PLoS ONE: Mir-26a sprječava rast tumora i metastaza ciljajući FGF9 u rak želuca

Sažetak pregled

Uloga Mir-26a u stanicama raka kao sporno u prethodnim studijama. Do sada, uloga Mir-26a kod raka želuca ostaje nedefinirana. U ovom istraživanju, otkrili smo da Mir-26a snažno regulirani u rakom želuca (GC) tkiva i staničnih linija, a njegove razine ekspresije su povezane s limfnim čvorovima metastazama i fazi kliničkog ispitivanja, kao i ukupno preživljavanje i replase bez opstanak GC , Također smo otkrili da izvanmaternične izraz Mir-26a inhibirana proliferaciju GC stanica i GC metastaziranje In vitro
i in vivo pregled. Nadalje identificirali novi mehanizam Mir-26a za suzbijanje rasta GC i metastaza. FGF9 je pokazala da se izravna meta Mir-26a, korištenjem Luciferaze i Western blot. FGF9 prekomjerna ekspresija u Mir-26a-izražavanje stanica može spasiti invazije i rasta nedostatke Mir-26a. Osim toga, Mir-26a izraz obrnuto koreliraju s razinama FGF9 proteina u GC. Uzeti zajedno, naši podaci ukazuju da bi Mir-26a djeluje kao supresor tumora u razvoju i progresiji GC, i drži obećanja kao prognostički biomarkera i potencijalni terapijski cilj za GC pregled

Izvor:. Deng M, Tang HL, Lu XH, Liu Moj, Lu Xm, Gu YX, et al. (2013) Mir-26a sprječava rast tumora i metastaza ciljajući FGF9 u rak želuca. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662 pregled

Urednik: H. sunčano Sun, Zavod za molekularnu medicinu, Tajvan pregled

Primljeno: 29. ožujka 2013. godine; Prihvaćeno: 12. srpnja 2013; Objavljeno: 28. kolovoz 2013 pregled

Copyright: © 2013 Deng i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od dotacija iz prirode znanstvenoj zakladi Kine (81101526, 31100936) i Guangzhou Medical College Doktor Početak Foundation (2012C11). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

miRNAs endogeno izraženi, mala nekodirajuće RNA koji negativno reguliraju ekspresiju gena koji uzrokuje razgradnju ciljne mRNA, inhibiciju prijevodu tih mRNA ili oba [1]. miRNAs uzeti dio u ključnom staničnim procesima kao što su reakcija na stres, razvoj, diferencijaciju, apoptozu i proliferacija [2]. Promijenjen Mirni ekspresija je primijećena u brojnim malignih bolesti, uključujući [3] dojke, [4], pluća [5], jetra [6], želuca [7], debelog crijeva [8], mozga [9], leukemije [10] i limfoma [11]. Sve veći broj studija pokazala da miRNAs može funkcionirati kao onkogena ili tumorske smetnji, i oni su često dereguliran u tumorima [12], [13]. U tom pogledu, onkogeni miRNAs često izraženi su, dok se tumorske supresije miRNAs regulirani u tumorima. Na primjer, neka-7 je izvijestila da se underexpressed kod raka pluća i ciljati onkogenih ras [14], [15]. Mi smo ranije izvijestili da je Mir-216B je jako regulirani u nazofarinksa karcinom i slabi rast tumora ciljajući Kraš [16]. Nasuprot tome, onkogeni Mir-17-92 grozd miRNAs izraženi su u različitim tumora [17], a provode ekspresiju tih miRNAs u dobro promatranom Eμ-myc transgeni mišji model limfom B stanica dramatično ubrzava pojavu i progresiju bolesti [18]. Međutim, uloga Mir-26a u stanicama raka kao kontroverzna, jer je tumorski supresor u hepatocelularnog karcinoma [19], raka dojke [20] i nazofarinksa karcinom [21], [22] ali je onkogen u glioma [23 ] i kolangiokarcinom [24]. Do sada, uloga Mir-26 kod raka želuca bila neodređena. Pregled

U ovom istraživanju ispitali smo Mir-26a izraz u 40 paru normalan i GC uzoraka pomoću kvantitativne RT-PCR (QRT-PCR) analiza , Mir-26a je utvrđeno da se čvrsto regulirani na GC tkiva u usporedbi s onom od susjednih normalnih želuca tkiva. Ovaj rezultat je dalje potvrđeno pomoću in situ hibridizacije na mikropoljima tkiva koji se sastoji od 126 slučajeva GC tkiva i 41 slučajeva susjednih normalnog tkiva. Osim toga, smanjena Mir-26a bio je povezan s lošom prognozom i mogu samostalno predvidjeti ukupno preživljenje (OS) i preživljenje replase bez (RFS) u raka želuca. Funkcionalne studije su pokazale da Mir-26a potisnuti rast GC stanica i metastaziranje ciljajući FGF9. Pregled

Rezultati pregled

Mir-26a je regulirani u ljudskoj rak želuca Netlogu

Korištenje QRT-PCR Postupak razine miR-26a otkrivene su u 40 parova želučane tkiva raka i njihove podudaraju u susjedna tkiva, te stanične linije želuca. Među 40 bolesnika s rakom želuca, oko 70% (28 od 40 bolesnika) tumora otkrila više nego dvostruko smanjenje razine Mir-26a, sa 5,76 puta smanjenje u odnosu na susjedna normalna tkiva, što sugerira da je smanjenje MIR -26a je čest događaj u ljudskoj GC (Slika 1A). Osim toga, ekspresija miR-26a je smanjen je u svim želučanim tumorskih staničnih linija (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45 i BGC-823) u usporedbi s nemalignih želuca stanične linije GES-1 (Slika 1B). Kako bi se dodatno potvrdilo rezultate koji se odnose na biološku ulogu Mir-26a u ljudski želudac karcinogeneze, zaposleni smo in situ hibridizacije ocijeniti izraz Mir-26a u 126 GCS i 41 ne-tumorskih tkiva na tkiva mikromatrica (TMAs). Rezultati su pokazali da je izraz rezultate od Mir-26a značajno su smanjeni u GCS u usporedbi s normalnim tkivima (Slika 1C). Dalje, utvrdili smo potencijalne kliničkopatološka implikacije promijenjen Mir-26a izražavanja. Klinička Uzorci su podijeljeni u niskom ekspresijom i visoke ekspresije skupine na temelju Mir-26a ekspresije bodova veća ili manja od medijana. U skladu s gore navedenim podacima, od 41 ukupno normalnih uzoraka želuca, 35 (85%) je imalo visoku ekspresiju Mir-26a. S druge strane, 60% (76 od 126) uzoraka karcinoma želuca imali niske do negativnog izražavanja Mir-26a. Od 126 osoba s GC, 38 su bili negativni na limfnih čvorova metastaze, a 45% tih bolesnika imalo niske do negativnog izražavanja Mir-26a (tablica 1). Osamdeset i osam pacijenata su bili pozitivni na limfnih čvorova metastaze, a 67% njih je pokazao downregulation ili gubitak Mir-26a (Tablica 1). Štoviše, našli smo nisku ekspresiju Mir-26a u 37% i 77% želučanih tumora klasificirane kao pozornicu I /II i faze III /IV, odnosno (tablica 1). Dakle, Mir-26a izraz obrnuto korelira s limfnog čvora metastazama i fazi kliničkog ispitivanja ( P pregled = 0,019 i P izvoznici < 0,001). Međutim, Mir-26a nije bio u korelaciji s dobi, spolu, staničnu diferencijaciju, odnosno dubini invazije (T stadij). Ovi rezultati sugeriraju da je Mir-26a može igrati ključnu ulogu u GC metastazama i napredovanje. Pregled

Smanjena Mir-26a korelira sa slabom kliničkom prognozom Netlogu

Kako bi se dodatno analizirati značaj Mir-26a u smislu kliničkom prognozom, Kaplan-Meier analiza preživljenja provedena je pomoću pacijenta ukupno preživljenje i opstanak relaps-free. Rezultati su pokazali da bolesnici s niskim Mir-26a izražavanja imali kraće medijan OS i RFS nego što je to bolesnici s visokim Mir-26a izražavanja (21,6 mjeseci u odnosu 39,0 mjeseci, P izvoznici < 0.001 za OS, 15.2 mjeseci vs . 31,6 mjeseci, P pregled = 0.002 za RFS Slika 1D). Koristili smo Cox proporcionalnog rizike regresiju kako bi detaljnije analizirali povezanost između ekspresije Mir-26a i prognoze. U univarijatne analize, limfnih čvorova metastaza, TNM stadiju, a razina Mir-26a značajno su povezane s OS i RFS (Tablica 2, 3). Konačni multivarijatni model otkrila je da ukupno vrijeme preživljavanja značajno ovisili o limfnih čvorova metastaza, TNM stadiju, a razina Mir-26a (tablica 2), i recidiva bez vremena preživljavanja učinio na limfnih čvorova metastaza i razine Mir-26a (Tablica 3). pregled

Mir-26a Potiskuje GC rasta i metastaze pregled

Osvrnuvši se na obrnutu korelaciju između razine Mir-26a i metastaza, istražili smo učinak Mir-26a ponovnog izražavanja na migraciju i invaziju sposobnosti GC staničnih linija. Dva GC stanične linije (SGC-7901 i AGS) s relativno niskom bazalnom izražavanja Mir-26a (Slika 1B) su zaražene s bilo Mir-26a ili upravljačkoj lentivirus i izabrani s 5 mg /l puromicina za dva tjedna. Dalje, zacjeljivanje rana test i Transwell® test se izvodi. Kao što se očekivalo, pojačanom ekspresijom Mir-26a značajno je smanjen migraciju stanice i invaziju sposobnosti (slika 2a, b Slika S1). Pregled

Da se pokaže učinak Mir-26a na rast GC, proveli smo GC proliferacije stanica. Proliferaciju pokazali da ektopijska ekspresija Mir-26a u sGC 7901 i AGS oslabljeni proliferaciju stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 2C). Štoviše, ektopično Mir-26a izraz inhibirana kolonija formiranje sposobnosti u mekom agaru (Slika 2D). Mi smo tada izvedena staničnoj apoptozi analizu i otkrio da je Mir-26a pojačanom ekspresijom u SGC-7901 inducirane stanične apoptoze (Slika 2e). pregled

Nadalje, mi smo testirali je li Mir-26a mogao igrati ulogu u nastanku tumora pomoću golih miševa sa stranim tijelom modeli. Otkrili smo da izražajnost Mir-26a u SGC-7901 stanica značajno je smanjen rast tumora kod golih miševa (Slika 3A Slika S2). Zatim, SGC-7901 stanice inficirane s bilo miR-26a i kontrole lentivirsus se ubrizgava u venu repa golih miševa ispitati na metastaze pluća. Kao što je prikazano na slici 3B, znatno manji broj plućnih metastaza makroskopskih moglo se uočiti u miR-26a ekspresijom stanica nego kontrolne stanice. Ovi rezultati pokazuju da je Mir-26a može potisnuti rast GC i metastaza. Pregled

Mir-26a izravno cilja i inhibira FGF9 pregled

Da bi se razumjelo kako je Mir-26a potiskuje rast GC i metastaza, koristili smo tri algoritme (Targetscan, Pictar i Miranda) kako bi se identificirali mir-26a ciljeve u ljudskim želučanog karcinoma. Tih ciljanih gena koji su predviđeni na sva tri algoritama (Tablica S1) FGF9 privukla našu pažnju odmah kao što je implicirano u tumorogenezi ili metastaza [26] - [28]. klonirali smo pune duljine FGF9 3'-UTR u reporterskog vektora. Luciferaza analitički otkrila je da Mir-26a direktno vezan za FGF9 3'-UTR, a kojim se znatno smanjuje aktivnosti luciferaze (slika 4a). Međutim, mutacija potencijalniog miR-26a mjesta u 3'-UTR od FGF9 ukinuta luciferaze odaziv na miR-26a (Slika 4A). Za izravno procijeniti učinak Mir-26a na FGF9 izražavanja, proveli smo Western blot analizom. Kao što se vidi na slici 4B, lentivirusni izazvana ektopično Mir-26a dramatično potiskuje razine FGF9 proteina u SCG-7901 i AGS stanica. Nadalje, obaranje Mir-26a, kroz transfekciju anti-Mir-26a, u GES-1 stanice povišene razine FGF9 proteina (slika 4B Slika S1). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da FGF9 je direktni iza meta za Mir-26a u GC stanicama. Navedeni rezultati potaknuo nas je da ispita da li Mir-26a potiskuje rast GC i metastaziranje kroz suzbijanju izraz FGF9. Za ovu svrhu, FGF9 je ponovno izražena u miR-26a-transfektiranih SGC-7901 stanice. U Mir-26a-izražavanje stanice, ponovo izraz FGF9 spasio invazije i rasta nedostatke Mir-26a (Slika 4c, D, E). Na kraju, mi smo testirali ako Mir-26a izraz koreliraju s razinama FGF9 proteina u GC. Postoji inverzna korelacija između razine FGF9 proteina, naznačeno imunohistokemijske bojenja i miR-26a ekspresija procijeniti pomoću in situ hibridizacije u 126 GC tkivima na TMAs kako se gore (slika 4F; Figure1C). Naši rezultati pokazuju da je Mir-26a ima svojstva u skladu s tumor supresorski funkciju. Sposobnost za moduliranje razine FGF9 moglo objasniti, barem djelomično, zašto Mir-26a može inhibirati rast GC i metastaza. Pregled

Rasprava pregled

Mir-26a pripada Mir-26 obitelji, koje sadrži još jedan član Mir-26b, od kojih su oba vlastite tvrtke identičnu sekvencu sa izuzetkom 2 različita nukleotida u zrelim miRNAs. Mir-26a je funkcionalna Mirna koja je zaslužila prethodnu istragu [29]. Poznato je da je Mir-26a igra značajnu ulogu u rastu, razvoju i diferencijaciji stanica različitih tkiva [29]. Nekoliko je studija pokazalo da miR-26a ekspresija je poremećena u brojnim humanim tumorima [19], [22], [24], [30], [31]. Međutim, niti jedna od tih studija se odnosi na rak želuca. U trenutnoj studiji, koristili smo QRT-PCR i ISH pokazati da su razine Mir-26a u želučanog tkiva raka bile su značajno niže od onih u ne-tumorskih tkiva. Osim toga, razina miR-26a su povezane s fazi kliničkog i prisustvo metastaza u limfnim čvorovima. Kaplan-Meier analiza preživljavanja pokazala je da pacijenti čiji je primarni tumori prikazuje nisku ekspresiju Mir-26a imali kraći OS i RFS u GC. Osim toga, Cox proporcionalnog opasnosti regresijska analiza pokazala je da je smanjen Mir-26a u tumorima bila jaka i neovisna prediktor kraćem OS i RFS. Temelju nizova podataka, ranije objavljeno je da je kombinacija više miRNAs mogu biti korisni kao prognostički markera u želučanom raka [32], [33]. Osim toga, jedan-Mirna, kao Mir-218, može biti prognostički indikator [34]. Međutim, ove miRNAs istražen je u samo nekoliko pacijenata s rakom želuca. Evo, Mir-26a mogu biti korisni kao prognostički biljeg predvidjeti preživljavanje i povraćaj u rak želuca. Pregled

Ovo je istraživanje pokazalo da izvanmaternične izraz Mir-26a u GC stanicama i nagluhe migracije, invazije, proliferaciju i rast kolonija kao i inducirana apoptoza. Nadalje, in vivo podaci pokazuju miR-26a potiskivao rast tumora i metastaza. To in vitro i in vivo podacima u daljnjem naznačeno da miR-26a djeluje kao supresor tumora kod raka želuca. Nekoliko studija podržati naše rezultate. Na primjer, ovaj Mirna smanjena je u NPC tkivima i može prigušiti rast stanica i tumorigenezi ciljajući EZH2 [22]. Hepatocelularni karcinom također pokazuje smanjenu ekspresiju Mir-26a [19]. Sistemska primjena ovog Mirni u mišjem modelu HCC korištenjem adeno-povezani virus (AAV) rezultate inhibicije proliferacije stanica karcinoma, indukciju na tumor specifičnog apoptoze i dramatične zaštita od napredovanja bolesti, bez toksičnosti [35]. Međutim, različite nedavna istraživanja otkrila onkogeni ulogu Mir-26a kod tumora, kao što su gliom i holangiokarcinomom. Huse i sur. izvijestio da je Mir-26a je izraženo u visokovrijedne glioma i izravno se ciljano PTEN [23]. Slično tome, miR-26a nađeno je da je prekomjerno eksprimiran u ljudskim tkivima kolangiokarcinom i za stimulaciju rasta kolangiokarcinom aktiviranjem B-katenina [24]. Ovi kontroverzni rezultati sugeriraju da je uloga Mir-26a je vjerojatno tumor specifične i vrlo je ovisna o svojim ciljevima u različitim stanicama raka. Razne studije su pokazale da PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 i ciklin E1 [37] su potencijalni nizvodno ciljne gene Mir-26a. U ovom istraživanju, FGF9, nova izravna i funkcionalan meta Mir-26a, bio je identificiran u GC. FGF9, također poznat kao faktor za aktiviranje glija, jedan je od 23 članova visoko očuvanih FGF obitelji. Kao izlučeni, glikozilirani 26 kDa protein, ima mitogene učinke na različite tipove stanica [26]. FGF9 Pokazano je da se medjusobno različitih vrsta raka, kao što su ovarija endometrioid adenokarcinoma [26], karcinom [27] i karcinoma prostate [28]. U našim istraživanjima utvrdili smo da FGF9 bio izravan cilj Mir-26a u GC stanicama. Da bi se utvrdilo da li Mir-26a potiskuje rast GC i metastaziranje kroz potiskujući izraz FGF9, otkrili smo da FGF9 pojačana ekspresija može spasiti invazije i rasta nedostatke Mir-26a. Ovi rezultati sugeriraju da je Mir-26a inhibira rast GC i metastaziranje djelomično ciljajući FGF9. Pregled

Sve u svemu, možemo promatrati downregulation Mir-26a u želučanim stanicama raka i pokazala da Mir-26a može djelovati kao nezavisni prediktor OS i RFS. Mi nadalje utvrdio da je Mir-26a posjeduje mogućnost sprečavanja rasta GC i metastaziranje regulira FGF9. Naši rezultati ukazuju Mir-26a djeluje kao supresor tumora u GC i drži obećanja kao prognostički biomarkera i potencijalni terapijski cilj za GC. Pregled

Materijali i metode pregled

Kultura stanica pregled

želučana stanična linija epitelnih stanica GES-1 je kupljen iz Pekinga Instituta za istraživanje raka (Peking, Kina). GC stanične linije MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45 i BGC-823 dobiveni su iz Kineske akademije medicinskih znanosti (Peking, Kina). Stanice su održavane na 37 ° C u atmosferi 5% CO _{2 u RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) ili F12 ( AGS) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, penicilin i streptomicin (Gibco BRL, NY, USA). Sve transfekcije koriste Lipofektaminje 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, SAD)). Pregled}

kliničkim uzorcima

Svi uzorci tkiva koji se koriste u ovom istraživanju prikupljeni su iz Hunan Pokrajinski Tumor bolnica (Changsha, Hunan, Kina). Pismeni informirani pristanak dobiven je od svih sudionika. Ovo istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Guangzhou Medical University Health Authority. Prikupljanje i korištenje tkiva slijedi postupke koji su u skladu s etičkim standardima formuliranih u Helsinškom deklaracijom pregled

Uzorci tkiva od 40 pacijenata oboljelih od raka želuca (23 muških i 17 ženskih;. Srednja dob 59 godina; raspon 40-84 godina) su korišteni za kvantitativnu realnom vremenu PCR QRT-PCR) analizom (. Resected kancerogen tkiva (tumora) i upareni uskladiti normalni želučani tkiva (Normal) se odmah rezati, zamrznuti u tekućem dušiku i čuvaju na -80 ° C do ekstrakcije RNA.

tkiva nizovi (TMAs), koji se sastoji od 126 GCS i 41 susjedne normalne želuca tkiva, korišteni su za in situ hibridizacija analize. Srednja dob bolesnika s rakom želuca pri dijagnozi bila je 57 godina (raspon 31-82). Medijan praćenja vremena za ukupno preživljenje (OS) i recidiva bez preživljavanja (RFS) bio je 22 mjeseci i 15 mjeseci, respektivno. Svi podaci o 126 uzoraka GC, uključujući dob, spol, sijelo tumora, histološki stupanj, dubini invazije (T stadij), kliničke faze i limfnih čvorova metastaze dobiveni su iz kliničkih i patoloških evidencije i sažeti u dopunski tablici 2. pregled

kvantitativni RT-PCR analiza pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica je pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, USA). Reverzna transkripcija i QRT-PCR reakcije provedene su pomoću qSYBR-zelenu PCR (Qiagen, Germantown, USA) i U6 snRNA se koristi kao endogeni kontrolom. Fold promjena je određena kao 2 ^{-ddCt. CT je frakcijska broj ciklusa u kojoj fluorescentni svakog uzorka prolazi fiksnu prag. DdCt je izračunata oduzimanjem DCT referentnog uzorka (uparen non-tumorskog tkiva za uzorke i kirurških GES-1 stanica za šest želučanih tumorskih staničnih linija) iz DCT svakog uzorka. Sekvence specifičnih primera za Mir-26a i U6 snRNA su 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'i 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', redom. Pregled}

in situ hibridizacije i imunohistokemije

Detekcija Mir-26a in situ hibridizacija korištenjem Iskapanje obilježenih zaključana nukleinske kiseline (LNA) based probe specifične za Mir-26a (Exiqon, Vedbaek, Danska) provedena je u skladu s uputama proizvođača i U6 snRNA korištena je kao pozitivna kontrola. Brie fl y, tkiva MicroArray stakalca su deparafmizirani, pomiješa se s proteinazom K (5 min na 2 ug /ml proteaze K), isprana u PBS i blokirane Aktivnost endogene peroksidaze s 3% H _{<2O sub> 2. Hibridizacija je provedena pri 52 ° C preko noći nakon dodatka 50 nM DIG-obilježenih s LNS probe, nakon čega slijedi rigoroznih ispiranjem u SSC pufera. Nakon blokiranja (2% ovčjeg seruma i 2 mg /ml BSA u PBS s Tween-20), na sobnoj temperaturi, što je sonda za ciljanu kompleks je vizualizirana upotrebom anti-DIG-POD protutijela i DAB kompleks. Pregled}

imunohistokemija je provedena na microarray tkiva sekcijama pomoću anti-FGF9 protutijela (Santa Cruz, CA, USA). Kompleks je vidljivo s streptavidin /peroksidaze i DAB kompleksa, a jezgre negativno hematoksilinom. In situ hibridizacije i imunohistokemijski rezultati su pomoću intenziteta (0-4), a postotak bojanje (0 do 100%). Relativna izraz dobiven množenjem intenziteta po postotku. Snimci su analizirani pomoću dva nezavisna patologa. Pregled

rekombinantni vektor pregled

rekombinantne lentivirusi sadrže Mir-26a prekursora ili otimati sekvence su kupljeni od SunBio (Shanghai, Kina). Luciferaze analize, pune duljine FGF9 3'-UTR je pojačan iz humane krvi genomske DNA, a zatim su klonirana u nizvodnom regiju krijesnice kazete za luciferazu u vektoru pMIR-izvješće luciferaze (Ambion, Austin, TX, USA). Odgovarajući mutiram konstrukti, u kojima su prvih šest nukleotida komplementarne miR-26a sjemena-regije su mutirane mjesno usmjerenom mutagenezom (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Konstruirati FGF9 koje eksprimiraju vektor FGF9 ORF cDNA je kupljen od GeneCopeia (Rockville, MD, USA) i subkloniran u eukariotski ekspresijski vektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). Pregled

Test luciferaze pregled

miR-26a ili Scramble lentivirusi i pMIR-3'UTR vektor su ko-transfektirani u HEK-293 stanicama. Renilla luciferaza krijesnice i aktivnosti izmjerene su Dual-Luciferase reporter sustava (Promega, Madison, WI) 24 sata nakon transfekcije. Krijesnice Aktivnost luciferaze je normalizirana na Renilla ekspresiju luciferaze za svaki uzorak. Svaki eksperiment izveden trostruko. Pregled

Western blot pregled

Western blot ispitivanje je provedeno kao što je ranije opisano [16]. Ukratko, proteinske lizati su razdvojeni sa 10% SDS-PAGE, i elektron-trophoretically prenijeti na PVDF (polivinilidenfluorid) membrane. Zatim se membrana se inkubira s mišjim antitijelima anti-FGF9 antitijelom (Santa Cruz, CA, USA), a zatim HRP (peroksidaza iz hrena) -označenim kozjim anti-mišjim IgG (Santa Cruz, CA, USA) i detektiran kemilumiscencijom. β-aktin je korišten kao kontrola protein punjenje. pregled

proliferacije stanica pregled

Stanice su nasađene na 12-jažične ploče željene koncentracije stanica. Brojanje stanica procijenjeni su trypsinizing stanice i obavljanje analize upotrebom Coulter brojača (Beckman Coulter, Fullerton, SAD) u naznačenim vremenskim točkama u tri primjerka. Pregled

Cell migracije i pokusima invazije

migraciju stanica ispitana je pomoću analize za liječenje rana. Umjetna "Rana" je nastao na pritoka staničnog, a fotografije su snimljene koristeći obrnuti mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan) na 24 sata. Pregled

Test invazije stanica, stanice su nasađene na bazalne membrane matrica prisutan u umetka kultura s 24 jažica (matrična EC, Chemicon, Temecula, CA), te fetalnog goveđeg seruma doda se u donje komore kao kemoatraktant. Nakon daljnjih 48 sati, ne-invaziju stanica i matriksa EC nježno su uklonjene pamučnom krpom. Invazivne stanice koje se nalaze na donjoj strani komore su obojene kristalno ljubičasto, broje i snimio. Pregled

Kolonija Formacija Test

Šest i Ploče su prekrivene slojem 0,6% agara u mediju uz dodatak 20% fetalnog goveđeg seruma. Stanice (1 × 10 ^{4) pripremljeni su u 0.3% agara i posađene u triplikatu. Nakon što su ploče inkubirane pri 37 ° C tijekom dva tjedna, prebrojane su kolonije. Pregled}

Apoptoza Analiza pregled

apoptotične stanice su ocijenjeni Annexin V-FITC i propidijevim jodom (bd, USA ) i analizira s FACS Calibur instrumenta (BD, USA). Prikupljeni podaci su analizirani pomoću FlowJosoftware. Pregled

Miš modelu ksenografta pregled

izgrađena Želučana Model rak u golim miševima kao što je ranije opisano [25]. Kako bi se procijenila uloga Mir-26a u formiranju tumora, SGC-7901 stanice zaražene Mir-26a ili otimati virusa su umnožene i inokulirane supkutano u dorzalni bokova golim miševima (5 u svakoj skupini). veličina tumora je izmjerena svakih 5 dana. Nakon 30 dana, miševi su ubijeni nekropsija izvedena i tumori su izvagani. Volumen tumora je određena prema slijedećoj formuli: A × B ^{2/2, gdje je A najvećeg promjera, a B je promjer okomita A. Za ispitivanje učinka Mir-26a-a na tumorske metastaze, SGC-7901 stanice zaražene s miR-26a ili Scramble virusi ubrizgava u venu repa s golim miševima (6 u svakoj skupini). Nakon 45 dana, nekropsija izvodi. Brojevi mikrometastaza u plućima po HE umrljan sekcija u pojedinim miševa analizirane su promatranjem morfologije. Eksperimentalni protokoli su odobreni od strane Odbora Animal Research zaštitu Guangzhou Medicinskom fakultetu Sveučilišta. Slijede Standardni životinja za njegu i laboratorijske smjernice. pregled}

Statistička analiza pregled

Usporedbe između skupina analizirane su t
test i x ^{2 test. Ukupni krivulje preživljavanja i povraćaj bez krivulje su nacrtane pomoću Kaplan-Meier metodi, s log-rank testa primjenjuje za usporedbu. Preživljavanja je mjereno od dana operacije. Varijable s vrijednošću od P izvoznici < 0,05 prema univarijantne analizi su korišteni u kasnijim multivarijatne analize na temelju Cox proporcionalnih rizika modela. Spearman korelacije testovi su korišteni za procjenu u parovima izraz korelaciju između Mir-26a i FGF9 u GC tkiva. Sve razlike su statistički značajne na razini od P
≤0.05. Statistička analiza je provedena pomoću SPSS15.0 softvera. Pregled}

popratne podatke
Slika S1. pregled QRT-PCR izmjerena razina Mir-26a izraz u SGC-7901 i AGS stanice zaražene Mir-26a lentivirus kao GES-1 stanicama zaraženim s inhibitorima Mir-26a pregled doi:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001 pregled (TIF) pregled slika S2. pregled QRT-PCR izmjerena razina Mir-26a ekspresije tumorskog tkiva izdvojene iz golih miševa 30. dan nakon injekcije stanica raka. Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± S.E.M pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002 pregled (TIF) pregled Tablica S1. pregled ciljni geni koje smo predvidjeli sve tri algoritama (Targetscan, Pictar i Miranda) pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003 pregled (XLS) pregled Tablica S2. pregled Karakteristike bolesnika s karcinomom želuca pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s004 pregled (DOC) pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo J Ma i CK Wang za njihovu tehničku pomoć. pregled

• PLoS ONE: ERCC1 i ERCC2 Varijante prediktori preživljenja u rak želuca Patients
• PLoS ONE: Klinički značaj MYT1L polimorfizama gena u kineskim bolesnika sa želučanim Cancer