PLOS ONE: miR-26a suprime o crescimento de tumores e metástases por Segmentação FGF9 em gástrica Cancer

Abstract

O papel do miR-26a em células cancerosas parecia controversa em estudos anteriores. Até agora, o papel de miR-26a no cancro gástrico permanece indefinida. Neste estudo, descobrimos que miR-26a foi fortemente reprimidos no câncer gástrico (GC) A tecidos e linhas celulares, e os seus níveis de expressão foram associados com metástases em linfonodos e estadiamento clínico, bem como a sobrevida global ea sobrevida livre de replase de GC . Também descobriram que a expressão ectópica de miR-26a inibiu a proliferação de células GC e GC metástase in vitro
e in vivo
. Nós ainda identificado um novo mecanismo de miR-26a para suprimir o crescimento e a metástase de GC. FGF9 foi provado ser um alvo directo de miR-26a, utilizando o ensaio de luciferase e Western blot. FGF9 superexpressão de miR-expressando-26a células poderiam resgatar invasão e crescimento defeitos de miR-26a. Além disso, a expressão de miR-26a inversamente correlacionada com os níveis de proteína FGF9 em GC. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que as funções de miR-26a como um supressor tumoral no desenvolvimento de GC e progressão, e tem a promessa como um biomarcador prognóstico e alvo terapêutico potencial para GC

Citation:. Deng M, Tang Hl, Lu Xh, Liu meu, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a suprime o crescimento de tumores e metástases por Segmentação FGF9 no câncer gástrico. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662

editor: H. ensolarado Sun, Instituto de Medicina Molecular, Taiwan

Recebido: 29 de março de 2013; Aceito: 12 de julho de 2013; Publicação: 28 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Fundação Científica Nature of China (81101526, 31100936) e Guangzhou Medical College Doctor Iniciar Foundation (2012C11). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

miARNs estão endogenamente expressos, pequenos RNAs não codificantes que regulam negativamente a expressão do gene, causando a degradação do ARNm alvo, a inibição da tradução de ARNm ou ambos estes [1]. miARNs tomar uma parte em processos celulares importantes, tais como a resposta de stress, o desenvolvimento, diferenciação, apoptose, proliferação e [2]. expressão miARN Altered tem sido relatado em numerosas doenças malignas, incluindo cancro da mama [3], [4], do pulmão [5], fígado [6], estômago [7], do cólon [8], cérebro [9], leucemia [10], e linfoma [11]. Um crescente número de estudos demonstraram que miARN pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumores, e são frequentemente desreguladas em tumores [12], [13]. A este respeito, miARNs oncogénicos são frequentemente regulados positivamente, ao passo que miARNs-supressora de tumor são regulados negativamente em tumores. Por exemplo, deixe-7 tem sido relatada a ser underexpressed no câncer de pulmão e para atingir o oncogénica Ras [14], [15]. Nós relatado anteriormente que o miR-216b é fortemente regulada negativamente no carcinoma da nasofaringe e atenua o crescimento do tumor por segmentação KRAS [16]. Em contraste, o miR-17-92 aglomerado oncogénica de miARNs são regulados positivamente em uma variedade de tumores [17], e executada expressão destes miARNs no modelo de ratinho bem estudado Eμ-myc transgénica de linfoma de células B acelera dramaticamente o início da doença e progressão [18]. No entanto, o papel de miR-26a em células cancerosas parecia controversa, uma vez que é um supressor tumoral no carcinoma hepatocelular [19], o cancro da mama [20] e carcinoma nasofaríngeo [21], [22], mas é um oncogene em glioma [23 ] e cholangiocarcinoma [24]. Até agora, o papel de miR-26 no câncer gástrico foi indefinido.

No presente estudo, examinamos a expressão de miR-26a em 40 emparelhado espécimes normais e GC por RT-PCR quantitativo de análise (qRT-PCR) . miR-26a foi encontrado para ser fortemente regulados negativamente em tecidos de GC, em comparação com a de tecidos adjacentes normais do estômago. Este resultado foi ainda confirmado por hibridação in situ em Tissue microarrays que consistem em 126 casos de tecidos de GC e 41 casos de tecidos normais adjacentes. Além disso, diminuiu miR-26a foi associada com mau prognóstico e pode prever de forma independente a sobrevida global (OS) e sobrevida livre de replase (RFS) no câncer gástrico. Estudos funcionais revelaram que miR-26a suprimiu o crescimento de células GC e metástase alvejando FGF9.

Resultados

miR-26a é regulada negativamente em Câncer gástrico humano

Usando um qRT-PCR método, os níveis de miR-26a foram detectados em 40 pares de tecidos gástricas cancerosas e seus tecidos adjacentes correspondentes, bem como linhas de células gástricas. Entre os 40 pacientes com cancro gástrico, cerca de 70% (28 dos 40 doentes) de tumores revelou uma redução de mais de duas vezes nos níveis de miR-26a, com uma redução de 5,76 vezes em relação aos tecidos normais adjacentes, o que sugere que a redução do miR -26 foi um acontecimento frequente em GC humana (Figura 1A). Além disso, a expressão de miR-26a foi reduzida em todas as linhas celulares de cancro gástrico (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, e BGC-823), em comparação com a linha celular gástrica nonmalignant GES-1 (Figura 1B). Para comprovar os resultados relativos ao papel biológico de miR-26a na carcinogênese gástrica humana, foram empregados hibridização in situ para avaliar a expressão de miR-26a em 126 GCs e 41 tecidos não tumorais em microarrays de tecido (TMAs). Os resultados revelaram que as pontuações de miR-26a expressão foram significativamente menores no GC em comparação com tecidos normais (Figura 1C). Em seguida, determinou-se as potenciais implicações clínico-patológicas de expressão de miR-26a alterada. As amostras clínicas foram divididos em baixa expressão e grupos de expressão elevados com base em pontuações de expressão de miR-26a maiores ou menores do que a média. Consistente com os dados acima, das 41 amostras no total do estômago normais, 35 (85%) teve alta expressão de miR-26a. Em contraste, 60% (76 de 126) dos espécimes de carcinoma gástrico tinha baixa a expressão negativa de miR-26a. Dos 126 indivíduos com GC, 38 foram negativas para metástase ganglionar, e 45% desses pacientes tiveram baixa a expressão negativa de miR-26a (Tabela 1). Oitenta e oito pacientes foram positivos para metástase ganglionar, e 67% deles mostraram regulação baixa ou perda de miR-26a (Tabela 1). Além disso, encontramos baixa expressão de miR-26a em 37% e 77% dos tumores gástricos classificados como fase I /II e fase III /IV, respectivamente (Tabela 1). Portanto, a expressão de miR-26a correlaciona inversamente com metástases em linfonodos e estadiamento clínico ( P
= 0,019 e P Art < 0,001, respectivamente). No entanto, miR-26a não se correlacionou com a idade, o sexo, a diferenciação celular, ou a profundidade de invasão (estádio T). Estes resultados sugerem que o miR-26a pode desempenhar um papel crítico na metástase GC e progressão.

Diminuição miR-26a correlaciona-se com mau prognóstico clínico

Para analisar melhor o significado de miR-26a em termos de prognóstico clínico, análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada utilizando a sobrevida global paciente e sobrevida livre de recaída. Os resultados demonstraram que os pacientes com baixa expressão de miR-26a teve mais curto OS mediana e RFS do que os pacientes com alta expressão de miR-26a (21,6 meses versus 39,0 meses, P Art < 0,001 para OS; 15,2 meses versus . 31,6 meses, P
= 0,002 para a RFS; Figura 1D). Usamos Cox de riscos proporcionais de regressão para avaliar ainda mais a associação entre a expressão de miR-26a e prognóstico. Na análise univariada, metástase linfonodal, estadiamento TNM, e os níveis de miR-26a foram significativamente associados com o sistema operacional e RFS (Tabela 2, 3). O modelo multivariado final revelou que o tempo de sobrevida global significativamente dependia de metástase linfática, estágio TNM, e os níveis de miR-26a (Tabela 2), e o tempo de sobrevivência de recidiva livre fez em metástase linfática e os níveis de miR-26a (Tabela 3).

miR-26a suprime o crescimento GC e metástase

Observando a correlação inversa entre os níveis de miR-26a e metástase, nós investigamos o efeito de miR-26a re-expressão das habilidades de migração e invasão de linhas celulares de CG. Duas linhas de células GC (SGC-7901 e AGS) com relativamente baixa expressão basal de miR-26a (Figura 1B) foram infectadas com a miR-26a ou lentivírus controle e selecionada com 5 mg /l puromicina por duas semanas. Em seguida, a cicatrização de feridas e ensaio de ensaio Transwell foram realizadas. Como esperado, a sobre-expressão de miR-26a suprimiu significativamente a migração de células e capacidades de invasão (Figura 2A, B; Figura S1).

Para demonstrar o efeito de miR-26a sobre o crescimento de GC, foi realizado ensaio de proliferação celular de GC. O ensaio de proliferação mostraram que a expressão ectópica de miR-26a em SGC-7901 e AGS atenuado a proliferação celular em comparação com células de controlo (Figura 2C). Além disso, ectópica expressão de miR-26a inibida capacidade formação de colónias em agar mole (Figura 2D). Em seguida, realizada a análise de apoptose de células e revelou que o miR-26a sobreexpressão em SGC-7901 apoptose celular induzida (Figura 2E).

Em seguida, testámos se o miR-26a poderia desempenhar um papel na tumorigénese através da utilização de xenoenxerto de ratinho nu modelos. Verificou-se que a sobre-expressão de miR-26a em células SGC-7901 suprimiu significativamente o crescimento do tumor em ratinhos nus (Figura 3A; a Figura S2). Em seguida, as células SGC-7901 infectadas com miR-26a ou controlo lentivirsus foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus para examinar a metástase pulmonar. Como mostrado na Figura 3B, um número significativamente menor de metástases pulmonares macroscópicas poderia ser observada em miR-26a células do que as células que sobre-expressam de controlo. Estes resultados indicam que o miR-26a pode reprimir o crescimento GC e metástase.

miR-26a Diretamente Metas e inibe FGF9

Para entender como miR-26a suprime o crescimento GC e metástase, foram utilizados três algoritmos (TargetScan, PicTar e Miranda) para ajudar a identificar alvos de miR-26a em cancros gástricos humanos. Destes genes alvo que foram previstos por todas as três algoritmos (Tabela S1), FGF9 chamou nossa atenção imediatamente, uma vez que tem sido implicada em tumorigénese ou metástase [26] - [28]. Nós clonado a FGF9 de comprimento completo 3'-UTR num vector repórter de luciferase. ensaio de luciferase revelou que o miR-26a directamente ligado a FGF9 3'-UTR, e através do qual ele notavelmente reduzida actividades da luciferase (Figura 4A). No entanto, a mutação dos locais de miR-26a putativos na 3'-UTR de FGF9 revogada capacidade de resposta da luciferase para miR-26a (Figura 4A). Para avaliar directamente o efeito de miR-26a sobre a expressão FGF9, foi realizada a análise de mancha ocidental. Como pode ser visto na Figura 4B, lentiviral induzida ectópica miR-26a suprimida drasticamente os níveis de proteína FGF9 em SCG-7901 e células AGS. Além disso, knockdown de miR-26a, através de transfecção de anti-miR-26a, em GES-1 células aumento dos níveis de proteína FGF9 (Figura 4B; Figura S1). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que FGF9 é um alvo a jusante directa para miR-26a em células de GC. Os resultados acima levaram-nos a examinar se miR-26a suprime o crescimento GC e metástases através de reprimir a expressão FGF9. Para este efeito, FGF9 foi re-expressos em células de SGC-7901 miR-26a-transfectadas. Em miR-expressando células-26a, re-expressão de FGF9 resgatado os defeitos invasão e crescimento de miR-26a (Figura 4C, D, E). Finalmente, testamos se a expressão de miR-26a correlacionada com os níveis de proteína FGF9 em GC. Houve uma correlação inversa entre os níveis de proteína FGF9, indicada por uma coloração imuno-histoquímica e expressão de miR-26a avaliadas por hibridização in situ em tecidos de 126 GC em TMA, como utilizado acima (Figura 4F; Figure1C). Nossos resultados demonstram que o miR-26a tem propriedades consistentes com a função supressora de tumor. A capacidade de modular os níveis de FGF9 pode explicar, pelo menos em parte, porque o miR-26a pode inibir o crescimento e a metástase de GC.

Discussão

miR-26a pertence à família de miR-26, que contém um outro membro do miR-26b, ambos os quais abrigar sequência idêntica com a excepção de 2 nucleótidos diferentes na miARNs maduros. miR-26a é um miRNA funcional que tem merecido inquérito anterior [29]. Sabe-se que o miR-26a desempenha um papel significativo no crescimento, desenvolvimento e diferenciação de células de tecidos diferentes [29]. Vários estudos têm demonstrado que a expressão de miR-26a está desordenada num certo número de tumores humanos [19], [22], [24], [30], [31]. No entanto, nenhum desses estudos está relacionada com o cancro gástrico. No presente estudo, utilizou-se qRT-PCR e ISH para mostrar que os níveis de miR-26a em tecidos de cancro gástrico foram significativamente mais baixos do que aqueles nos tecidos não tumorais. Além disso, os níveis de miR-26a foram associados com o estágio clínico ea presença de metástases linfáticas. Kaplan-Meier análise de sobrevivência revelou que os pacientes cujos tumores primários exibido baixa expressão de miR-26a tinha um sistema operacional mais curto e RFS no GC. Além disso, a análise de Cox de riscos proporcionais de regressão mostrou que reduziu miR-26a nos tumores foi um preditor forte e independente de menor OS e RFS. Com base em dados de matriz, foi anteriormente relatado que uma combinação de vários miARNs podem ser úteis como marcadores de prognóstico no cancro gástrico [32], [33]. Além disso, um único miARN, tais como o miR-218, pode ser um indicador de prognóstico [34]. No entanto, estes miARNs têm sido investigados em apenas alguns doentes com cancro gástrico. Aqui, miR-26a pode ser útil como um marcador de prognóstico para prever a sobrevida e recaída no câncer gástrico.

Este estudo mostrou que a expressão ectópica de miR-26a em células GC prejudicada migração, invasão, proliferação e crescimento da colônia como bem como a apoptose induzida. Além disso, os dados in vivo demonstraram miR-26a inibiu o crescimento de tumores e metástases. Estes resultados in vitro e in vivo em dados indicou ainda que as funções de miR-26a como um supressor tumoral no cancro gástrico. Vários estudos apoiar os nossos resultados. Por exemplo, este miARN é diminuída em tecidos NPC e pode atenuar o crescimento celular e a tumorigénese, visando EZH2 [22]. carcinoma hepatocelular também apresenta redução da expressão de miR-26a [19]. A administração sistémica desta miARN num modelo de ratinho de carcinoma hepatocelular utilizando um vírus adeno-associado (AAV), resulta na inibição da proliferação de células de cancro, indução de apoptose específica de tumores, e protecção dramática da progressão da doença sem toxicidade [35]. No entanto, vários estudos recentes revelaram o papel oncogênico de miR-26a em tumores tais como gliomas e colangiocarcinoma. Huse et ai. informou que o miR-26a foi sobre-expresso em glioma de alto grau e directamente visados ​​PTEN [23]. Da mesma forma, miR-26a foi encontrado para ser sobre-expresso em tecidos colangiocarcinoma humanos e promover o crescimento cholangiocarcinoma ativando B-catenin [24]. Estes resultados controversos sugerido que o papel de miR-26a foi possivelmente tumor específico e altamente dependente dos seus alvos em diferentes células cancerosas. Vários estudos têm mostrado que PTEN [23], EZH2 [21], [22], Smad1 [36], CDK6 e ciclina E1 [37] são potenciais genes alvo a jusante de miR-26a. Neste estudo, FGF9, um novo alvo directo e funcional de miR-26a, foi identificada em GC. FGF9, também conhecido como factor de activação glial, é um dos 23 membros da família FGF altamente conservada. Como segregada, a proteína glicosilada 26 kDa, que tem efeitos mitogénicos sobre uma variedade de tipos de células diferentes [26]. FGF9 tem sido mostrado a ser implicado em diversos cancros, tais como adenocarcinoma do ovário endometrióide [26], o carcinoma hepatocelular [27] e do carcinoma da próstata [28]. Em nossos estudos, confirmou que FGF9 era um alvo direto de miR-26a em células GC. Para determinar se o miR-26a suprime o crescimento GC e metástases através de reprimir a expressão FGF9, descobrimos que FGF9 superexpressão poderia resgatar invasão e crescimento defeitos de miR-26a. Estes resultados sugerem que miR-26a inibe o crescimento GC e metástase em parte, visando FGF9.

Em conjunto, observou-se a regulação baixa de miR-26a em células cancerosas gástricas e demonstraram que o miR-26a pode agir como um preditor independente de OS e RFS. Descobrimos ainda que o miR-26a possui a potência para suprimir o crescimento de GC e metástases através da regulação FGF9. Nossos resultados sugerem funções miR-26a como um supressor de tumor no GC e tem a promessa como um biomarcador prognóstico e alvo terapêutico potencial para o GC.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

a linha de células epiteliais gástricas GES-1 foi comprado de Pequim Instituto de Investigação do Cancro (Pequim, China). As linhas de células GC MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, e BGC-823 foram obtidas a partir da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Pequim, China). Estas células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO _{2 em meio RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), meio DMEM (GES-1) ou F12 ( AGS) meio suplementado com soro fetal bovino a 10%, penicilina e estreptomicina (Gibco BRL, Nova Iorque, EUA). Todas as transfecções usados ​​Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, EUA)).}

amostras clínicas

Todas as amostras de tecido utilizados no presente estudo foram coletados a partir do Hunan Provincial Tumor Hospital (Changsha, Hunan, China). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Guangzhou University Medical Health Authority de Ética. A recolha e utilização de tecidos seguido os procedimentos que estão em conformidade com as normas éticas formuladas na Declaração de Helsinki

As amostras de tecido de 40 pacientes com câncer gástrico (23 do sexo masculino e 17 do sexo feminino;. Mediana de idade de 59 anos; intervalo 40-84 anos) foram usadas para PCR análise quantitativa em tempo real (qRT-PCR). ressecados tecidos cancerosos (tumor) e tecidos gástricos normais emparelhadas combinados (normal) foram imediatamente cortada, congelado em azoto líquido, e guardou-se a -80 ° C até à extracção do ARN.

As micromatrizes de tecidos (TMA), que consiste em 126 GCs e 41 tecidos do estômago normais adjacentes, foram utilizados para hibridização in situ. A idade média dos pacientes com câncer gástrico no momento do diagnóstico foi de 57 anos (variação 31-82). O tempo médio de follow-up para a sobrevida global (OS) e sobrevivência de recidiva livre (RFS) foi de 22 meses e 15 meses, respectivamente. Todos os dados de 126 amostras de GC, incluindo idade, sexo, local do tumor, grau histológico, a profundidade de invasão (estádio T), estadiamento clínico e metástases em linfonodos foram obtidas dos registros clínicos e patológicos e resumidos na tabela suplementar 2.

RT-PCR quantitativo Análise

O ARN total foi extraído a partir de células usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, EUA). A transcrição reversa e as reacções de qRT-PCR foram realizadas utilizando um kit de PCR qSYBR-verde (Qiagen, Germantown, EUA) e U6 snRNA foi usado como um controle endógeno. Dobre a mudança foi determinada como 2 ^{-ddCt. A CT é o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência de cada amostra passa o limiar fixo. O DDCT foi calculado subtraindo o DCT da amostra de referência (tecido não-tumoral emparelhado para amostras cirúrgicas e GES-1 de células de seis linhas celulares de cancro gástrico) a partir de o DCT de cada amostra. As sequências dos primers específicos para miR-26a e U6 snRNA foram 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'e 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', respectivamente.}

In situ
hibridação e imunohistoquímica

Detecção de miR-26a por hibridação in situ utilizando a marcada com DIG bloqueado ácido nucleico (LNA) com base na sonda específica para o miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante e U6 snRNA foi usado como um controlo positivo. Brie fl y, lâminas tissue microarray foram desparafinizadas, tratou-se com proteinase K (5 min em 2 ug /ml de protease K), lavadas em PBS e subsequentemente bloqueados actividade da peroxidase endógena com 3% H _{2O 2. A hibridação foi realizada a 52 ° C durante a noite após a adição de 50 nM de sonda marcada com DIG de LNA, seguido de uma lavagem de rigor em SSC tampões. Após o bloqueio (2% de soro de ovelha e de 2 mg /ml de BSA em PBS com Tween-20), à temperatura ambiente, o complexo sonda-alvo foi visualizada utilizando um anticorpo anti-DIG-POD, e complexo DAB.}

a imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecido de microarranjos utilizando anticorpo anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, EUA). O complexo foi visualizado com estreptavidina /peroxidase e complexo DAB, e os núcleos contrastados com hematoxilina. A hibridação in situ e imuno-histoquímica resultados foram pontuados pela intensidade (0-4) e a percentagem de coloração (0 a 100%). A expressão relativa foi obtida multiplicando a intensidade em porcentagem. As lâminas foram analisadas por dois patologistas independentes.

recombinante Vector

lentivírus recombinantes contendo sequências precursoras ou mexidos miR-26a foram adquiridos de SunBio (Xangai, China). Para a análise de luciferase, o FGF9 de comprimento completo 3'-UTR foi amplificado a partir de ADN genómico de sangue humano e, em seguida, clonado da região a jusante de uma cassete de luciferase de pirilampo no vetor PMIR-RELATÓRIO luciferase (Ambion, Austin, TX, EUA). As construções mutantes correspondentes, em que os primeiros seis nucleótidos complementares à das sementes de região de miR-26a foram mutados por mutagénese dirigida ao local (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Para construir o vector que expressa FGF9, ADNc ORF FGF9 foi comprado de GeneCopeia (Rockville, MD, EUA) e subclonado no vector de expressão eucariótica de pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

miR-26a ou lentivírus mexidos e PMIR-3'UTR vector foram co-transfectados em células HEK-293T. Renilla luciferase de pirilampo e actividades foram medidas com o Luciferase Dual-sistema Repórter (Promega, Madison, WI), 24 h após a transfecção. Firefly actividade de luciferase foi normalizada para a expressão de luciferase de Renilla para cada amostra. Cada experiência foi realizada em triplicado.

Western Blot

Western blot foi realizada tal como descrito previamente [16]. Em resumo, os lisados ​​de proteína foram separadas por 10% SDS-PAGE, e elec-trophoretically transferido para PVDF (difluoreto de polivinilideno) membrana. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo de ratinho contra o anticorpo anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, EUA), seguido por HRP (peroxidase de rábano) marcado com IgG de cabra-anti-rato (Santa Cruz, CA, EUA) e detectado por quimiluminescência. β-actina foi utilizado como um controlo de proteína de carregamento.

Ensaio de Proliferação Celular

As células foram plaqueadas em placas de 12 cavidades à razão da concentração de células desejada. As contagens de células foram estimadas por trypsinizing as células e para a análise utilizando um Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, EUA) nos pontos de tempo indicados em triplicado.

A migração celular e invasão Ensaios

migração celular foi examinada utilizando ensaios de cicatrização de feridas. Uma "ferida" artificial foi criado em uma monocamada de células confluentes, e as fotografias foram tiradas com um microscópio invertido (Olympus, Tóquio, Japão) em 24 horas.

Para o ensaio de invasão de células, as células foram semeadas sobre a membrana basal matriz presente na inserção de uma placa de cultura de 24 poços (CE matriz, Chemicon, Temecula, CA) e soro fetal de bovino foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após mais 48 horas, as células não-invasoras e matriz CE foram removidos cuidadosamente com um cotonete. células invasivas localizados no lado inferior da câmara foram coradas com violeta de cristal, contadas e fotografadas.

Ensaio de formação de colónias

placas de seis poços foram cobertos com uma camada de 0,6% de agar em meio de suplementado com soro fetal de bovino a 20%. As células (1 x 10 ^{4) foram preparados em 0,3% de agar e semearam-se em triplicado. Depois as placas foram incubadas a 37 ° C durante duas semanas, as colónias foram contadas.}

Análise de Apoptose

As células apoptóticas foram avaliadas por anexina V-FITC e iodeto de propídio coloração (BD, EUA ) e analisados ​​com um instrumento FACS Calibur (BD, EUA). Os dados coletados foram analisados ​​por meio de FlowJosoftware.

Mouse Xenoenxerto Modelo

O modelo de câncer gástrico em ratos pelados foi construído como descrito anteriormente [25]. Para avaliar o papel de miR-26a na formação de tumores, células SGC-7901 infectadas com vírus de miR-26a ou embaralhar foram propagadas e inoculados subcutaneamente nos flancos dorsais dos ratinhos nus (5 em cada grupo). O tamanho do tumor foi medida a cada 5 dias. Após 30 dias, os ratinhos foram mortos, foram necropsiados e os tumores foram pesados. Os volumes dos tumores foram determinados de acordo com a seguinte fórmula: A x B ^{2/2, em que A representa o diâmetro maior e B é o diâmetro perpendicular ao A. Para ensaiar o efeito do miR-26a em metástase tumoral, células infectadas SGC-7901 com vírus miR-26a ou embaralhar foram injectados na veia da cauda de ratos sem pêlo (6 em ​​cada grupo). Após 45 dias, foram realizadas necropsias. Números de micrometástases em pulmão por coradas com HE secção em ratinhos individuais foram analisadas por observação da morfologia. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal Protecção da University Medical Guangzhou. diretrizes padrão de cuidados de animais e de laboratório foram seguidas.}

Análise Estatística

As comparações entre os grupos foram analisadas pelo t-
de teste e x ^{2 de teste. As curvas de sobrevida global e curvas livres de recidiva foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier, com o teste de log-rank aplicado para comparação. A sobrevivência foi medido a partir do dia da cirurgia. As variáveis ​​com um valor de P Art < 0,05 de acordo com a análise univariada foram utilizados na análise multivariada subsequente com base no modelo de riscos proporcionais de Cox. testes de correlação de Spearman foram utilizados para avaliar a correlação expressão de pares entre miR-26a e FGF9 em tecidos GC. Todas as diferenças foram estatisticamente significativas ao nível do P
≤0.05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS15.0.}

Informações de Apoio
Figura S1.
qRT-PCR medidos os níveis de expressão de miR-26a em SGC-7901 e de células infectadas com lentivírus AGS miR-26a, assim como células GES-1 transfectadas com inibidores de miR-26a
doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
Figura S2.
qRT-PCR mediram os níveis de expressão de miR-26a de tecidos tumorais extraídas de ratos pelados no 30º dia após a injeção de células cancerosas. Todos os dados são apresentados como média ± S.E.M
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Tabela S1. genes
destino que foram previstos por todos os três algoritmos (TargetScan, PicTar e Miranda)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
Tabela S2.
Características de pacientes com câncer gástrico
doi: 10.1371. /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos J Ma e Wang CK por sua assistência técnica.

• PLOS ONE: ERCC1 e ERCC2 Variantes prever a sobrevida em pacientes com câncer gástrico
• PLOS ONE: Significado Clínico da MYT1L Gene de polimorfismos em pacientes chineses com câncer gástrico