Bakgrund
Claudins är membranproteiner som spelar avgörande roller i tät korsning (TJ) bildning och funktion. Medlemmar av claudin genfamiljen har visat sig vara avvikande regleras, och att delta i patogenesen av olika humana cancerformer. I den aktuella studien, rapporterar vi att claudin-11 ( CLDN11 Nivåer av CLDN11 Dessa data tyder på att hypermetylering av CLDN11 Citation. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et al. (2009) tysta Claudin-11 är associerad med ökad spridnings av Gastric cancerceller. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002 Redaktör: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, USA Mottagna: 3 augusti, 2009; Accepteras: 23 oktober 2009; Publicerad: 24 november 2009 Copyright: © 2009 Agarwal et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit Finansiering:. Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag CA085069, CA138677 och CA146799 till SJ Meltzer. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns Introduktion Gastric cancer (GC) är fortfarande den näst mest vanligaste orsaken till dödsfall i cancer globalt. Det är en av de mest dödliga maligniteter och en ledande orsak till dödsfall i cancer i utvecklingsländer, med totalt 5-årsöverlevnaden under 20% [1], [2]. Studier av GC och deras preneoplastisk prekursor lesioner har identifierat flera genetiska och epigenetiska förändringar, bland annat mikro instabilitet, punktmutationer, och förlust av heterozygositet (LOH) påverkar tumörsuppressorgener (GTS) [3] - [6]. Ändå är den molekylära patogenesen av GC fortfarande ofullständigt känd. epigenetiska förändringar är mycket viktiga i cancerutveckling och progression [7]. Transkriptionsinaktivering av tumörsuppressorgener via avvikande promotor hypermethylation av CpG-öar, orsakar permanent tysta gener, är en viktig epigenetisk mekanism för TSG inaktive. Tidigare har studier publicerats på promotor hypermethylation i GC och deras premaligna prekursorer [ ,,,0],8] - [10]. p16INK4a och p15INK4B var bland de första generna att visa hypermethylation i GC [11]. Vår grupp och andra upptäckte därefter hypermetylering av hMLH1 mismatch repair genen i GC uppvisar ofta mikro instabilitet (MSI-H) [12] - [14]. Vi visade också att hypermetylering av E-cadherin (CDH1) genen inträffar ofta i GC [15]. En pilotmicroarray-baserad genomet hela sökning genomförs av vår grupp, utförs för att upptäcka nya epigenetiskt tystade gener i gastric cancer, identifierad claudin-11 ( CLDN11 Claudin-11 tillhör till familjen av Claudin proteiner, som innehåller mer än 23 medlemmar. Medlemmar av claudin familjen uttrycks på ett mycket vävnadsspecifikt sätt i en mängd olika normala och neoplastiska vävnader [16]. Claudins är transmembranproteiner som spelar avgörande roller i TJ bildning och funktion. TJs är intercellulära förbindelser kritiska i paracellulära transporten av lösta ämnen, såväl som att upprätthålla cell polaritet. Tumörceller uppvisar vanligen strukturella och funktionella brister i deras TJs [17]. Under de senaste åren har ett antal studier visat avvikande uttryck av claudin proteiner i olika cancertyper [18], [16]. Flera av dessa studier fann dysreglering av claudin proteinuttryck via Den aktuella studien identifierar och rapporter till vår kunskap för första gången, att CLDN11 cellinjer och kliniska vävnadsprover immortaliserad human normala gastric epithelial (HFE145) erhölls från Dr. Duane T. Smoot (Howard University) och GC cellinjer AGS, SIIA celler, MKN28, KATOIII och SNU-1 erhölls från ATCC. Alla cellinjer odlades och upprätthölls i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% antibiotiskt-antimykotiskt lösning (Invitrogen). Kopplade primära gastriska normala och tumörvävnader uppsamlades vid Johns Hopkins Hospital ( JHH). Prover var snap-frysta omedelbart efter resektion. Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) godkännande erhölls för alla de fall som ingår i studien. Fall erhölls från JHU kirurgisk patologi enligt JHU IRK-godkända undantag 02-07-19-05e enligt regel 45 CFR 46,101 (b), som åsidosätter kraven för att erhålla patientens samtycke. Genomiskt DNA extraherades från snabbfrystes vävnadsprover eller cellinjer med användning av en DNeasy Blood & Vävnads Kit (QIAGEN, Valencia, CA) enligt tillverkarens protokoll. Totalt RNA extraherades med Trizol-reagens (Invitrogen). Extraherat DNA och RNA kvantifierades med användning av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Wilmington, DE). genomiska DNA som erhållits från 36 patientprover, innefattande 18 GC och 18 matchade noncancerous magen mukosala (NS) vävnader, såväl som från olika gastriska cellinjer, underkastades qMSP. qMSP utfördes såsom beskrivits tidigare, med mindre modifieringar [24]. I korthet var bisulfit behandling av genomiska DNA utfördes med användning av en EpiTect Bisulfite Behandling Kit (QIAGEN, Valencia, CA). En MSP amplikon och TaqMan sond för att upptäcka helt metylerade DNA var utformade för att inkludera flera CpG platser i 5'-UTR-regionen av CLDN11 CLDN11 5-Aza-2'-deoxicytidin (5-Aza-dC) Behandling. AGS är en GC-cellinje manifesterar hypermetylering av CLDN11
) tystnar i magcancer via
hypermetylering av dess promotorregion.
Metodik /viktigaste resultaten
metylering och mRNA-expression mättes i primära gastriska cancervävnader, noncancerous gastric slemhinnor och cellinjer av gastric ursprung med hjälp av kvantitativ metylering-specifik PCR (qMSP) och kvantitativ omvänt transkriptas-PCR (QRT-PCR), respektive. Analyser av parade gastric cancer och intilliggande normala gastriska vävnader avslöjade hypermetylering av CLDN11
promotorregionen i gastric cancer, och denna hypermethylation var signifikant korrelerad med nedreglering av CLDN11
uttryck vs.
normala vävnader. CLDN11
promotorregionen också hypermethylated i alla magcancer testade cellinjer i förhållande till odödliggjorda normala gastric epitelceller. Dessutom CLDN11
mRNA uttryck omvänt korrelerad med dess metylering nivå. Behandling av CLDN11
-nonexpressing gastric cancerceller med 5-aza-2'-deoxicytidin restaurerade CLDN11
uttryck. Dessutom siRNA-medierad knockdown av CLDN11
uttryck i normala gastric epitelceller ökat sin rörlighet och invasiv.
Slutsatser /Betydelse
, vilket leder till nedreglerade uttryck, bidrar till gastric cancer genom att öka cellulär motilitet och invasivitet. En ytterligare förståelse av mekanismerna bakom roll claudin proteiner i gastric cancer kommer sannolikt att bidra till att identifiera nya metoder för diagnos och behandling av magcancer
), en stram korsning (TJ) protein, som ett potentiellt mål för epigenetisk inaktivering i mag cancer (opublicerade data).
promotor hypermethylation. Hypermetylering-inducerad tysta claudin-7 uttryck tidigare rapporterats i bröst [19] och kolorektal [20] karcinom. Claudin-6 är också epigenetiskt tystas i bröstcancer [21], medan claudins -3 och -4 är epigenetiskt regleras i äggstockscancerceller [22], [23].
promotorregion hypermethylated i GC vävnader och cellinjer. Dessutom, även om CLDN11
mRNA uttrycktes i alla primära noncancerous gastriska mukosala vävnader, såväl som i en immortaliserad normal gastrisk epitelcellinje, var det tystas i alla GC vävnader och cellinjer undersöktes. Intressant siRNA-medierad nedreglering av CLDN11
i CLDN11
uttryckande gastric celler också i samband med cancerrelaterade fenotypiska förändringar, särskilt ökad cellrörlighet och invasiv.
Material och metoder
Etik Statement
Rening och framställning av genomiskt DNA och Total RNA
Kvantitativ Metylering-Specific PCR (qMSP) för Claudin-11
genen. CLDN11
specifika primers och probsekvenser som användes var: framåt primer 5 'CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3'; omvänd primer 5 'GACGAAAACAACAACGCTACT 3'; TaqMan probe 5'TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 '. CpGenome Universal metylerat DNA (Chemicon International, Temecula, CA) tjänade som en positiv kontroll, och serieutspädningar av den användes för att rita en standardkurva. qMSP med TaqMan sond utfördes på en iQ5 termisk cykler (BioRad, Hercules, CA) med hjälp av iQ Supermix ( ibid.
). Femtio cykler av PCR-amplifiering som börjar med 50 ng av bisulfit-behandlad genom-DNA utfördes i triplikat, i enlighet med tillverkarens protokoll. Duplex PCR med β-aktin (ACTB) primer och sondsekvenser som inte innehåller CpG utfördes för normalisering. Primer och sondsekvenser som användes var som tidigare [24] publicerades. Normaliserat metylering värde (NMV) definierades som följer: NMV = ( CLDN11-S
/ CLDN11-FM
) /( ACTB-S
/ ACTB -FM
) * 100, där CLDN11-S Mössor och CLDN11-FM
representera CLDN11
metylering nivåer i provet och fullständigt metylerade DNA, respektive medan ACTB-S Mössor och ACTB-FM
motsvara β-aktin
i provet och fullständigt metylerade DNA, respektive. Hel-genomet amplifieras DNA (WGA) användes som en icke-metylerad negativ kontroll.
Kvantitativ omvänd transkription-PCR analys
RT-PCR-amplikon var utformad för att överlappa en intron-exon gränsen för att utesluta iskt DNA ( g
DNA) förstärkning. Primer sekvenser som tidigare [18] publicerades. Enstegs QRT-PCR utfördes såsom beskrivits tidigare [24], med användning av en Quantitect Sybra RT-PCR-kit (QIAGEN, Valencia, CA), enligt tillverkarens protokoll. CLDN11
uttryck normaliserades till β
aktin uttryck. Totalt RNA från HFE145 celler användes för standardkurvan. ( CLDN11-S
/ CLDN11-C
) /( ACTB-S
/ ACTB-C
), där CLDN11- S Köpa och CLDN11-C
representerar CLDN11
mRNA expressionsnivåer i testprovet och kontroll mRNA respektive, medan ACTB-S Mössor och ACTB -C
motsvarar p-aktin
uttrycksnivåer i testprovet och kontroll mRNA respektive
promotor i samband med frånvarande CLDN11
mRNA uttryck. 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC) behandling av celler utfördes såsom beskrivits tidigare [24]. I korthet var den GC-cellinjen AGS (ATCC katalognummer CRL-1739) ympades vid en densitet av 2 x 10 5 celler /ml i en T-75 kolv. Tjugofyra timmar senare behandlades cellerna med 1
Tarmmikrober kan kopplas till depression
Tarm- och orala mikrobiomer förutsäger allvarligheten av COVID-19
Tarmmikrobiom och IBD - kopplingen kanske i kosten säger studie
Fekaltransplantation från vissa givare bättre än andra
Inledande fynd från Human Microbiome Project utlöste "hundratals efterföljande studier"
Forskning länkar SARS-CoV-2-prevalens,
DNA -metabarkodning kan förbättra analysen av människans kost
En ny studie har visat att DNA -metabarkodning fungerar som ett kraftfullt nytt verktyg för att övervaka människors intag av växter, som kan hjälpa forskare att förstå mer om vad vi äter och hur det p
Penis mikrobiom är reservoar för bakteriell vaginos-associerade bakterier
Bland de sexuellt överförbara infektionerna (STI) är bakteriell vaginos påverkar mer än 20 procent av kvinnorna över hela världen. Tillståndet härrör från spridningen av vissa bakterier i slidan. Ti
Hushållens desinfektionsmedel kan bidra till fetma hos barn
Kanadensiska forskare har visat att vanliga hushållsrengöringsprodukter kan göra barn överviktiga genom att orsaka förändringar i tarmmikrofloran. Sergey Mironov | Shutterstock Forskarna