкогенеза путем ориентации Ezh2 [22]. Гепатоцеллюлярной карциномы также проявляет пониженную экспрессию микроРНК-26а [19]. Системное введение этого микроРНК в мышиной модели НСС с использованием аденоассоциированный вирус (AAV) приводит к ингибированию пролиферации раковых клеток, индукции апоптоза опухолевых специфических и драматической защиты от прогрессирования заболевания без токсичности [35]. Тем не менее, различные недавние исследования выявили онкогенного роль микроРНК-26а в опухолях, таких как глиомы и холангиокарциномой. Хас и др. сообщил, что микроРНК-26а был избыточно экспрессируется в высокой степени глиомы и непосредственно направлены PTEN [23]. Точно так же, микроРНК-26а было установлено, что избыточно экспрессируется в тканях холангиокарциномой человека и способствовать росту холангиокарциномой путем активации B-катенин [24]. Эти противоречивые результаты свидетельствуют о том, что роль микроРНК-26а была, возможно, опухоль специфичны и сильно зависит от его целей в различных раковых клетках. Различные исследования показали, что PTEN [23], EZH2 [21], [22], Smad1 [36], CDK6 и циклин E1 [37] являются потенциальными вниз по течению целевые гены микроРНК-26а. В этом исследовании, FGF9, новый прямой и функциональной мишенью MIR-26а, был выявлен в GC. FGF9, также известный как фактор глиального активирующим, является одним из 23 членов высококонсервативной FGF семейства. Как секретируемый, гликозилированный белок 26-кДа, он имеет митогенное действие на множестве различных типов клеток [26]. FGF9 было показано, что они причастны к различным видов рака, таких как яичников эндометриоидной аденокарциномы [26], гепатоцеллюлярной карциномы [27] и карциномы предстательной железы [28]. В наших исследованиях мы подтвердили, что FGF9 был прямой мишенью MIR-26а в GC клетки. Для того, чтобы определить, подавляет ли микроРНК-26а рост и метастазирование GC через подавление экспрессии FGF9, мы обнаружили, что FGF9 избыточная экспрессия может спасти вторжения и роста дефектов MIR-26а. Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-26а ингибирует рост и метастазирование GC частично ориентации FGF9.
<Р> Взятые вместе, мы наблюдали понижающей регуляции MIR-26а в клетках рака желудка и показали, что микроРНК-26а может выступать в качестве независимого предиктора OS и RFS. Кроме того, мы обнаружили, что микроРНК-26а обладает активностью подавлять рост и метастазирование GC путем регулирования FGF9. Наши результаты показывают микроРНК-26а функционирует как подавитель опухоли в GC и перспективен в качестве прогностического биомаркера и потенциальной терапевтической мишени для GC.
Материалы и методы
<р> желудочный эпителиальных клеток линии GES-1 был приобретен у Пекинского института по исследованию рака (Пекин, Китай). ГХ клеточные линии MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, и BGC-823 были получены из Китайской академии медицинских наук (Пекин, Китай). Эти клетки выдерживали при 37 ° С в атмосфере 5% CO <суб> 2 в среде RPMI-1640 (МГЦ-803, КУП-823, MKN-28, СГК-7901), DMEM (ГЭС-1) или F12 ( АГС) среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином и стрептомицином (Gibco BRL, NY, USA). Все используемые трансфекцию Липофектамин 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, США)).
Клинические образцы
<р> Все образцы ткани, используемые в настоящем исследовании, были собраны из провинции Хунань опухолевой больницы (Чанша, провинция Хунань, Китай). Письменное информированное согласие было получено от всех участников исследования. Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Гуанчжоу медицинского университета управления здравоохранения по. Сбор и использование тканей с последующим процедурам, которые в соответствии с этическими стандартами, сформулированных в Хельсинской декларации
<р> Образцы тканей из 40 больных раком желудка (23 мужчин и 17 женщина;. Средний возраст 59 лет, диапазон использовались 40-84 лет) для количественного ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) анализа. Резецировали раковые ткани (опухоль) и спаренные соответствует нормальной ткани желудка (Normal) были немедленно сокращены, замораживали в жидком азоте, и выдерживают при температуре -80 ° С до экстракции РНК.
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеток с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, США). Обратную транскрипцию и реакции QRT-ПЦР проводили с использованием qSYBR-зеленый PCR (Qiagen, Germantown, США) и U6 мяРНК использовали в качестве эндогенного контроля. Сложите изменение было определено, как 2 -ddCt. Ct является дробным числом циклов, при котором флуоресценцию каждого образца проходит фиксированный порог. DDCT рассчитывалась путем вычитания DCT эталонного образца (ткани в паре неопухолевой для хирургических образцов и GES-1 клеток в течение шести желудочные линий раковых клеток) из DCT каждого образца. Последовательности праймеров, специфичных для MIR-26а и U6 мяРНК были 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'и 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' соответственно.
На месте
гибридизация и иммуногистохимии
<р> Обнаружение микроРНК-26а путем гибридизации на месте, использующей в DIG-меченных заперта нуклеиновой кислоты (LNA) -На зонд, специфический для MIR-26а (Exiqon, Vedbaek, Дания) была выполнена в соответствии с инструкциями изготовителя и U6 мяРНК использовали в качестве положительного контроля. Бри мошка, ткани микрочипов слайды были депарафинировали, обрабатывали протеиназой К (5 мин в 2 мкг /мл протеазы К), промывали в PBS и затем блокировали эндогенную активность пероксидазы с 3% H <> 2O к югу <югу> 2. Гибридизацию проводили при 52 ° С в течение ночи, после добавления 50 нМ DIG-меченных зондов МШУ, с последующей промывкой жесткости в ЦМК буферами. После блокирования (2% сыворотки овец и 2 мг /мл БСА в PBS с Tween-20) при комнатной температуре, зонд-мишень комплекс визуализируют с использованием антитела против DIG-стручок и ПРИКОСНОВЕНИЯ комплекс.
<Р> Иммуногистохимическое проводили на срезах ткани микрочипов с использованием анти-FGF9 антитела (Santa Cruz, CA, США). Комплекс визуализировали с стрептавидин /пероксидазы и DAB комплекса, а также ядер контрастно гематоксилином. В situ гибридизация и иммуногистохимические результаты оценивали по интенсивности (0-4) и процент окрашивания (от 0 до 100%). Относительное выражение получено умножением интенсивности в процентах. Слайды были проанализированы с помощью двух независимых патологоанатомов.
Рекомбинантный вектор
<р> Рекомбинантные лентивирусов, содержащие прекурсоры или скремблирования последовательности микроРНК-26а были приобретены у SunBio (Шанхай, Китай). Для анализа люциферазы, полноразмерный FGF9 3'-UTR амплифицировали из крови геномной ДНК человека, а затем клонировали в нисходящем области светлячка люциферазы кассеты в pMIR-REPORT люциферазы вектора (Амбион, Остин, штат Техас, США). Соответствующие мутантные конструкции, в которых первые шесть нуклеотиды, комплементарные к микроРНК-26а семени области мутировали с помощью сайт-направленного мутагенеза (Stratagene, La Jolla, CA, США). Для построения FGF9 экспрессирующих вектора, FGF9 ORF кДНК был приобретен у GeneCopeia (Роквилл, штат Мэриленд, США) и субклонируют в эукариотической экспрессии вектора пкДНК3.1 (+) (Invitrogen).
люциферазы Анализ
<р> микроРНК-26а или скремблирования лентивирусов и pMIR-3'UTR вектор были котрансфицируют в НЕК-293Т. Renilla и люциферазы светляков деятельности были измерены с помощью двойного люциферазы системы (Promega, Madison, WI) через 24 ч после трансфекции. Светлячок активность люциферазы нормализовали к экспрессии люциферазы Renilla для каждого образца. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.
Вестерн-блот
<р> Вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее [16]. Если коротко, то белковые лизаты были разделены на 10% SDS-PAGE, и ЭЛЕК-trophoretically переданы PVDF (поливинилиденфторид дифторида) мембраны. Затем мембрану инкубировали с мышиным антителом против анти-FGF9 антитела (Santa Cruz, CA, США) с последующим HRP (пероксидаза хрена), меченным козьим-antimouse IgG (Santa Cruz, CA, США) и детектируется хемилюминесценции. β-актина, использовали в качестве контроля белка-погрузочной.
<р> Клетки высевали на 12-луночные планшеты при требуемой концентрации клеток. Подсчет клеток оценивали с помощью trypsinizing клеток и проведения анализа с использованием счетчика Coulter (Beckman Coulter, Фуллертон, США) в указанных временных точках в трех экземплярах.
<р> Миграция клеток исследовали с помощью ранозаживляющим анализов. Искусственный "рана" была создана на сливающийся монослой клеток, и фотографии были сделаны с использованием инвертированного микроскопа (Olympus, Токио, Япония) в течение 24 часов.
<Р> Для анализа инвазии клеток, клетки высевали в базальную мембрану матрица присутствует во вставке культурального планшета 24-луночного (матрица EC, Хемикон, Temecula, CA) и фетальной бычьей сыворотки добавляли в нижнюю камеру в качестве хемоаттрактанту. После того, как еще 48 часов, не связанные с вторгшиеся клетки и матрицы EC были осторожно удаляют с помощью ватного тампона. Инвазивные клетки, расположенные на нижней стороне камеры окрашивали кристаллическим фиолетовым, подсчитываются и образ.
Colony Формирование анализа
Апоптоз Анализ
<р> апоптотических клеток оценивали с помощью аннексина V-FITC и пропиди иод окрашивающим (BD, США ) и анализировали с помощью FACS-Calibur инструмент (BD, США). Собранные данные были проанализированы с помощью FlowJosoftware.
Мышь модели ксенотрансплантата
<р> Желудочный модель рака у голых мышей была построена, как описано ранее [25]. Для того, чтобы оценить роль микроРНК-26а в образовании опухолей, SGC-7901 клетки, инфицированные микроРНК-26а или скремблирования вирусов размножали и высевали подкожно в спинных флангах голых мышей (5 в каждой группе). Размер опухоли измеряли каждые 5 дней. Через 30 дней мышей забивали, Вскрытие были выполнены и опухоли взвешивали. Объемы опухолей были определены в соответствии со следующей формулой: A × B 2/2, где А представляет собой наибольший диаметр и В представляет собой диаметр перпендикулярно к A. Для анализа эффекта микроРНК-26а находится на метастазирование опухоли, СГК-7901 клетки, инфицированные с микроРНК-26a или скремблирования вирусы вводили в хвостовую вену голых мышей (6 в каждой группе). Через 45 дней, были выполнены Вскрытие. Числа микрометастазов в легких на HE-окрашенных участок в отдельных мышей были проанализированы с помощью наблюдения морфологии. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по защите животных научно-исследовательского Гуанчжоу медицинского университета по. Стандартные рекомендации по уходу за животными и лабораторные следовали.
Статистический анализ
<р> Сравнения между группами анализировали с помощью t-
теста и х 2 теста. В целом кривые выживаемости и безрецидивного кривые построены с использованием метода Каплана-Мейера, с помощью теста лог-ранга применяется для сравнения. Выживание было измерено со дня операции. Переменные со значением P
&л; 0,05 в соответствии с однофакторного анализа были использованы в последующем многомерном анализе на основе модели пропорциональных рисков Кокса. Результаты теста корреляции Спирмена были использованы для оценки экспрессии парный корреляции между микроРНК-26а и FGF9 в GC тканях. Все различия были статистически значимыми на уровне P
≤0.05. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS15.0.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
QRT-PCR измеряли уровни экспрессии микроРНК-26а в SGC-7901 и AGS клетки, инфицированные микроРНК-26а лентивирусов, а также ГЭС-1 клеток, трансфицированных с ингибиторами микроРНК-26а
DOI:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
Рисунок S2.
QRT-PCR измеряли уровни экспрессии микроРНК-26а опухолевых тканей, извлеченных из голых мышей на 30-й день после инъекции раковых клеток. Все данные представлены в виде среднего значения ± s.e.m
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Таблица S1.
Целевые гены, которые были предсказаны всеми тремя алгоритмами (TargetScan, Pictar и Миранда)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
Таблица S2.
Характеристика больных раком желудка
DOI: 10.1371. /journal.pone.0072662.s004
(DOC)
<р> Мы благодарим J Ма и CK Ван за их технической помощи.
Микробы кишечника могут быть связаны с депрессией
Болезнь Крона
Чистящие средства могут повысить риск детской астмы - результаты исследования
Распространение супербактерии E. coli из-за плохой гигиены туалета,
Дети имеют иммунитет к SARS-CoV-2
Стратегия готовности педиатрической медицинской помощи ко второй волне пандемии COVID-19
Микробиом спермы выявлен с помощью секвенирования РНК
Новое исследование сообщает о первом подробном описании микробиома спермы человека. с использованием новейших методов секвенирования РНК, которые позволяют различать РНК сперматозоидов и РНК бактериал
Исследование связывает потребление ферментированных овощей с низкой смертностью от COVID-19
Новое интригующее исследование, проведенное европейскими исследователями, предполагает, что показатели смертности от коронавируса 2019 года (COVID-19), вероятно, будут ниже в странах, где диеты богаты
Водородное дыхание исходит не с атолла Бикини
В эти дни со всеми глупыми разговорами о ядерной войне, когда вы видите слово «водород», вы можете сразу подумать об этом бедном маленьком острове в Тихом океане, Атолл Бикини, где они испытали все эт