PLoS One: miR-26a gátolja a tumor növekedés és anyagcsere által célzás FGF9 gyomorrákban

absztrakt katalógusa

A szerepe a miR-26a ráksejtekben tűnt ellentmondásos a korábbi vizsgálatokban. Eddig a szerepét a miR-26a gyomorrákban nem ismerik. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-26a erősen downregulált a gyomorrák (GC) szövetekben és sejtvonalakban, és expresszióját szinttel együtt nyirokcsomó-metasztázis és klinikai szakaszban, valamint a teljes túlélés és replase túlélés GC . Azt is megállapították, hogy a méhen kívüli kifejezése miR-26a gátolta GC sejtburjánzás és GC metasztázis in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Mi tovább azonosítottunk egy új mechanizmust a miR-26a elnyomja GC növekedés és áttét. FGF9 vizsgálatok bebizonyították, hogy a közvetlen cél a miR-26a, a iuciferázvizsgáió és western blot. FGF9 túltermelése miR-26a-t expresszáló sejtek megmentésére invázió és a növekedés hibák a miR-26a. Ezen túlmenően, a miR-26a expressziós fordítottan korreláltak FGF9 protein szintjét GC. Mindent összevetve, a mi az adatok azt sugallják, hogy a miR-26a működik, mint egy tumorszuppresszor GC kifejlődésének és progressziójának, és ígéretesnek prognosztikus biomarker és a potenciális terápiás célpont GC.

bevezető hivatkozás: Deng M, Tang Hl, Lu Xh, Liu My, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a gátolja a tumor növekedés és anyagcsere által célzás FGF9 gyomorrákban. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662 katalógusa

Szerkesztő: H. Sunny Sun Intézet Molekuláris Medicina, Taiwan katalógusa

Beérkezett: március 29, 2013; Elfogadva: július 12, 2013; Megjelent: augusztus 28, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Deng és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka ben támogatták a Nature tudományos megalapozása Kína (81101526, 31100936) és Guangzhou Medical College doktor a Start Alapítvány (2012C11). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

miRNS endogén módon expresszált, a kis nem kódoló RNS-ek, amelyek negatívan szabályozzák a génexpressziót által degradációját okozó cél mRNS gátlása a fordítás ezen mRNS-ek, vagy mindkettő [1]. miRNS vegyél részt döntő celluláris folyamatok, mint például a stressz, a fejlesztés, a differenciálás, az apoptózis és proliferáció [2]. Altered miRNS expressziós számoltak be számos rosszindulatú daganatok, beleértve a mell [3], [4], a tüdő [5], a májban [6], a gyomor [7], vastagbél [8], agy [9], leukémia [10], és a limfóma [11]. Egyre több tanulmány bizonyította, hogy miRNS működhet onkogének vagy tumor-csökkentő, és gyakran diszreguláit tumorokban [12], [13]. Ebben a tekintetben, onkogén miRNS gyakran serkentett, míg a tumor-visszaszorító miRNS vannak downregulált tumorokban. Például, let-7 számoltak kell alulexpresszáltak a tüdőrák és a cél az onkogén Ras [14], [15]. Korábban már beszámoltunk, hogy a miR-216b erősen downregulált az orr-garat karcinóma és csökkenti a tumor növekedését célzó KRAS [16]. Ezzel szemben, az onkogén miR-17-92 klaszter miRNS vannak felülszabályozott különböző tumor [17], és erőltetett expressziója ezeknek a miRNS-ek a jól tanulmányozott Eμ-myc transzgén egér modelljében a B-sejtes limfóma drámaian gyorsítja a betegség megjelenését és előrehaladását [18]. Azonban szerepe a miR-26a rákos sejtekben tűnt ellentmondásos, mivel ez egy tumorszuppresszor hepatocelluláris karcinómában [19], a mellrák [20] és orr-garat-karcinóma [21], [22], de egy onkogén in glioma [23 ] és a cholangiocarcinoma [24]. Eddig a szerepét a miR-26 gyomorrákban volt meghatározva. Katalógusa

A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, miR-26a expresszió 40 párosított normál és GC példányok kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR) elemzés . miR-26a találtuk, hogy erősen downregulált GC szövetekben képest, hogy a szomszédos normál gyomor szövetekben. Ez az eredmény alátámasztotta az in situ hibridizáció szöveti microarray álló 126 esetek GC szövetek és 41 esetben a szomszédos normál szövetekben. Emellett csökkent miR-26a-t rossz prognózissal társul, és talán függetlenül megjósolni a teljes túlélés (OS) és replase túlélés (RFS) gyomorrákban. Funkcionális vizsgálatok kimutatták, hogy a miR-26a elnyomott GC sejtnövekedést és metasztázis célzott FGF9. Katalógusa

Eredmények katalógusa

miR-26a downregulált Humán gyomorkarcinóma katalógusa

Egy qRT-PCR módszer, miR-26a szinteket detektáltunk 40 pár gyomorrák szövetek és illesztett szomszédos szövetek, valamint a gyomor-sejtvonalak. Közül 40 beteg gyomorrák, körülbelül 70% (28, 40 beteg) a tumorok kiderült, egy több, mint két-szeres csökkenést miR-26a szint, egy 5,76-szeres csökkenését képest szomszédos normál szövetekben, ami arra utal, hogy a csökkentés miR -26a volt gyakori esemény humán GC (1a ábra). Sőt, miR-26a expresszió csökkent minden gyomor rákos sejtvonalat (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, és a BGC-823), mint a nem-rosszindulatú gyomor sejtvonal GES-1 (ábra 1B). Annak további igazolására, vonatkozó eredmények a biológiai szerepe a miR-26a humán gyomor karcinogenezis, mi alkalmazott in situ hibridizáció, hogy értékelje a miR-26a expresszió 126 GC és 41 nem-tumoros szövetekben szöveti microarray (TMA). Az eredmények azt mutatták, hogy a kifejezés pontszámok a miR-26a szignifikánsan csökkent GC képest normál szövetekben (1C). Ezután meghatároztuk a potenciális klinikopatológiai következményeit megváltozott miR-26a kifejezést. Klinikai minták osztották alacsony expressziója és magas expressziós csoportok alapján miR-26a kifejezés pontszámok nagyobb vagy kisebb, mint a medián. Összhangban a fenti adatok, a 41 teljes normál gyomor mintákat, 35 (85%) volt a magas expresszióját miR-26a. Ezzel szemben a 60% -a (76 126) gyomorrák példányok alacsony volt a negatív kifejezése miR-26a. A 126 számú GC 38 volt negatív nyirokcsomó áttét, és 45% ezek a betegek alacsony negatív kifejezése miR-26a (1. táblázat). Nyolcvan-nyolc beteg volt pozitív nyirokcsomó áttét, és 67% -uk azt mutatta downregulációját vagy elvesztése miR-26a (1. táblázat). Sőt, azt találtuk, alacsony expresszióját miR-26a, 37% -os és 77% -a gyomor tumorok sorolt ​​szakaszban I /II és színpadi III /IV, illetve (1. táblázat). Ezért miR-26a kifejezés fordítottan korrelál a nyirokcsomó metasztázis és a klinikai stádium ( P katalógusa = 0,019 és P katalógusa < 0,001). Azonban a miR-26a nem korrelál az életkorral, nemmel, a sejt differenciálódás vagy invázió mélysége (T stádium). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-26a esetleg kritikus szerepet játszanak a GC metasztázis és progresszióját. Katalógusa

Csökkent miR-26a összefüggést mutat a rossz klinikai prognózisa katalógusa

tovább elemezni jelentőségét miR-26a szempontjából a klinikai prognózis, Kaplan-Meier túlélési analízist beteg teljes túlélés és a visszaesés túlélés. Az eredmények azt mutatták, hogy a betegek alacsony miR-26a kifejezés rövidebb volt a medián OS és az RFS, mint volt a betegek magas miR-26a kifejezés (21,6 hónap vs. 39,0 hónap, P katalógusa < 0,001 OS 15.2 hónap vs . 31,6 hónap, P = 0,002 katalógusa az RFS; 1D ábra). Cox-féle arányos kockázati regresszió-folytassa az egyesület között miR-26a kifejezés és a prognózis. Az egyváltozós elemzés nyirokcsomómetastasis, TNM és miR-26a szint szignifikáns összefüggést az OS és az RFS (2. táblázat, 3). A végső többváltozós modell azt mutatta, hogy az átlagos túlélési időt jelentősen függött nyirokcsomómetastasis, TNM és miR-26a szint (2. táblázat), és a relapszus-mentes túlélési idő volt a nyirokcsomó-metasztázis és miR-26a szint (3. táblázat).

miR-26a Elnyomja GC növekedés és anyagcsere katalógusa

Figyelembe véve a fordított összefüggés miR-26a szintek és metasztázis, mi hatását vizsgálták a miR-26a újra kifejezése a migrációs és behatolás képességeit GC sejtvonalakban. Két GC sejtvonalak (SGC-7901 és AGS) viszonylag alacsony bazális expresszióját miR-26a (1B ábra) fertőzünk vagy miR-26a vagy vezérlő lentivírus, és a kiválasztott 5 mg /l-puromicin két hétig. Továbbá, a sebgyógyulási vizsgálat és transzwell vizsgálattal végeztük. Amint várható volt, overexpressziója miR-26a szignifikánsan csökkentette a sejtek migrációját és invázióját képességek (2A ábra, B; ábra S1).

hatás kimutatása a miR-26a GC növekedés végeztünk GC sejt proliferációs vizsgálati eljárásban. A proliferációs vizsgálati eljárás kimutatta, hogy a méhen kívüli expressziója miR-26a in SGC-7901 és AGS legyengített sejtproliferáció, mint a kontroll sejtek (2C ábra). Sőt, a méhen kívüli miR-26a kifejezés gátolta kolónia képződését képesek lágyagarban (2D ábra). Ezután végezzük sejt apoptózis elemzése és kiderült, hogy a miR-26a túltermelése SGC-7901 által kiváltott sejt-apoptózist (ábra 2E).

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a miR-26a szerepet játszhat a tumorigenezisben segítségével csupasz egér xenograft modellek. Azt találtuk, hogy fokozott expressziója a miR-26a in SGC-7901 sejtek jelentősen elnyomja a tumornövekedést csupasz egerekben (3A ábra; ábra S2). Ezután SGC-7901 fertőzött sejtek vagy a miR-26a vagy ellenőrző lentivirsus injektáltunk a farokvénába csupasz egerek, hogy megvizsgálja a tüdő metasztázis. Amint látható ábra a 3B, jelentősen alacsonyabb számú makroszkopikus tüdő metasztázisok lehetett megfigyelni miR-26a overexpresszáló sejtek, mint a kontroll sejtek. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-26a lehet elnyomni GC növekedés és anyagcsere. Katalógusa

miR-26a közvetlenül célozza, és gátolja FGF9 katalógusa

Ahhoz, hogy megértsük, hogyan miR-26a elnyomja GC növekedés és metasztázis, szoktuk három algoritmus (Targetscan, Pictar és Miranda), hogy segítsen azonosítani a miR-26a célokat humán gyomorrák. Ezek célgének, amelyeket által jósolt mindhárom algoritmusokat (táblázat S1), FGF9 felkeltette a figyelmünket azonnal, mivel szerepet játszik a tumorigenezisben vagy metasztázis [26] - [28]. Klónoztuk a teljes hosszúságú FGF9 3'-UTR egy luciferáz riporter vektor. Iuciferázvizsgáió kiderült, hogy a miR-26a közvetlenül kötődik FGF9 3'-UTR és amellyel jelentősen csökkenthető luciferázaktivitás (4A). Azonban mutáció a vélt miR-26a helyek a 3'-UTR FGF9 megszüntette luciferáz fogékonyság miR-26a (4A). Közvetlenül hatásának felmérésére miR-26a on FGF9 kifejezés végeztünk western blot analízissel. Amint az ábrán látható a 4B, lentivirális indukált ectopiás miR-26a drámaian elnyomta a FGF9 fehérje szint SCG-7901 és AGS sejteket. Továbbá kiütése miR-26a, a transzfekciója anti-miR-26a, a GES-1 sejtek fokozott FGF9 fehérje szint (4B ábra ábra az S1). Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a FGF9 közvetlen downstream célpontja miR-26a GC sejtekben. A fenti eredmények arra ösztönöztek bennünket, hogy vizsgálja meg, hogy a miR-26a elnyomja GC növekedés és anyagcsere révén elnyomja FGF9 kifejezést. Erre a célra, FGF9 újra kifejezve miR-26a-transzfektált SGC-7901 sejteket. Ebben a miR-26a-t expresszáló sejtek újra kifejezése FGF9 megmentette az invázió és a növekedés hibák a miR-26a (4C, D, E). Végül megvizsgáltuk, hogy a miR-26a kifejezés korrelált FGF9 protein szintjét GC. Volt egy fordított korrelációt FGF9 fehérje szintje által jelzett immunhisztokémiai festéssel, és miR-26a expressziós értékelni in situ hibridizációval 126 GC szövetekben TMA fentiekben alkalmazott (4F; Figure1C). Eredményeink azt mutatják, hogy a miR-26a tulajdonságai összhangban tumor szupresszor funkcióval. Az a képesség, hogy modulálja FGF9 szinten megmagyarázhatja, legalábbis részben, hogy miért miR-26a gátolhatja GC növekedés és anyagcsere. Katalógusa

Vita katalógusa

A miR-26a tartozik a miR-26 család, amely tartalmaz egy másik tag miR-26b, mindkettő melyik ház azonos szekvenciát, kivéve a 2 különböző nukleotidok az érett miRNS. miR-26a funkcionális miRNS, amely kiérdemelte a korábbi vizsgálat [29]. Ismeretes, hogy a miR-26a jelentős szerepet játszik a növekedés, fejlődés és a sejtek differenciálódását különböző szövetekben [29]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a miR-26a expressziós rendezetlen számos humán tumorban [19], [22], [24], [30], [31]. Azonban ezek egyike sem tanulmányok kapcsolódik gyomorrák. A jelenlegi tanulmányban használt qRT-PCR és ISH azt mutatják, hogy a miR-26a szintek gyomorrákban szövetekben jelentősen alacsonyabbak voltak, mint a nem tumoros szövetekben. Sőt, a miR-26a-szinttel együtt a klinikai stádium és a jelenléte nyirokcsomóáttétek. Kaplan-Meier túlélési analízis kimutatta, hogy a betegek, akiknek a primer tumorok megjelenik alacsony expressziója miR-26a rövidebb volt OS és az RFS GC. Ezen túlmenően, Cox-féle arányos-veszélyek regressziós elemzése azt mutatta, hogy csökkentett miR-26a tumorokban volt egy erős és független előrejelzője rövidebb OS és az RFS. Alapján tömb adatok azt korábban jeleztük, hogy a kombináció több miRNS hasznosak lehetnek prognosztikai markerek gyomorrák [32], [33]. Továbbá, egyetlen-miRNS, mint például a miR-218, lehet egy prognosztikai indikátor [34]. Azonban ezek a miRNS vizsgálták csak néhány gyomor rákos betegeknél. Itt, a miR-26a hasznos lehet prognosztikus markerként megjósolni túlélés és a visszaesés gyomorrákban. Katalógusa

Ez a tanulmány kimutatta, hogy a méhen kívüli expressziója miR-26a GC sejtek károsodott migráció, invázió, proliferációs és kolónia növekedés valamint indukált apoptózist. Sőt, az in vivo adatok azt mutatják, a miR-26a gátolta a tumor növekedését és a metasztázist. Ezek az in vitro és in vivo adatok jelezték továbbá, hogy a miR-26a működik, mint egy tumorszuppresszor a gyomorrák. Számos tanulmány támasztja alá az eredményeket. Például, ez a miRNS csökken NPC szövetekben, és gyengítik a sejtek növekedését és a tumorgenezis célzásával EZH2 [22]. Hepatocelluláris karcinóma is mutat csökkent kifejeződését miR-26a [19]. Szisztémás beadás ezen miRNS egy egérmodelljében a HCC segítségével adeno-asszociált vírus (AAV) gátlását eredményezi rákos sejtek szaporodását, indukciós a tumor-specifikus apoptózist, és drámai védelmet a betegség progressziója nélkül toxicitást [35]. Azonban a különböző friss tanulmány kimutatta, az onkogén szerepét miR-26a tumorokban, mint a glioma és epevezeték. Huse et al. számolt be, hogy a miR-26a-ben túltermelõdik kiváló minőségű glioma és közvetlenül megcélzott PTEN [23]. Hasonlóképpen, a miR-26a találtuk, hogy túl expresszálódik emberi cholangiocarcinoma szövetekben és elősegítse cholangiocarcinoma növekedés aktiválásával B-katenin [24]. Ezek ellentmondásos eredmények arra utalnak, hogy a szerepe a miR-26a volt esetleg tumor specifikus és nagymértékben függ a célokat a különböző rákos sejteket. Különböző tanulmányok kimutatták, hogy a PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 és ciklin E1 [37] potenciális downstream célgénjeit miR-26a. Ebben a vizsgálatban, FGF9, egy új közvetlen és funkcionális cél miR-26a, ben azonosították GC. FGF9, más néven gliális aktiváló faktor, az egyik a 23 tagja az erősen konzervált FGF család. Mint egy szekretált, glikozilált 26 kDa-os fehérje, azt mitogén hatást gyakorol a különböző sejttípusok [26]. FGF9 kimutatták, hogy szerepet játszik az különböző rákok, például a petefészek-endometrioid adenocarcinoma [26], hepatocelluláris karcinóma [27] és a prosztata-karcinóma [28]. Vizsgálataink során igazoltuk, hogy FGF9 volt közvetlen célpontja a miR-26a GC sejtekben. Annak meghatározására, hogy a miR-26a elnyomja GC növekedés és metasztázis útján elnyomja FGF9 kifejezés, azt találtuk, hogy FGF9 túltermelése lehet megmenteni invázió és a növekedés hibák miR-26a. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-26a gátolja GC növekedés és anyagcsere részben célzott FGF9. Katalógusa

Mindent összevetve, azt figyeltük downregulációját miR-26a a gyomor rákos sejteket, és kimutatták, hogy a miR-26a eljárhat független előrejelzője OS és az RFS. Megállapítottuk továbbá, hogy a miR-26a rendelkezik a potenciát elnyomja GC növekedés és anyagcsere szabályozása által FGF9. Eredményeink arra utalnak, miR-26a funkciók tumorszuppresszorként GC és ígéretesnek prognosztikus biomarker és potenciális terápiás célpont GC. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

a gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1-ben vásárolta a pekingi Institute for Cancer Research (Peking, Kína). A GC sejtvonalak MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, és BGC-823 kaptunk a Kínai Orvostudományi Akadémia Science (Peking, Kína). Ezeket a sejteket 37 ° C-atmoszférában, 5% CO _{2 RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM-ben (GES-1) vagy F12 ( AGS) táptalajban, amely 10% magzati borjúszérummal, penicillinnel és sztreptomicinnel (Gibco BRL, NY, USA). Minden transzfekciókra használt Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)). Katalógusa}

Klinikai minták

Minden szövetminták használhatók a jelen tanulmányban gyűjtöttünk a Hunan tartományi Tumor Kórház (Changsha, Hunan, Kína). Írásos beleegyezését adta az összes vizsgálatban résztvevők. Ez a tanulmány által jóváhagyott Etikai Bizottsága Guangzhou Orvostudományi Egyetem Egészségügyi Hatóság. Gyűjtése és felhasználása a szövetek, majd az eljárásokat, összhangban vannak az etikai normák megfogalmazott Helsinki Nyilatkozat. Katalógusa

A szövetminták 40 gyomorrákos betegek (23 férfi és 17 nő; átlag életkor 59 év; tartomány 40-84 év) alkalmaztunk kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) elemzéssel. Kimetszett rákos szövetekben (tumor) és párosított párosított normál gyomor szövetekben (normál) azonnal vágni, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80 ° C-on, amíg az RNS extrakció.

A szövetet microarray (TMA), amely a 126 GC és 41 szomszédos normál gyomor szövetek, alkalmaztunk az in situ hibridizációs analízissel. A medián életkora gyomorrákos betegek a diagnózis idején 57 év (31-82). A medián követési idő a teljes túlélés (OS) és a relapszus-mentes túlélés (RFS) 22 hónap volt, és 15 hónapig tart. Minden adat 126 GC minták, mint a kor, a nem, a tumor helyén, szövettani grade, invázió mélysége (T szakasz), a klinikai stádium és a nyirokcsomó metasztázis nyerték klinikai és patológiai nyilvántartások és összefoglalt kiegészítő táblázat 2. katalógusa

kvantitatív RT-PCR analízis

Teljes RNS-t kivontuk a sejtekből TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, USA). Reverz transzkripció és QRT-PCR reakciókat végeztünk segítségével qSYBR-zöld PCR készlet (Qiagen, Germantown, USA), és az U6 snRNS alkalmaztunk egy endogén kontroll. Szeres változást határoztuk 2 ^{-ddCt. A Ct frakcionált ciklus számot, amelynél a fluoreszcencia minden minta áthalad a rögzített küszöböt. A ddCt úgy számoltuk, hogy DCT a referencia minta (párosított nem-daganatos szövet sebészeti minták és GES-1 sejt hat gyomorrák sejtvonalak) a DCT minden egyes minta. A szekvenciákat a specifikus primerek miR-26a és U6 snRNS voltak: 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'és 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', ill.}

in situ
hibridizációt és Immunhisztokémia

kimutatása miR-26a in situ hibridizáció felhasználásával DIG-jelölt zárva nukleinsav (LNA) -alapú szonda specifikus miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Denmark) végeztük a gyártó utasításainak és U6 snRNS használunk, mint egy pozitív kontrollként. Brie FL Y, szöveti microarray metszeteket paraffint, proteináz K-val (5 percig 2 ng /ml proteáz K), PBS-sel mostuk, és ezt követően blokkolt endogén peroxidáz aktivitást 3% H _{2 O 2. A hibridizációt végeztünk 52 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át hozzáadása után 50 nm DIG-jelzett LNA szondák, majd egy szigorúságú mosás SSC pufferekben. Blokkolás után (2% juh szérumot és 2 mg /ml BSA-t tartalmazó PBS-ben Tween-20), szobahőmérsékleten, a próba-célpont komplex tettük láthatóvá felhasználásával egy anti-DIG-POD ellenanyagot, és DAB komplex.}

immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, szöveti microarray szakaszok anti-FGF9 antitesttel (santa Cruz, CA, USA). A komplex-ben láthatóvá sztreptavidin /peroxidáz és DAB komplex, és a sejtmag hematoxilinnel ellenfestettük. In situ hibridizációs és az immunhisztokémiai eredményeket pontoztuk által intenzitás (0-4) és a százalékos festődés (0 és 100%). Relatív kifejezést szorzatából intenzitás százalékban. A lemezeket elemeztük két független patológusok. Katalógusa

A rekombináns vektor katalógusa

A rekombináns lenti vírusok tartalmazó miR-26a prekurzor vagy tülekedés szekvenciákat vásárolt SunBio (Sanghaj, Kína). Luciferáz elemzés, a teljes hosszúságú FGF9 3'-UTR-t amplifikáltunk emberi vérből genomiális DNS-t és azután beklónoztuk a downstream régióban egy szentjánosbogár luciferáz kazettát pMIR-Report luciferáz vektor (Ambion, Austin, TX, USA). A megfelelő mutáns konstrukciók, ahol az első hat nukleotid komplementer a miR-26a mag-régióban arra mutáns által irányított mutagenezissel (Stratagene, La Jolla, CA, USA). A konstrukció FGF9-t expresszáló vektorral, FGF9 ORF cDNS-t vásárolt GeneCopeia (Rockville, MD, USA), és szubklónozzuk a eukarióta expressziós vektorba pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

luciferáz riporter vizsgálat katalógusa

miR-26a vagy scramble lencsevírusok és pMIR-3'UTR vektort kotranszfektáljuk HEK-293T sejtekben. Renilla és szentjánosbogár luciferáz aktivitásokat mértük a Dual-Luciferase riporter rendszert (Promega, Madison, WI) 24 órával a transzfekció után. Szentjánosbogár luciferáz aktivitást normalizáltuk Renilla luciferáz expresszióját minden egyes minta. Mindegyik kísérletet három párhuzamosban végeztük.

Western Blot

Western blot végeztük a korábban leírtak szerint [16]. Röviden, a fehérje lizátumokat elválasztottuk 10% SDS-PAGE, és elekt-trophoretically átvittük PVDF (polivinilidén-difluorid) membránra. Ezután a membránt egér antitest ellen anti-FGF9 antitesttel (Santa Cruz, CA, USA), majd HRP-vel (tormaperoxidáz) jelzett kecske-antiegér IgG-t (Santa Cruz, CA, USA), és detektáltuk kemilumineszcenciás. β-aktin használtunk egy fehérje-terhelési kontrollként.

Cell Proliferation Assay

A sejteket 12-lyukú lemezeken a kívánt sejt koncentrációban. Sejtszámokat által becsült tripszines kezelésével a sejteket és a teljesítő elemzés Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) a jelzett időpontokban három példányban.

sejtvándorlásban és invázióban Assay

A sejtmigrációt segítségével vizsgáltuk sebgyógyító vizsgálatokban. Egy mesterséges "seb" jött létre egy összefolyó egysejt-réteg, és fényképeket készítettünk egy invert mikroszkóp alkalmazásával (Olympus, Tokió, Japán) 24 órán keresztül.

sejt inváziós vizsgálati eljárás, sejtet oltunk a bazális membrán mátrix jelen a betétet egy 24-lyukú tenyésztő lemezen (EK mátrix, Chemicon, Temecula, CA), és magzati borjúszérumot adtunk hozzá, az alsó kamrába, mint egy kemoattraktáns. További 48 óra, a nem-sejtek megtámadása és az EK mátrix óvatosan eltávolítani egy vattacsomót. Az invazív sejtek található az alsó oldalán a kamra megfestettük kristályibolya, megszámláltuk és kinyomtatható.

telepképző assay

Hatlyukú lemezekre borította egy réteg 0,6% -os agar közegben kiegészítve 20% borjúembrió-szérumot tartalmaz. A sejteket (1 × 10 ^{4) állítottunk elő 0,3% -os agar és beoltjuk három példányban. Miután a lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on két hétig, a telepeket megszámoltuk.}

Az apoptózis elemzése

A apoptotikus sejteket értékeltük Annexin V-FITC és propidium jódos festéssel (BD, USA ), és elemeztük FACS Calibur eszköz (BD, USA). Az összegyűjtött adatokat elemeztük FlowJosoftware. Katalógusa

Egér xenograft modell katalógusa

A gyomorrák modell nude egerekben írtaknak előtt [25]. Hogy értékelje a szerepe a miR-26a tumor kialakulását, SGC-7901 fertőzött sejtek miR-26a vagy scramble vírusokat szaporítottuk, és szubkután oltottuk be a dorzális szárnyakon csupasz egerek (5 minden csoportban). A tumor méretét mértük minden 5. napon. 30 nap elteltével az egereket leöltük, boncolást végeztünk, és a tumorokat lemértük. A tumor térfogatát szerint határoztuk meg, a következő képlet szerint: a × b ^{2/2, ahol A jelentése a legnagyobb átmérő és B jelentése az átmérője merőleges A. a vizsgálatokig miR-26a hatását a tumor metastasis, SGC-7901 fertőzött sejtek a miR-26a vagy scramble vírusokat injektáltunk a farokvénába csupasz egerek (6 minden csoportban). 45 nap után, boncolást végeztünk. Numbers mikrometasztázisok tüdő per HE-festett szakasz egyes egerek elemeztük morfológia megfigyelése. A kísérleti protokoll hagyta jóvá Animal Research védelmi Bizottságának Guangzhou Orvostudományi Egyetem. Normál állatok gondozása és laboratóriumi irányelveket követtük. Katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

Az összehasonlítást a két csoport között elemeztük az t- katalógusa teszt és x ^{2 teszt. A teljes túlélési görbék és recidívamentességnek görbéket a Kaplan-Meier-módszerrel, a log-rank teszt alkalmazható az összehasonlítás. Túlélési mértük a műtét napján. Változók értéke P katalógusa < 0,05 szerint az egyváltozós elemzésben használták a későbbi többváltozós elemzés alapján a Cox-féle arányos kockázati modellt. Spearman-féle korrelációs tesztet alkalmaztuk, hogy értékelje a páronkénti expresszió közötti korreláció miR-26a és FGF9 GC szövetekben. Minden különbségek statisztikailag szignifikánsak szintjén P
≤0.05. A statisztikai elemzéseket végeztük SPSS15.0 szoftver. Katalógusa}

alátámasztó információk
ábra S1.
qRT-PCR mért a miR-26a expressziós szinteket SGC-7901 és AGS fertőzött sejtek miR-26a lentivírus valamint GES-1 transzfektált sejtek miR-26a-inhibitorok. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone .0072662.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
qRT-PCR mért a miR-26a expressziós szintje a daganatos szövetek kivont nude egerekben a 30. napon a rákos sejtek injekciót. Minden adatot mutatja átlag ± SEM. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s002 katalógusa (TIF) hotelben táblázat S1.
cél gének jósoltak mindhárom algoritmus (Targetscan, Pictar és Miranda). katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s003 katalógusa (XLS) hotelben táblázat S2.
Jellemzői gyomorrákos betegeknél. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s004 katalógusa (DOC) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönjük J Ma és CK Wang azok a technikai segítségnyújtást. katalógusa

• PLoS One: ERCC1 és ERCC2 változatok Tippelje Survival gyomorrákban Patients
• PLoS One: klinikai jelentősége MYT1L gén polimorfizmus kínai betegek Gyomor Cancer