PLoS ONE: Silencing van Claudin-11 is geassocieerd met verhoogde Invasiviteit van maagkanker Cells

De abstracte

Achtergrond

Claudins zijn membraaneiwitten die cruciale rol spelen in kleine (TJ) vorming en functie kruising. Leden van de genfamilie claudin gebleken is afwijkend gereguleerd, en om aan de pathogenese van verschillende menselijke kankers. In de huidige studie, melden wij dat claudine-11 ( CLDN11
) wordt het zwijgen opgelegd bij maagkanker via
hypermethylatie van zijn promotor gebied.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Het niveau van de CLDN11
methylatie en mRNA expressie werden gemeten in het primair maagkanker weefsels, goedaardige maag slijmvliezen, en cellijnen van maag oorsprong met behulp van kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (QMSP) en kwantitatieve reverse transcriptase-PCR (qRT-PCR), respectievelijk. Analyses van gepaarde maagkanker en aangrenzende normale maag weefsels onthulde hypermethylering van de CLDN11
promoter regio in de maag kanker, en dit Hypermethylering was significant gecorreleerd met downregulatie van CLDN11
uitdrukking versus
normale weefsels. De CLDN11
promotorregio werd ook gehypermethyleerd in alle maagkanker cellijnen getest ten opzichte van vereeuwigd normale maag epitheelcellen. Bovendien, CLDN11
mRNA expressie werd omgekeerd gecorreleerd met zijn methylatie-niveau. Behandeling van CLDN11
-nonexpressing maagkanker cellen met 5-aza-2'-deoxycytidine hersteld CLDN11
expressie. Bovendien siRNA-gemedieerde knockdown van CLDN11
expressie in normale maagepitheelcellen verhoogden hun beweeglijkheid en invasiviteit.

Conclusies /Belang

Deze gegevens suggereren dat Hypermethylering van CLDN11
, wat leidt tot gedownreguleerd meningsuiting, draagt ​​bij aan de maag carcinogenese door het verhogen van cellulaire beweeglijkheid en invasiviteit. Een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van claudin eiwitten in de maag carcinogenese zal waarschijnlijk helpen bij de identificatie van nieuwe benaderingen voor de diagnose en behandeling van maagkanker

Visum:. Agarwal R, Mori Y, Y Cheng, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et al. (2009) Silencing van Claudin-11 is geassocieerd met verhoogde Invasiviteit van maagkanker cellen. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002

Editor: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 3 augustus 2009; Aanvaard: 23 oktober 2009; Gepubliceerd: 24 november 2009

Copyright: © 2009 Agarwal et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten National Institutes of Health subsidies CA085069, CA138677 en CA146799 aan SJ Meltzer. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) blijft de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Het is een van de meest dodelijke maligniteiten en een belangrijke oorzaak van kanker sterfgevallen in ontwikkelingslanden, met de algemene 5-jaarsoverleving minder dan 20% [1], [2].

Studies van GC en hun preneoplastische voorloper letsels hebben verschillende genetische en epigenetische veranderingen, met inbegrip van microsatelliet instabiliteit, puntmutaties, en verlies van heterozygositeit (LOH) beïnvloeden tumor suppressor genen (GTS) geïdentificeerd [3] - [6]. Toch is de moleculaire pathogenese van GC is nog steeds niet volledig begrepen.

Epigenetische veranderingen zijn uiterst belangrijk in de ontwikkeling van kanker en progressie [7]. Transcriptie inactivatie van tumorsuppressorgenen via afwijkende promotor hypermethylatie van CpG eilanden, waardoor permanent gene silencing, is een belangrijke epigenetische mechanisme van TSG inactivatie.

Eerder hebben studies gepubliceerd over promoter hypermethylatie in GC en hun premaligne voorlopers [ ,,,0],8] - [10]. p16INK4A en p15INK4B behoorden tot de eerste genen hypermethylering tonen in GC [11]. Onze groep en anderen later ontdekte hypermethylering van de hMLH1 DNA mismatch repair gen in GC vertonen frequent microsatelliet instabiliteit (MSI-H) [12] - [14]. We toonden ook aan dat Hypermethylering van de E-cadherine (CDH1) gen komt vaak voor in GC [15].

Een pilot microarray-gebaseerde genoomwijde zoektocht uitgevoerd door onze groep, uitgevoerd op nieuwe epigenetisch tot zwijgen genen in te ontdekken maag carcinogenese, geïdentificeerd claudine-11 ( CLDN11
), een tight junction (TJ) eiwit, als een potentieel doelwit van epigenetische inactivatie in maagkanker (ongepubliceerde gegevens).

Claudin-11 behoort tot de familie van claudin eiwitten, die meer dan 23 leden bevat. Leden van de familie claudin uitgedrukt in een sterk weefselspecifieke wijze in verschillende normale en neoplastische weefsels [16]. Claudins zijn transmembraan eiwitten die een cruciale rol in TJ vorming en de rol te laten spelen. TJS intercellulaire juncties zijn essentieel in het paracellulaire transport van opgeloste stoffen, en in het handhaven celpolariteit. Tumorcellen gewoonlijk structurele en functionele gebreken vertonen in hun TJS [17].

De laatste jaren is een aantal studies afwijkende expressie van claudin eiwitten in verschillende kankertypes [18], [16] getoond. Een aantal van deze studies gevonden ontregeling van claudin eiwitexpressie via
promoter hypermethylering. -Hypermethylering geïnduceerde silencing van claudin 7-expressie werd voorheen in borst [19] en colorectale [20] carcinomen. Claudin-6 is ook epigenetisch zwijgen opgelegd bij borstkanker [21], terwijl Claudins -3 en -4 zijn epigenetisch gereguleerd in eierstokkanker cellen [22], [23].

De huidige studie identificeert en verslagen aan onze kennis voor het eerst dat de CLDN11
promotorgebied gehypermethyleerd in GC weefsels en cellijnen. Bovendien, terwijl CLDN11
mRNA expressie werd gebracht in alle primaire goedaardige gastrische mucosale weefsels, alsook in een geïmmortaliseerde normale gastrische epitheel cellijn, werd in alle weefsels GC gedempt en cellijnen onderzocht. Interessant is dat siRNA-gemedieerde downregulatie van CLDN11
in CLDN11
tot expressie brengen maag cellen werd ook in verband gebracht met kanker-gerelateerde fenotypische veranderingen, in het bijzonder verhoogde celmotiliteit en invasiviteit.

Materials en methoden

cellijnen en klinische weefselmonsters

Onsterfelijk humane normale maag epitheelcellen (HFE145) werden verkregen van Dr. Duane T. Smoot (Howard University) en GC cellijnen AGS, SIIA, MKN28, KATOIII en SNU-1 werden verkregen van ATCC. Alle cellijnen werden gekweekt en gehouden in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotisch-antimycotische oplossing (Invitrogen).

Gekoppelde primaire maag normale en tumorweefsels werden verzameld op de Johns Hopkins Hospital ( JHH). Exemplaren waren snap-bevroren onmiddellijk na resectie.

Ethics Verklaring

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) goedkeuring werd verkregen voor alle zaken opgenomen in de studie. Cases werden verkregen uit JHU chirurgische pathologie onder JHU IRB-goedgekeurde vrijstelling 02-07-19-05e op grond van regel 45 CFR 46,101 (b), waarin de eisen voor het verkrijgen van toestemming van de patiënt afziet.

Reiniging en bereiding van Genomic DNA en Total RNA

Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit snel bevroren weefselmonsters of cellijnen met een DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) volgens het protocol van de fabrikant. Totaal RNA werd geëxtraheerd met Trizol reagens (Invitrogen). Geëxtraheerde DNA en RNA werden gekwantificeerd met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (NanoDrop, Wilmington, DE).

Kwantitatieve Methylatie Specifieke PCR (QMSP) voor Claudin-11

genomische DNA verkregen uit 36 patiëntenmonsters omvattende GC 18 en 18 gekoppeld goedaardige mucosale maag (NS) weefsels, alsook van verschillende maag cellijnen werden onderworpen aan QMSP. QMSP werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met kleine aanpassingen [24]. Kortom, bisulfiet behandeling van genomisch DNA werd uitgevoerd met een EpiTect bisulfiet behandeling Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Een MSP amplicon en TaqMan sonde op te sporen volledig gemethyleerd DNA werden ontworpen om meerdere CpG locaties in de regio 5'-UTR van CLDN11
gen bevatten. CLDN11
-specifieke primers en probe-sequenties die werden gebruikt waren: voorwaartse primer 5 'CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3'; omgekeerde primer 5 'GACGAAAACAACAACGCTACT 3'; TaqMan probe 5'TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 '. CpGenome Universal Gemethyleerd DNA (Chemicon International, Temecula, CA) diende als een positieve controle en seriële verdunningen daarvan werden gebruikt om een ​​standaardcurve te plotten. QMSP met TaqMan-probe werden uitgevoerd op een IQ5 thermische cycler (BioRad, Hercules, CA) met behulp van iQ Supermix ( ibid.
). Vijftig cycli van PCR amplificatie met 50 ng bisulfiet behandeld genomisch DNA werden uitgevoerd in drievoud, volgens het protocol van de fabrikant. Duplex PCR met β-actine (ACTB) primer en probe sequenties die geen CpGs werden voor normalisatie. De primer en probe sequenties waren als eerder [24] gepubliceerd. Genormaliseerde methylatie waarde (NMV) werd als volgt gedefinieerd: NMV = ( CLDN11-S Twitter / CLDN11-FM
) /( ACTB-S Twitter / ACTB -FM
) * 100, waarbij CLDN11-S Kopen en CLDN11-FM
vertegenwoordigen CLDN11
methylatie niveaus in het monster en volledig gemethyleerd DNA, respectievelijk, terwijl ACTB-S Kopen en ACTB-FM
overeen met β-actine
in het monster en volledig gemethyleerd DNA's, respectievelijk. Hele genoom geamplificeerd DNA (WGA) als een ongemethyleerde negatieve controle.

kwantitatieve reverse transcriptie-PCR-analyse

De CLDN11
RT-PCR amplicon werd ontworpen overlappen een intron-exon grens om genomische DNA ( g
DNA) amplificatie uit te sluiten. Primer sequenties waren als eerder [18] gepubliceerd. Een stap qRT-PCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [24], met een Quantitect sybra RT-PCR kit (QIAGEN, Valencia, CA) volgens het protocol van de fabrikant. CLDN11
expressie werd genormaliseerd naar β
actine expressie. Totaal RNA uit HFE145 cellen werd gebruikt voor de standaardcurve. ( CLDN11-S Twitter / CLDN11-C
) /( ACTB-S Twitter / ACTB-C
), waarbij CLDN11- S Kopen en CLDN11-C
vertegenwoordigen CLDN11
mRNA expressie in het monster en controle mRNA, respectievelijk, terwijl de ACTB-S Kopen en ACTB -C
overeen met β-actine
expressieniveaus in het monster en controle mRNA respectievelijk.

5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC) Behandeling

AGS is een GC cellijn manifesteren hypermethylering van de CLDN11
promotor in combinatie met afwezige CLDN11
mRNA expressie. 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC) behandeling van cellen werd uitgevoerd zoals eerder [24] beschreven. Kortom, de GC AGS cellijn (ATCC catalogusnummer CRL-1739) werden geënt bij een dichtheid van 2 x 10 ^{5 cellen /ml in een T-75 kolf. Vierentwintig uur later werden de cellen behandeld met 1 uM 5-aza-dC gedurende 72 uur. Medium dat 5-aza-gelijkstroom werd vervangen door vers bereide media elke 24 uur. Cellen werden vervolgens geoogst voor totale RNA-extractie. Totaal RNA van AGS cellen voor en na 5-aza-dc behandeling werden onderworpen aan kwantitatieve real-time RT-PCR-analyse.}

kleine interfererende RNA Knockdown Experimenten

CLDN11
-specifieke siRNA oligo's werden gekocht van Ambion, Inc (Austin, TX). De HFE145 cellijn, die CLDN11
positief werd geselecteerd om het effect van claudin 11-knockdown over migratie en invasie eigenschappen van gastrische cellen te bestuderen. Experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Agarwal et al.
, 2005). Cellen gekweekt in 6-well platen werden getransfecteerd met siRNA-duplexen met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Mock-transfecties en niet-specifieke siRNA duplexen werden gebruikt als negatieve controles. Cellen werden behandeld gedurende 48 tot 72 uur maximale knockdown toe, waarna ze ofwel werden geoogst voor Western blot analyse of voor migratie en invasie assays.

Western blotanalyse van Claudin-11 in maag cellijnen

Confluente celkweken werden gewassen met HBSS (Invitrogen) en gehele cellysaten werden bereid met lysisbuffer: 62,5 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 10% glycerol, en 2% SDS. De eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchoninezuur (BCA) assay kit (Pierce, Rockford, IL). Twintig microgram totale eiwitten werden gescheiden door 10% tot 20% SDS-PAGE op Tris-Glycine gels (Invitrogen) en overgebracht op polyvinylideen difluoride membranen (Millipore Corp., Bedford, MA). De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in TBST buffer gewassen en afgetast met een anti-claudine-11 antilichaam (Zymed, San Francisco, CA). Blots werden vervolgens gewassen en geïncubeerd in mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-konijn IgG: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Voor de detectie, werd chemiluminescentie uitgevoerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentie (Amersham Pharmacia Biotech).

Cell Invasion en Migratie Assay

Invasiviteit van siRNA-getransfecteerde cellen werd bepaald met behulp van Matrigel-gecoate invasie kamer inserts (24-well formaat met 8 urn poriën, BD Biosciences) met een gemodificeerde Boyden kamer assay [25]. Cellen werden gekweekt tot ongeveer 80% confluentie en serum uitgehongerd nacht. Op de dag van de test werden cellen getrypsiniseerd en levensvatbare cellen genomen. Ongeveer 50.000 cellen werden uitgeplaat op de top van elk van elk filter in serumvrij medium. Een gelijk volume van hetzelfde medium dat 20% FCS werd in de onderste kamer ( d.w.z..
, De put onder het filter) fungeren als een chemoattractant. Testplaten werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende maximaal 48 uur. Cellen die niet migreren en binnendringen door de poriën van de Transwell inzetstukken werden handmatig verwijderd met een wattenstaafje. Cellen aanwezig bij de bodem van het membraan werden gefixeerd in koude methanol gedurende 10 min en vervolgens gekleurd met 0,01% kristalviolet in 20% ethanol. Na 10 minuten incubatie werden de filters grondig met water gewassen en gesuspendeerd in 200 pl van 5% azijnzuur en 5% methanol. Colorimetrische aflezingen werden bij OD _{595. De experimenten werden ten minste driemaal herhaald, met triplo in elk experiment. Celmigratie beoordelen, werden assays hoofdzakelijk zoals beschreven herhaald, behalve dat de cellen werden geplaat bovenop ongecoate (Matrigel-vrij) inserts.}

Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met Student's t -test (SPSS, versie 16), met p
. < 0,05 als statistisch significant

Resultaten en discussie

We hebben eerst onze hypothese getest dat de CLDN11
promotor gehypermethyleerd en dat dit hypermethylering correleert omgekeerd evenredig met de CLDN11
mRNA expressie in het primair GC weefsels. Gepaarde primaire maag normale en tumorweefsels werden verzameld bij de Johns Hopkins Hospital (JHH). Monsters werden onmiddellijk verkregen na resectie en snap-ingevroren tot gebruik. Alleen gevallen verkregen met informed consent zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) werden opgenomen in dit project. Genomisch DNA werd verkregen van 36 klinische monsters, omvattende 18 GC en 18 gekoppeld goedaardige maagslijmvlies (NS) weefsels. CLDN11
promoter methylatie niveaus in deze monsters werden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve real-time methylatie-specifieke PCR (QMSP). Figuur 1A toont de genormaliseerde waarde methylering (NMV), d.w.z..
De verhouding van gemethyleerde waarde van de CLDN11
promotorgebied in elk monster een volledige controle gemethyleerd DNA. CLDN11
NM Vs
waren in GC exemplaren significant hoger dan in hun bijpassende NS weefsels ( P Restaurant < 0,001). Of CLDN11
promoter hypermethylatie in GC werd geassocieerd met silencing van CLDN11
meningsuiting, CLDN11
mRNA niveaus werden gemeten met behulp van kwantitatieve real-time (qRT-PCR) in te beoordelen RNA gewonnen uit de 36 monsters voor methyleringsanalyse. Zoals aangetoond in Figuur 1B, genormaliseerde expressie waarden (NEVs) van CLDN11
in GC exemplaren waren aanzienlijk lager dan in gepaarde NS monsters ( P Restaurant < 0,001). Deze gegevens vaststelt dat CLDN11
promoter hypermethylering correleert met verminderde of tot zwijgen gebracht CLDN11
mRNA expressie in het primair GC.

Vervolgens evalueerden we CLDN11
promoter methylering en expressie in de maag cellijnen. Vereeuwigd humane normale maag epitheelcellen (HFE145) en GC cellijnen AGS, SIIA, MKN28, KATOIII en SNU-1 werden onderzocht. Alle GC cellijnen getest (AGS, SIIA, MKN28, KATOIII en SNU-1) toonden promoter hypermethylatie, terwijl er geen methylatie in vereeuwigd normale HFE145 cellen (Figuur 2A) werd waargenomen. CLDN11
mRNA-niveaus werden bepaald met qRT-PCR op RNA gezuiverd uit cellijnen, terwijl claudine-11 eiwitexpressie werd geanalyseerd door Western blotting. Zoals in figuur 2B, alle 5 kanker lijnen vertoonden geen detecteerbare expressie van CLDN11
mRNA of eiwit, terwijl HFE145 cellen uiting hoge CLDN11
expressieniveaus. Deze bevinding is bepaald dat CLDN11
wordt gecoördineerd gehypermethyleerd en neerwaarts gereguleerd in GC cellijnen ten opzichte van de normale maag epitheelcellen (NGECs).

Om verder te valideren silencing van CLDN11
expressie door hypermethylering, behandelden wij de GC-cellijn AGS de demethyleringsmiddel, 5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-v, 1 uM), voor het variëren van tijdsintervallen. Totaal RNA gewonnen voordat vs.
Na de behandeling werden onderworpen aan qRT-PCR voor CLDN11
. Zoals te zien in figuur 3, op elk tijdstip, CLDN11
mRNA werd re-expressie na behandeling met 5-aza-dC, bevestigt dat CLDN11
wordt gedempt door promotor hypermethylatie in AGS . GC cellen

de leden van de eiwitfamilie claudin zijn betrokken bij de regulatie van celadhesie, migratie en invasie van kankercellen [25] - [27]. Daarom hebben we onderzocht of CLDN11
invloeden cel motiliteit of invasiviteit. HFE145 cellen, die overvloedige uitdrukken CLDN11
, werden gekozen om de effecten van de studie CLDN11
knock-down op de invasieve en trekkende eigenschappen van de maag epitheelcellen. Transient siRNA transfecties werden uitgevoerd met behulp van CLDN11-
specifieke siRNA duplexen. Transfectie met CLDN11
-specifieke siRNA duplexen efficiënt onderdrukt claudine-11 eiwit levels van > 90%, terwijl de expressie onveranderd in mock- of controle-siRNA behandelde cellen (Figuur 4A) bleef. Celmotiliteit en invasie assays werden uitgevoerd op-siRNA getransfecteerde cellen onder toepassing van een gemodificeerde Boyden-kamer testsysteem [25]. Interessant, zoals getoond in figuren 4B en 4C, remming van CLDN11
expressie in HFE145 cellen sterk toegenomen migratie en invasieve potentieel van deze cellen.

De huidige studie bevestigt dus de hypothese dat CLDN11
, een tight junction eiwit, wordt het zwijgen opgelegd in GC via promoter hypermethylatie, en deze gegevens ondersteunen de betrokkenheid van de CLDN11
in de controle van GC cel invasie en migratie.

Promoter hypermethylering bekend is geassocieerd met transcriptionele silencing van bepaalde genen. DNA-methylatie kan interfereren met de binding van transcriptiefactoren waarvan de binding sites bevatten CpG dinucleotiden. Met behulp van de TFSEARCH softwareprogramma we scande de CLDN11
sequentie die moet worden gehypermethyleerd bij maagkanker weefsels en cellijnen, ie
., De QMSP amplicon (-104 tot 4 bases ten opzichte van de transcriptie start site voor CLDN11
). Deze scan geïdentificeerd vermoedelijke bindingsplaatsen voor SP1 en GATA-1 en GATA-2. Eerdere studies hebben aangetoond dat Hypermethylering van promotor-DNA draagt ​​bij silencing van CLDN3 Kopen en CLDN4
bij eierstokkanker cellijnen, deels via
-methylering geïnduceerde verstoring van binding van Sp1 zijn verwante bindingsplaats (22, 23). Bovendien zijn leden van de familie GATA aangetoond positieve regulatoren zijn van CLDN11
transcriptie [28]. Verdere studies zijn nu gerechtvaardigd om te evalueren of hypermethylering van deze sites interfereert met de binding van transcriptiefactoren, en hoe dergelijke verstoring van invloed kunnen zijn CLDN11
gentranscriptie.

Tumorcellen vertonen typisch structurele en functionele tekortkomingen in hun TJS [17]. Deze tekortkomingen worden geassocieerd met een verlies van polariteit en differentiatie. Een andere belangrijke schakel tussen TJS en kanker is een verlies van integriteit TJ, met als gevolg lekkage of het vervoer van pro-tumorigene stoffen (zoals groeifactoren en nutriënten) in de ontwikkeling van tumorcellen primordia, bevordering van tumorgroei [29]. Bovendien kan het verlies van polariteit, differentiatie en hechteigenschappen verbonden met verslechterde TJ functie kanker kritisch verwerven metastatische fenotype [30] zijn. Studies hebben gesuggereerd dat anomalieën in TJ-geassocieerde eiwitten epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) kunnen vormen, waardoor het invasieve karakter en de beweeglijkheid van kankercellen veranderen.

Modulaties in de expressie van TJ-geassocieerde eiwitten, in het bijzonder Claudin eiwitten, hebben is aangetoond in een aantal kankers. Recente studies door ons en anderen hebben aangetoond veranderingen in claudin eiwit regelgeving in verschillende epitheliale kanker [18]. Leden van de claudin genfamilie wordt uitgedrukt in een sterk weefselspecifieke, alsmede een ontwikkelingsstadium-specifieke wijze. Bovendien, afhankelijk van het type kanker, de expressie van eiwitten kunnen zowel claudin opgereguleerd of neerwaarts gereguleerd in kankercellen. Zo worden meerdere Claudin eiwitten opgereguleerd in colon-, eierstok-, pancreas- en prostaatkanker, terwijl sommige downregulated borstkanker en hoofd- en nekkanker [16], [18]

Studies hebben eerder gerapporteerd veranderingen in expressie profielen van leden van de familie claudin geassocieerd met GC. Seriële analyse van genexpressie (SAGE) identificeerden de CLDN18
gen als neerwaarts gereguleerd in GC bezit van een intestinale fenotype [31]. De CLDN23
gen is ook neerwaarts gereguleerd in de darm-type GC [32]. Omgekeerd Cunningham et al.
Gemelde CLDN4
expressie wordt verhoogd in intestinale metaplasie en epitheliale dysplasie maag, het identificeren van dit gen als marker van GC precursor laesies [33]. In de huidige studie, vonden we CLDN11
expressie die moet worden neerwaarts gereguleerd of tot zwijgen gebracht in GC via
hypermethylatie van zijn promotor regio. Bovendien vonden we dat in tegenstelling tot de CLDN18 Kopen en CLDN23
, CLDN11
expressie werd gedownreguleerd in GC patiëntspecimens evenals in cellijnen, ongeacht diffuse vs .
intestinale subtype.

Claudin-11, ook bekend als oligodendrocyten specifieke eiwit werd eerst geïdentificeerd specifiek worden uitgedrukt in de tight junction strengen van oligodendrocyten in de hersenen en in Sertoli cellen van ratten en muizen [ ,,,0],34], [35]. Verlies van claudin-11 expressie, wat leidt tot verstoring van de TJ barrière is geassocieerd met neurologische en reproductieve stoornissen [36]. Een recente studie gemeld overexpressie en mislocalisatie van CLDN11
van de bloed-testis barrière in Sertoli cellen geassocieerd te worden met de testis intra-epitheliale neoplasie bij mannen [37]. De gegevens in de huidige studie aantoont dat CLDN11
wordt uitgedrukt in normale maag weefsels en vereeuwigd NGECs. Echter, de volledige functies in normale maag en in maagkanker onduidelijk.

In een poging om de mogelijke betrokkenheid van staand CLDN11
in GC bestudeerden we fenotypische veranderingen geassocieerd met silencing van CLDN11
uitdrukking in CLDN11-
uiting van de maag epitheelcellen (HFE145). Zeer interessant, siRNA-gemedieerde knockdown van CLDN11
resulteerde in verhoogde celmotiliteit en invasie.

Eerdere studies hebben kankerspecifieke fenotypische veranderingen geassocieerd met modulaties claudin expressie in verschillende kankertypes gerapporteerd . Overexpressie van claudin-3 en claudine-4 eiwitten bij eierstokkanker cellijnen resulteert in toegenomen invasie door deze cellen [25]. In colonkanker, verhoogde expressie van claudine-1 is gerapporteerd, en veranderingen in claudine-1 expressie uitoefenen aanzienlijk groei van xenotransplantatie tumoren en metastasen in athymische naakt muizen [27]. Anderzijds is claudine-7 downregulatie in borstkanker geassocieerd met verhoogde cellulaire discohesion en het vermogen van borstkankercellen te verspreiden [19]. Bovendien experimenten in pancreas cellijnen toonden dat expressie van claudin-4 leidt tot een vermindering van invasiviteit, tumorvorming en metastatisch potentieel van deze cellen [38]. De redenen voor deze verschillen in kracht zijn momenteel onduidelijk, maar kan verband houden met weefsel-specifieke verschillen in claudin functie of zelfs variaties in de respons van verschillende cellijnen. Duidelijk, leden van de familie claudin bekend worden uitgedrukt in een weefsel-specifieke wijze en kunnen uiteenlopende effecten uitoefenen.

Hoewel in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat TJS en TJ-geassocieerde eiwitten hebben uitgebreide en diverse functionele en fysiologische activiteiten in normale en kankercellen omstandigheden, moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze activiteiten blijven onduidelijk. TJS zijn verfijnd intercellulaire inrichtingen kunnen werven signaaleiwitten, waarbij diverse cellulaire processen reguleren waaronder celgroei, differentiatie en tumorigenese [39], [40]. Claudin eiwitten rechtstreeks associëren met discrete signaaltransductiewegen door interactie met signaalmoleculen, zoals atypische eiwitkinase C en Rho-eiwitten, alsook met andere PDZ-domein bevattende eiwitten. Bij eierstokkanker, Claudins wijzigen tumorinvasie door het regelen van MMP-activiteit [25].

Samenvattend, de gegevens van de huidige studie identificeren CLDN11
als doelwit van epigenetische modificatie en veelbelovend biomarker voor maagkanker vroege detectie, diagnose en therapie. Deze bevindingen suggereren ook betrokkenheid van de CLDN11
downregulatie in carcinogenese via
bevordering van cel invasie en beweeglijkheid. De mechanismen voor dit fenomeen zijn onderworpen aan nader onderzoek.

Dankwoord

Wij danken Dr. Duane T Smoot voor zijn gulle gift van HFE145 cellen.

• PLoS Genetics: MiR-218 Remt Invasie en uitzaaiing van maagkanker door Gericht op de Robo1 Receptor
• PLoS Genetics: Oncogene Pathway Combinaties Voorspel klinische prognose Gastric Cancer