PLoS ONE: Silencing von Claudin-11 ist mit einem erhöhten Invasivität von Magenkrebs Zellen assoziiert

Abstrakt

Hintergrund

Claudins sind Membranproteine, die eine entscheidende Rolle bei tight junctions (TJ) Bildung und Funktion spielen. Mitglieder der claudin Genfamilie haben gezeigt worden aberrant geregelt werden, und in der Pathogenese von verschiedenen menschlichen Krebsarten teilnehmen. In der vorliegenden Studie berichten wir, dass Claudin-11 ( CLDN11
) in Magenkrebs zum Schweigen gebracht über
hypermethylation seiner Promotorregion.

Methodik /wichtigsten Ergebnisse

Levels von CLDN11
Methylierung und mRNA-Expression in primären Magenkrebs Gewebe, noncancerous Magenschleimhäuten und Zelllinien von Magen Herkunft mittels quantitativer methylierungsspezifische PCR (QMSP) und quantitative reverse Transkriptase-PCR gemessen wurden (qRT-PCR), respectively. Die Analysen der gekoppelten Magenkarzinome und angrenzenden normalen Magengewebe ergab Hyper der CLDN11
Promotorregion in Magenkrebs, und diese Hyper war signifikant mit Herabregulation von CLDN11
Ausdruck vs. korreliert
normalen Geweben. Die CLDN11
Promotorregion wurde auch in allen Magenkrebszelllinien hypermethyliert getestet relativ zu verewigte normalen Magen-Epithelzellen. Außerdem CLDN11
mRNA-Expression wurde umgekehrt mit seiner Methylierungsgrad korreliert. Die Behandlung von CLDN11
-nonexpressing Magenkrebszellen mit 5-Aza-2'-Desoxycytidin restauriert CLDN11
Ausdruck. Außerdem siRNA-vermittelten Knockdown von CLDN11
Expression in normalen Magenepithelzellen erhöht ihre Beweglichkeit und Invasivität.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Diese Daten legen nahe, dass Hypermethylierung von CLDN11
, zu downregulated Ausdruck führt, trägt zu einer Magen-Krebsentstehung durch zelluläre Motilität und Invasivität zu erhöhen. Ein weiteres Verständnis der Mechanismen, die Rolle von Claudin-Proteine ​​im Magen Karzinogenese zugrunde liegen in der Identifizierung neuer wahrscheinlich helfen Ansätze zur Diagnose und Therapie von Magenkrebs

Citation. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et al. (2009) Silencing von Claudin-11 ist mit einem erhöhten Invasivität von Magenkrebszellen in Verbindung gebracht. PLoS ONE 4 (11): E8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002

Editor: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 3. August 2009; Akzeptiert: October 23, 2009; Veröffentlicht: 24. November 2009

© 2009 Agarwal et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von den US-amerikanischen National Institutes of Health gewährt CA085069, CA138677 und CA146799 zu SJ Meltzer unterstützt wurde. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) bleibt die zweite häufigste Todesursache bei Krebserkrankungen weltweit. Es ist eines der tödlichsten Krebserkrankungen und eine führende Ursache von Krebs-Todesfälle in den Entwicklungsländern, mit insgesamt 5-Jahres-Überlebensraten unter 20% [1], [2].

Studien von GCs und ihre präneoplastischen Vorläufer [6] - Läsionen haben mehrere genetische und epigenetische Veränderungen, einschließlich der Mikrosatelliteninstabilität, Punktmutationen und den Verlust der Heterozygotie (LOH) beeinflussen Tumorsuppressorgene (gtS) [3] identifiziert. Dennoch ist der molekularen Pathogenese der GC noch nicht vollständig verstanden.

epigenetischen Veränderungen sind extrem wichtig in der Entwicklung von Krebs und Progression [7]. Transkriptions-Inaktivierung von Tumorsuppressor-Gene über anomale Promotor-Hypermethylierung von CpG-Inseln, was zu dauerhaften Gen-Silencing, ist ein wichtiger epigenetischer Mechanismus der TSG Inaktivierung.

Bisher wurden Untersuchungen auf Promotor-Hypermethylierung in GCs und ihre premalignant Vorläufer veröffentlicht [ ,,,0],8] - [10]. p16INK4A und p15INK4b gehörten zu den ersten Gene hypermethylation in GCs zu zeigen, [11]. Unsere Gruppe und anderen später Hypermethylierung des Gens hMLH1 DNA-Mismatch-Reparatur entdeckt in GCs ausstellenden häufige Mikrosatelliteninstabilität (MSI-H) [12] - [14]. Wir zeigten auch, dass Hypermethylierung des E-Cadherin (CDH1) Gen häufig in GCs auftritt [15].

Ein Pilotmicroarray-basierte genomweite Suche durch unsere Gruppe durchgeführt wird, durchgeführt Roman epigenetisch stillgelegte Gene in entdecken Magen-Karzinogenese, identifiziert Claudin-11 ( CLDN11
), ein tight-Junction (TJ) Protein, als ein potenzielles Ziel von epigenetische Inaktivierung bei Magenkrebs (nicht veröffentlichte Daten).

Claudin-11 gehört zur Familie von Claudin Proteine, die mehr als 23 Mitglieder enthält. Mitglieder der Familie claudin sind in einer hoch gewebespezifischen Art und Weise in einer Vielzahl von normalen und neoplastischen Geweben exprimiert [16]. Claudins sind Transmembranproteine, die eine entscheidende Rolle bei TJ Bildung und Funktion spielen. TJs sind interzellulären Verbindungen entscheidend in den parazellulären Transport von gelösten Stoffen, sowie in Zellpolarität beibehalten wird. Tumorzellen, die gemeinsam zeigen strukturelle und funktionelle Mängel in ihren TJs [17].

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Studien haben gezeigt, abweichenden Expression von Proteinen in verschiedenen Krebsarten Claudin [18], [16]. Einige dieser Studien Dysregulation von Claudin-Protein-Expression über
Promotor-Hypermethylierung. Hypermethylation-induced silencing von Claudin-7-Expression wurde zuvor in der Brust berichtet [19] und kolorektalen [20] Karzinome. Claudin-6 ist auch bei Brustkrebs [21] epigenetisch still, während Claudine -3 und -4 in Eierstockkrebszellen epigenetisch reguliert werden [22], [23].

Die aktuelle Studie identifiziert und Berichte zu unserem Wissen zum ersten Mal, dass die CLDN11
Promotorregion in GC Geweben und Zelllinien hypermethyliert wird. Darüber hinaus, während CLDN11
mRNA wurde in allen primären noncancerous Magenschleimhaut Geweben sowie in einer immortalisierten normalen Magen epithelialen Zellinie exprimiert wird, es in allen GC Geweben und Zelllinien untersucht, zum Schweigen gebracht wurde. Interessanterweise siRNA-vermittelte Herunterregulation von CLDN11
in CLDN11
-exprimierendem Magen-Zellen auch mit Krebs im Zusammenhang mit phänotypischen Veränderungen verbunden war, insbesondere erhöhte Zellmotilität und Invasivität.

Werkstoffe und Methoden

Zelllinien und klinische Gewebeproben

Immortalized normalen menschlichen Magenepithelzellen (HFE145) wurden von Dr. Duane T. Smoot (Howard University) und GC-Zelllinien AGS erhalten, SIIA, MKN28, KatoIII und SNU-1 wurden von ATCC erhalten. Alle Zelllinien wurden kultiviert und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung (Invitrogen).

Gekoppelte primären Magen normalen und Tumorgeweben gehalten an der Johns Hopkins Hospital gesammelt wurden ( J HH). Die Proben wurden schockgefroren unmittelbar nach der Resektion.

Ethik Statement

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) die Zulassung für die Fälle erhalten wurde in die Studie eingeschlossen. Die Fälle wurden von JHU chirurgischen Pathologie unter JHU IRB-genehmigten Freistellung 02-07-19-05e nach Regel erhalten 45 CFR 46,101 (b), die die Anforderungen für den Erhalt der Zustimmung des Patienten verzichtet.

Reinigung und Aufbereitung von genomischer DNA und Gesamt-RNA

Genomic DNA extrahiert wurde aus schockgefroren Gewebeproben oder Zelllinien unter Verwendung eines DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) nach dem Protokoll des Herstellers. Gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagens (Invitrogen) extrahiert. Extrahierter DNA und RNA wurden mit einem Nanodrop ND-1000 quantifiziert Spektralphotometer (Nanodrop, Wilmington, DE).

Quantitative Methylierungsspezifische PCR (QMSP) für Claudin-11

Genomische DNAs von 36 erhalten Patientenproben, umfassend 18 GC und 18 angepaßt noncancerous Magen-Schleimhaut (NS) Geweben sowie aus verschiedenen Magen-Zelllinien, wurden QMSP unterworfen. QMSP wurde wie beschrieben durchgeführt, die zuvor mit geringen Modifikationen [24]. Kurz gesagt, Bisulfit-Behandlung der genomischen DNA wurde durchgeführt, eine EpiTect Bisulfite Treatment Kit (QIAGEN, Valencia, CA) verwendet wird. Eine MSP-Amplikon und TaqMan-Sonde zum Nachweis von methylierter DNA vollständig mehrere CpG-Stellen enthalten entworfen wurden in der 5'-UTR-Bereich von CLDN11
Gen. CLDN11
-spezifische Primer und Sonden-Sequenzen wurden verwendet: Forward-Primer 5 'CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3'; Reverse-Primer 5 'GACGAAAACAACAACGCTACT 3'; TaqMan-Sonde 5'TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 '. CpGenome Universal-methylierter DNA (Chemicon International, Temecula, CA) diente als positive Kontrolle und serielle Verdünnungen davon wurden verwendet, um eine Standardkurve zu zeichnen. QMSP mit TaqMan-Sonde wurden auf einem iQ5 Thermocycler (BioRad, Hercules, CA) unter Verwendung von iQ Supermix durchgeführt ( ibid.
). Fünfzig Zyklen der PCR-Amplifikation mit 50 ng Bisulfit-behandelter genomischer DNA ausgehend wurden dreifach durchgeführt, entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Duplex-PCR mit β-Aktin (ACTB) Primer und Sonden-Sequenzen enthält keine CpG wurden zur Normalisierung durchgeführt. Die Primer- und Sondensequenzen verwendet wurden zuvor wie veröffentlicht [24]. Normierte Methylierungswert (NMV) wurde wie folgt definiert: NMV = ( CLDN11-S
/ CLDN11-FM
) /( ACTB-S
/ ACTB -UP
) * 100, wobei CLDN11-S
und CLDN11-FM
repräsentieren CLDN11
Methylierung Ebenen in der Probe und vollständig methylierten DNA, beziehungsweise, während ACTB-S
und ACTB-FM β-Actin
in der Probe und vollständig methylierten DNAs entsprechen
sind. Whole-Genome amplifizierte DNA (WGA) wurde als nicht-methylierten negative Kontrolle verwendet.

Quantitative Reverse Transkription-PCR-Analyse

Die CLDN11
RT-PCR-Amplikon wurde entwickelt, um überlappen ein Intron-Exon-Grenze, um genomische DNA auszuschließen ( g
DNA) Verstärkung. Primer-Sequenzen wurden wie zuvor veröffentlichten [18]. Ein-Schritt-qRT-PCR wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [24], unter Verwendung eines QuantiTect Sybra RT-PCR-Kit (Qiagen, Valencia, CA) nach dem Protokoll des Herstellers. CLDN11
Ausdruck war normiert auf β
Actin-Expression. Gesamt-RNA aus HFE145 Zellen wurde für die Standardkurve verwendet. ( CLDN11-S
/ CLDN11-C
) /( ACTB-S
/ ACTB-C
), wobei CLDN11- S
und CLDN11-C
repräsentieren CLDN11
mRNA Expression in der Testprobe und Kontrolle mRNAs bzw. während ACTB-S
und ACTB -C
entsprechen β-Actin
Expressionsniveaus in der Testprobe und Kontroll mRNAs, respectively.

5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-dC) Treatment

AGS ist eine Linie GC Zelle manifestiert Hyper der CLDN11
Promotor in Verbindung mit den abwesenden CLDN11
mRNA-Expression. 5-Aza-2'-Desoxycytidin (5-Aza-dC) Behandlung der Zellen wurde wie früher beschrieben durchgeführt [24]. Kurz gesagt, wurde die GC-Zelllinie AGS (ATCC-Katalognummer CRL-1739) mit einer Dichte ausgesät von 2 × 10 ^{5 Zellen /ml in einem T-75-Kolben. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen 72 Stunden lang mit 1 &mgr; M 5-Aza-dC behandelt. Media 5-Aza-dC enthielt, wurde alle 24 Stunden mit frisch hergestelltem Medium ersetzt. Die Zellen wurden dann für die Gesamt-RNA-Extraktion geerntet. Gesamt-RNAs aus AGS-Zellen vor und nach 5-Aza-dC Behandlung quantitative Echtzeit-RT-PCR-Analyse unterzogen wurden.}

small interfering RNA Knockdown Experimente

CLDN11
-spezifische siRNA Oligos wurden von Ambion, Inc. (Austin, TX) erworben. Die HFE145 Zelllinie, die ist CLDN11
positiv, wurde die Wirkung von Claudin-11 Zuschlags auf Migration und Invasion Eigenschaften von Magen-Zellen zu untersuchen ausgewählt. Experimente wurden wie beschrieben durchgeführt, die zuvor (Agarwal et al.
, 2005). Zellen, die in 6-Well-Platten wurden mit siRNA-Duplexe transfiziert unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen), den Anweisungen des Herstellers folgen. Mock-Transfektionen und nicht-spezifische siRNA-Duplexe wurden als negative Kontrollen verwendet. Die Zellen wurden für 48 bis 72 Stunden behandelt maximale Zuschlag zu ermöglichen, nach denen sie entweder für Western-Blot-Analyse geerntet wurden oder für die Migration und Invasion Assays verwendet.

Western-Blot-Analyse von Claudin-11 in Magen-Zelllinien

Konfluente Zellkulturen wurden mit HBSS (Invitrogen) und Ganzzelllysaten gewaschen wurden mit Lysepuffer hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bicinchoninsäure (BCA) Assay-Kit (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Zwanzig Mikrogramm Gesamt-Proteine ​​wurden durch 10% bis 20% SDS-PAGE auf Tris-Glycin-Gelen (Invitrogen) und an Polyvinylidendifluorid-Membranen (Millipore Corp., Bedford, MA) getrennt. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch blockiert, in TBST-Puffer gewaschen und mit einem Anti-claudin-11-Antikörper (Zymed, San Francisco, CA) sondiert. (:; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ 1:10,000 anti-rabbit IgG) Blots wurden dann in Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert und gewaschen. Zur Detektion wurde Chemilumineszenz ausgeführt, um eine verstärkte Chemilumineszenz-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet wird.

Zellinvasion und Migration Assay

Invasivität von siRNA-transfizierten Zellen bestimmt wurde Matrigel beschichtete Invasion Kammer Einsätze mit (24-well-Format mit 8-um-Poren, BD Biosciences) einer modifizierten Boyden-Kammer-Assay unter Verwendung von [25]. Die Zellen wurden auf etwa 80% Konfluenz kultiviert und Serum-ausgehungert über Nacht. Am Tag des Assays wurden die Zellen trypsinisiert und Lebendzellzählungen entnommen. Etwa 50.000 Zellen wurden plattiert auf die Oberseite von jedem der einzelnen Filter in serumfreiem Medium. Ein gleiches Volumen desselben Mediums 20% FCS enthält, in die untere Kammer gegeben wurde ( d.h.
, Die gut unterhalb des Filters) als chemische Lockstoffe wirken. Testplatten wurden bei 37 ° C inkubiert, bis zu 48 Stunden. Zellen, die durch die Poren der Inserts wurden Transwell migrieren oder einzufallen manuell mit einem Baumwolltupfer entfernt nicht. Zellen, die an der Unterseite der Membran wurden in kaltem Methanol für 10 min fixiert und dann mit 0,01% Kristallviolett in 20% igem Ethanol gefärbt. Nach 10 min Inkubation wurden die Filter gründlich in Wasser suspendiert und in 200 ul 5% iger Essigsäure und 5% Methanol gewaschen. Kolorimetrische Messungen wurden bei OD _{595 genommen. Die Experimente wurden wenigstens dreimal wiederholt, mit Triplikaten in jedem Experiment. Zur Beurteilung der Zellmigration, Assays wurden im wesentlichen wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Zellen auf der unbeschichteten (Matrigel frei) fügt ausplattiert.}

Statistical Analysis

Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Student-T durchgeführt -Test (SPSS, Version 16), mit p
. < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet

Ergebnisse und Diskussion

zunächst testeten wir unsere Hypothese, dass die CLDN11
Promotor hypermethyliert und dass diese Hyper korreliert invers mit CLDN11
mRNA-Expression in primären GC Geweben. Gepaart primären Magen normalen und Tumorgewebe wurden an der Johns Hopkins Hospital (J HH) gesammelt. Die Proben wurden unmittelbar nach der Resektion erhalten und schockgefroren bis zur Verwendung. Nur Fälle mit informierte Zustimmung erhalten, wie von der Institutional Review Board (IRB) genehmigt wurden in diesem Projekt. Genomische DNAs wurden aus 36 klinischen Proben erhalten, bestehend aus 18 GC und 18 angepasst noncancerous Magenschleimhaut (NS) Gewebe. CLDN11
Promotor-Methylierung Ebenen in diesen Proben wurden mittels quantitativer Echtzeit-Methylierungs-spezifische PCR (QMSP) analysiert. 1A zeigt die normalisierte Methylierungswert (NMV), d.h.
, Das Verhältnis von methylierter Wert des CLDN11
Promotorregion in jeder Probe in eine vollständig methylierte Kontroll-DNA. CLDN11
NM Vs
in GC Proben waren signifikant höher als in der passenden NS Gewebe ( P
< 0,001). Um zu beurteilen, ob CLDN11
Promotor-Hypermethylierung in GCs verbunden war mit Silencing CLDN11
Ausdruck, CLDN11
mRNA-Spiegel wurden mittels quantitativer Echtzeit gemessen (qRT-PCR) in RNAs, die von den 36 Proben verwendet zur Methylierungsanalyse extrahiert. Wie gezeigt in 1B, normalisierte Expressionswerte (NEVs) von CLDN11
in GC Proben waren deutlich niedriger als in gepaart NS-Proben ( P
< 0,001). Diese Daten fest, dass CLDN11
Promotor-Hypermethylierung korreliert mit verminderter oder zum Schweigen gebracht CLDN11
mRNA-Expression in primären GCs.

Als nächstes wir ausgewertet CLDN11
Promotor-Methylierung und Expression in Magen-Zelllinien. Immortalized normalen menschlichen Magenepithelzellen (HFE145) und GC-Zelllinien AGS, SIIA, MKN28, KatoIII und SNU-1 untersucht. Alle GC-Zelllinien getestet (AGS, SIIA, MKN28, KatoIII und SNU-1) gezeigt, Promotor-Hypermethylierung, während keine Methylierung in verewigte normalen HFE145 Zellen (2A) beobachtet wurde. CLDN11
mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung qRT-PCR auf RNA beurteilt aus den Zellinien gereinigt, während claudin-11-Proteinexpression durch Western-Blotting analysiert. Wie in 2B gezeigt, alle 5 Krebslinien zeigten keine nachweisbare Expression von CLDN11
mRNA oder Protein, während HFE145 Zellen hoch CLDN11
Expressionsniveaus manifestiert. Dieser Befund legt fest, dass CLDN11
wird in GC-Zelllinien im Vergleich zu normalen Magenepithelzellen (NGECs).

Zur weiteren Validierung Silencing von CLDN11
Ausdruck koordinativ hypermethyliert und nach unten reguliert durch hypermethylation wir behandelt, um die GC-Zelllinie mit der AGS Demethylierungsmittel, 5-Aza-2-desoxycytidin (5-Aza-dC, 1 uM), um Zeitintervalle verändert wird. Gesamt-RNAs extrahiert, bevor vs.
Nach der Behandlung qRT-PCR unterzogen wurden für CLDN11
. Wie in Abbildung 3 zu jedem Zeitpunkt zu sehen, CLDN11
mRNA wurde mit 5-Aza-dC nach der Behandlung erneut zum Ausdruck gebracht, was bestätigt, dass CLDN11 und Videos Promotor-Hypermethylierung in AGS zum Schweigen gebracht wird . [27] - GC Zellen

die Mitglieder der Claudin-Protein-Familie wurden in der Regulation der Zelladhäsion, Invasion und Migration von Krebszellen [25] beteiligt. Daher wir als nächstes untersucht, ob CLDN11
Einflüsse der Zellbeweglichkeit oder Invasivität. HFE145 Zellen, die reichlich auszudrücken CLDN11
, wurden ausgewählt, um studieren Effekte von CLDN11
Knockdown auf die invasive und Migrationseigenschaften von Magen-Epithelzellen. Transient siRNA Transfektionen wurden unter Verwendung von CLDN11-
spezifische siRNA-Duplexen. Transfektion mit CLDN11
-spezifische siRNA-Duplexe effizient claudin-11-Proteinspiegel verdrängte von > 90%, wohingegen die Expression unverändert in mock oder siRNA-behandelten Zellen (4A) zu steuern. Zellbewegung und Invasion Assays wurden auf siRNA-transfizierten Zellen durchgeführt, die eine modifizierte Boyden-Kammer-Assay-System unter Verwendung von [25]. Interessanterweise wie in den 4B und 4C gezeigt, Hemmung von CLDN11
Ausdruck in HFE145 Zellen deutlich stärker auf die Migrations-und invasive Potentiale dieser Zellen.

Die aktuelle Studie somit die Hypothese bestätigt, dass CLDN11
, a tight junction-Protein, wird in GC über Promotor hypermethylation Schweigen gebracht, und diese Daten unterstützen die Einbeziehung von CLDN11
in der Kontrolle von GC Zellinvasion und Migration.

Promoter hypermethylation ist bekannt, mit transkriptionalen Silencing bestimmter Gene assoziiert. DNA-Methylierung kann mit der Bindung von Transkriptionsfaktoren, deren Bindungsstellen enthalten CpG stören. Mit dem TFSEARCH Software-Programm, um gescannte die CLDN11
Sequenz gefunden bei Magenkrebs Geweben und Zelllinien hypermethyliert werden, dh
., Die QMSP Amplikon (-104 bis 4 Basen in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle für CLDN11
). Dieser Scan mutmaßliche Bindungsstellen für Sp1 und GATA-1 und GATA-2 identifiziert. Frühere Studien haben gezeigt, dass Hypermethylierung von Promotor-DNA trägt zum Schweigen gebracht angezeigt CLDN3
und CLDN4
in ovarian Zelllinien, teilweise über
Methylierungs-induzierte Störung der Bindung von Sp1 an seinen zugehörigen Bindungsstelle (22, 23). Darüber hinaus wurden die Mitglieder der GATA-Familie gezeigt, positive Regulatoren der CLDN11
Transkription [28] sein. Weitere Studien sind gerechtfertigt, nun zu prüfen, ob Hyper dieser Seiten mit der Bindung von Transkriptionsfaktoren beeinträchtigt, und wie solche Störung beeinflussen können CLDN11
Gen-Transkription.

Die Tumorzellen zeigen typischerweise eine strukturelle und funktionelle Mängel in ihrer TJs [17]. Diese Mängel werden mit einem Verlust der Polarität und Differenzierung assoziiert. Eine weitere wichtige Verbindung zwischen TJs und Krebs ist ein Verlust von TJ Integrität, mit daraus folgender Leckage oder Transport von pro-tumorgene Substanzen (wie Wachstumsfaktoren oder Nährstoffe) in die Tumorzelle primordia entwickeln, das Tumorwachstum zu fördern [29]. Zusätzlich kann der Verlust der Polarität, Differenzierung und Hafteigenschaften mit beeinträchtigter TJ-Funktion in der Krebstherapie verbunden sind, können in den Erwerb eines metastatischen Phänotyp [30] kritisch sein. Studien haben ergeben, dass Anomalien in TJ-assoziierten Proteinen epithelial-mesenchymale Transition (EMT) darstellen kann, wodurch die Invasivität und Motilität von Krebszellen zu verändern.

Modulationen in der Expression von TJ-assoziierten Proteinen, insbesondere Claudin Proteine, haben wurden in einer Reihe von Krebsarten gezeigt. Neuere Studien von uns und andere haben Veränderungen in Claudin Proteinregulierung in verschiedenen epithelialen Tumoren gezeigt [18]. Mitglieder der Genfamilie claudin sind in einem hoch gewebespezifischen sowie eine sehr Entwicklungsstadium spezifische Weise exprimiert. Darüber hinaus je nach Krebsart kann die Expression von Claudin-Proteine ​​entweder hochreguliert oder in Krebszellen herunter reguliert sein. Zum Beispiel werden mehrere Claudin-Proteine ​​in Dickdarm-, Eierstock-, Bauchspeicheldrüsen- und Prostatakrebs upregulated, während einige in Brustkrebs und Kopf-Hals-Tumoren nach unten reguliert werden [16], [18]

Studien haben bereits berichtet Veränderungen in der Expression Profile der Mitglieder der Claudin-Familie mit GC in Verbindung gebracht werden. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) identifiziert die CLDN18
Gen wie in GCs downregulated einen Darm-Phänotyp besitzen [31]. Die CLDN23
Gen wird auch in Darm-Typ GCs downregulated [32]. Im Gegensatz dazu Cunningham et al. Berichtet
CLDN4
Ausdruck in intestinale Metaplasie und Magen Epitheldysplasie erhöht werden, die dieses Gen als Marker für die GC-Vorläuferläsionen identifiziert [33]. In der aktuellen Studie fanden wir, CLDN11
Ausdruck über
hypermethylation seiner Promotorregion in der GC downregulated oder zum Schweigen gebracht werden. Darüber hinaus fanden wir, dass im Gegensatz zu CLDN18
und CLDN23
, CLDN11
Expression wurde in GC Patientenproben als auch in Zelllinien nach unten reguliert, und zwar unabhängig von diffusen vs
. intestinalen Subtyps.

Claudin-11, auch als Oligodendrozyten-spezifischen Protein bekannt ist, wurde zuerst identifiziert spezifisch in den tight junction Stränge von Oligodendrozyten im Gehirn und in Sertoli-Zellen von Ratten und Mäusen exprimiert werden [ ,,,0],34], [35]. Der Verlust von Claudin-11-Expression, zu einer Störung der Barriere TJ führt, ist mit neurologischen und reproduktiven Defiziten [36]. Eine aktuelle Studie berichtet, die Überexpression und Fehllokalisation von CLDN11
aus dem Blut-Hoden-Schranke in Sertoli-Zellen mit Hoden intraepitheliale Neoplasie bei Männern [37] zugeordnet werden. Die Daten in der aktuellen Studie fest, dass CLDN11
im normalen Magengewebe exprimiert und verewigte NGECs. Doch seine komplette Funktionen im normalen Magen sowie im Magen-Karzinogenese bleiben unklar.

In einem Versuch, die mögliche Beteiligung von zu erkunden CLDN11
in GC, untersuchten wir phänotypischen Veränderungen im Zusammenhang mit Silencing CLDN11
Ausdruck in CLDN11-
exprimierenden Magenepithelzellen (HFE145). Sehr interessant ist, siRNA-vermittelten Knockdown von CLDN11
führte zu einer erhöhten Zellbeweglichkeit und Invasion.

Frühere Studien haben Krebs-spezifische phänotypische Veränderungen berichtet mit Modulationen in Claudin-Expression in verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht werden . Die Überexpression von Claudin-3 und Claudin-4-Proteine ​​in Eierstockkrebszelllinien führt zu einer erhöhten Invasion durch diese Zellen [25]. In Darmkrebs, erhöhte Expression von claudin-1 berichtet wurde, und Veränderungen in der Expression claudin-1 signifikante Auswirkungen auf das Wachstum von xenotransplantierten Tumoren und Metastasen in athymischen Nacktmäusen, [27] ausübt. Auf der anderen Seite hat Claudin-7 Herabregulation bei Brustkrebs mit einem erhöhten zellulären discohesion und die Fähigkeit von Brustkrebszellen assoziiert zu verbreiten [19]. Außerdem zeigten Versuche in pankreatischen Zelllinien, die die Expression von claudin-4 zu einer reduzierten Invasivität führt, Tumorigenität und metastatischen Potential dieser Zellen [38]. Die Gründe für diese Abweichungen sind in der Tat gegenwärtig unklar, kann jedoch um gewebespezifische Unterschiede in claudin Funktion oder sogar auf Variationen in Reaktion verschiedener Zelllinien zusammenhängen. Offensichtlich sind die Mitglieder der Claudin-Familie bekannt in gewebespezifisch exprimiert werden und unterschiedliche Wirkungen ausüben kann.

Obwohl in den letzten Jahren ist deutlich geworden, dass TJs und TJ-assoziierte Proteine ​​verfügen über umfangreiche und vielfältige funktionelle und physiologischen Aktivitäten in normalen und Krebserkrankungen, molekulare Mechanismen, die diesen Aktivitäten zugrunde liegen bleiben unklar. TJs sind anspruchsvolle interzellularen Vorrichtungen fähig zu rekrutieren Signalproteine, wodurch verschiedene zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Differenzierung regulieren, und tumorigenesis [39], [40]. CLAUDIN Proteine ​​assoziieren direkt mit diskreten Signalübertragungswege durch mit Signalmolekülen, wie beispielsweise mit atypischer Proteinkinase C und Rho-Proteine, sowie mit anderen PDZ-Domäne enthaltenden Proteinen interagieren. Bei Eierstockkrebs, MMP-Aktivität Claudine Tumorinvasion ändern durch die Regelung [25].

Insgesamt Daten aus der aktuellen Studie identifizieren CLDN11
als Ziel der epigenetischen Modifikation sowie eine viel versprechende Biomarker für Magenkrebs Früherkennung, Diagnose und Therapie. Diese Ergebnisse legen nahe, auch die Beteiligung von CLDN11
Herabregulation in der Karzinogenese über
Förderung der Zellinvasion und Beweglichkeit zu verbessern. Die Mechanismen für dieses Phänomen sind Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Duane T Smoot für seine großzügige Geschenk von HFE145 Zellen.

• PLoS Genetics: MiR-218 Hemmt Invasivität und Metastasierung von Magenkrebs durch Targeting die Robo1 Receptor
• PLoS Genetics: Onkogene Pathway Kombinationen Predict klinische Prognose in Gastric Cancer