PLoS ONE: Epigenetische Silencing von miR-338-3p Trägt zur Tumorigenität in Magenkrebs durch SSX2IP Targeting

Abstrakt

MicroRNA wurde als spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Metastasierung vor kurzem anerkannt. Hier berichten wir, dass miR-338-3p epigenetisch bei Magenkrebs zum Schweigen gebracht wurde, und dessen Herunterregulation war signifikant mit Magenkrebs klinisch-pathologischen Eigenschaften korreliert. Auffallenderweise Wiederherstellung miR-338-3p Expression in SGC-7901 Magenkrebszellen gehemmt Proliferation, Migration, Invasion und tumorigenicity In-vitro-
und in vivo
, zumindest teilweise durch Induktion von Apoptose. Darüber hinaus zeigen wir das Onkogen SSX2IP ein Ziel von miR-338-3p ist. Wir schlagen vor, dass miR-338-3p Funktionen als Tumorsuppressor bei Magenkrebs, und der Methylierungsstatus der CpG-Insel als mögliche diagnostische Marker für Magenkrebs dienen könnte

Citation:. Li P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) epigenetische Silencing von miR-338-3p Trägt zur Tumorigenität in Magenkrebs durch SSX2IP Targeting. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10.1371 /journal.pone.0066782

Editor: Alfons Navarro, Universität Barcelona, ​​Spanien

Received: 17. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 10. Mai 2013; Veröffentlicht: 24. Juni 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie durch Zuschüsse von der National Natural Science Foundation of China (Zahlen 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 und 81272749), Wissenschaft und Technologie Kommission der Stadt Shanghai (Zahlen 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 und 101.409.042.000) unterstützt wurde, Shanghai Schlüsseldisziplin ( S30204) und Schlüsselprojekte in der National Science & Technologie Säulen-Programm von China (Zahlen 2008BA152B03 und 2011BA203191), China Postdoctoral Science Foundation (Nummer 2011M500796). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung von Manuskript

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Magenkrebs ist eine maligne Erkrankung mit hoher Inzidenz und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. Die frühe Diagnoserate von Magenkrebs ist gering, und die Patienten sind in der Regel nur schwer diagnostiziert werden, bis der Krebs in fortgeschrittenem Stadium oder Metastasen entwickelt hat. Daher ist es von großer Bedeutung, in die Tiefe durchzuführen Studie über die Pathogenese von Magenkrebs und für neue molekulare Entscheidungsträger und therapeutische Ziele zu suchen.

MicroRNAs sind kleine RNAs, die die Genexpression regulieren, und sie beteiligt sind, in einer Vielzahl von biologischen Signalwege [2]. Mehrere Studien haben signifikanten Unterschied von mikroRNAs Expression ergab Profilierungs zwischen Tumorzellen und normalen Geweben stammende Zellen, was darauf hinweist, dass microRNAs wichtige Rolle in der Tumorgenese gespielt haben [3], [4]. So hat MicroRNAs kürzlich ein Hotspot der genetischen Diagnostik und Therapie Ziel als neue Onkogene oder Suppressor-Gene [5], [6] werden. Abnormale Expression von microRNAs in Geweben oder Serum ist eng mit mehreren menschlichen Tumoren im Zusammenhang mit Magenkrebs [7], [8], und mehrere nach unten reguliert microRNAs bei Magenkrebs Gewebe Tumor Unterdrückung von Funktionen haben. Zum Beispiel wurde die Let-7-microRNA Familie zuerst als Repressor von RAS, Unterdrückung RAS und c-myc-Expression auf Translationsebene [9] gefunden. Das Expressionsniveau von let-7a wird deutlich in Tumoren des Magens reduziert, während Ras-Protein signifikant höher als bei Magentumor ist [10]. Außerdem miR-15b, miR-16 und miR-21 etc haben zur Entwicklung und klinischen Diagnose von Magenkrebs verbunden worden ist [11], [12]. Unsere Gruppe hat auch berichtet, die Anti-Krebs-Rolle der miR-126, miR-409-3p und miR-155 in Magenkrebs [13] - [15]

MicroRNA-Mikroarray wurde durchgeführt, um die miRNA-Profile im Magen zu erkennen. Krebs, und wir fanden, dass miR-338-3p war signifikant herunterreguliert (nicht veröffentlichte Daten). miR-338-3p, befindet sich auf Chromosom 17q25.3 mit einer Länge von 22 nt, wurde zum ersten Mal in Prionenneurodegeneration als Ausdruck von miR-338-3p berichtet wird, in die Gehirne von Mäusen reduziert infiziert mit Maus-adaptierten schaben [ ,,,0],16]. miR-338-3p könnte die mRNA-Ebene seines Wirtsgen Apoptosis-assoziierten Tyrosinkinase (AATK) in Rattenneuronen [17] regulieren. Auf der anderen Seite war miR-338-3p hochreguliert bei Patienten mit sporadischer amyotropher Lateralsklerose (sALS), eine andere Art von Nervensystems Läsionen [18]. Wichtig ist, wurde eine Rolle von miR-338-3p in tumorigenesis zuvor vorgeschlagen, wie miR-338-3p unten in Rektumkarzinom reguliert wird [19] und wird durch Hepatitis-B-Virus X-Protein (HBx) reguliert die Proliferation und Invasion zu verhindern, Hepatomzellen der durch Bindung Gene CyclinD1 und geglätteten in hepatozellulären Karzinoms Ziel [20] - [22]. Allerdings ist die Rolle der miR-338-3p in GC noch unbekannt.

In der vorliegenden Studie weiter wir die Herunterregulierung Expression von miR-338-3p in GC Gewebe im Vergleich zu den Patienten abgestimmt analysiert normalen Gewebe, und festgestellt, dass die Expression von miR-338-3p eng mit den klinisch-pathologische Variablen von GC korreliert. Die ektopische Expression von miR-338-3p hemmt die Proliferation, Invasion und Metastasierung von Magenkrebszellen, reduziert die tumorigenen Fähigkeit von Magenkrebszellen in Nacktmäusen und fördert die Apoptose. Wir zeigen auch, dass miR-338-3p als Tumorsuppressor durch direktes Targeting SSX2IP funktionieren. Somit legen unsere Ergebnisse nahe, dass miR-338-3p eine mögliche diagnostische Marker und therapeutisches Ziel von Magenkrebs ist.

Materialien und Methoden

1. Zelllinien und Kultur

Die menschlichen Magenkrebszelllinien SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 und AGS wurden aus Shanghai Institute erworben für Biologische Wissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften [23] - [26]. KATO-III und SNU-1 wurden von der ATCC (American Type Culture Collection) gekauft [24], [27], MKN28 und MKN45 wurden aus der Japanese Cancer Research Resources Bank erhältlich [28], die immortalisierten Magen Epithelzelllinie, GES -1, war ein Geschenk von Prof. Feng Bi (Huaxi Krankenhaus, Universität Sichuan, Chengdu, Provinz Sichuan, VR China) [29], [30]. HEK293T, menschliche Linie embryonale Nierenzelle wurde in unserem Institut erhalten. Die Magenkrebszelllinien wurden in RPMI1640 mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2. HEK293T-Zellen wurden in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) kultiviert oben mit der gleichen gezüchteten Zustand ergänzt.

2. Ethikerklärung

Eine schriftliche Einverständniserklärung der Studie wurde von allen Teilnehmern erhalten. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University genehmigt.

3. Gewebeproben

Primärmagenkrebsgewebe und die angepassten Nicht-Tumorgewebe wurden von 66 Patienten gesammelt radikalen Gastrostomie in der Abteilung für Chirurgie, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Keiner der Patienten erhielten eine präoperative Behandlung. Alle Gewebeproben wurden mit Patienten informierte Einwilligung erhoben und durch die pathologische Untersuchung bestätigt, und die histologische das Schreiben auf der Lauren-Klassifikation basiert. Die TNM-Klassifikation Definitionen wurden nach Angaben der Internationalen Union gegen Krebs (2002).

4. RNA-Isolierung und qPCR

Gesamt-RNA wurde aus Zelllinien und Gewebeproben isoliert von mir
Vana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Qualität und die Menge der RNA-Proben wurden durch Standard-Elektrophorese und spektrophotometrischen Methoden beurteilt. Das Expressionsniveau von miR-338-3p in Zelllinien und Gewebeproben wurde durch qPCR gemessen und berechnet, wie beschrieben [13]. Das Expressionsniveau der mRNA SSX2IP wurde durch qPCR nach der Expression Assays Protokoll (Applied Biosystems) TaqMan ® Gene gemessen. Die GAPDH mRNA-Ebene wurde zur Normalisierung verwendet.

5. DNA-Isolierung und der Methylierungsanalyse

genomischer DNA aus Gewebeproben wurde unter Verwendung von DNAzol (Invitrogen) gereinigt. Natriumbisulfit Umsatz wurde mit dem Qiagen EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) durchgeführt, nach Angaben des Herstellers. Die Methylierung Statuen wurde von Methylierungs spezifische PCR (MSP) durchgeführt. Die Primer für methylierte oder unmethylierte DNA wurden durch die Software Methyl Primer Express v1.0 (ABI) .Die Methylierungsvorwärtsprimer für die CpG von miR-338-3p entworfen: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 'und dem reversen Primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ', der unmethylation Vorwärtsprimer für die CpG von miR-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' und der Reverse-Primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 '

6.. Transiente Transfektion von miRNA-Mimetika

miRNA-338-3p imitiert und negative Kontrolle ahmt von Genepharma (Shanghai, China) .Cells gekauft wurden, wurden in der Zellkultur-Platten 20 h vor der Transfektion ausgesät in 70% Zellkonfluenz, um sicherzustellen, Moment der Transfektion. Die Transfektion von miRNA imitiert in Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamine2000 (Invitrogen) nach dem Verfahren des Herstellers. Die miRNA imitiert arbeitete in der Endkonzentration von 100 nM. Bei 48 h nach der Transfektion, qPCR und Western-Blot durchgeführt wurden.

7. Cell Proliferation Assay

Die Zellproliferation wurde durch WST (wasserlösliche Tetrazoliumsalz) Assay unter Verwendung eines Zellzählung Kit-8 (Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Bei 24 h nach der Transfektion mit miRNA imitiert, Zellen (2 × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung) wurden Samen in 96-Well-Platten. Die Platten wurden für 5 Tage inkubiert. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde durch Messung der Absorption bei 450 nm bewertet.}

8. Weichagar-Koloniebildungstest

GC-Zellen transfiziert mit miRNA-Mimetika mit 0,3% Weichagar in RPMI1640 resuspendiert wurden 10% FBS enthält, und überlagert auf 0,6% Agar in RPMI1640 verfestigte 10% FBS in 6-Well-Platten, enthaltend (1 × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung). Die Platten wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 inkubiert. Kolonien mindestens 50 Zellen enthielten, wurden gezählt.}}

9. Zellmigration und Invasion Assay

Migration von Zellen wurde unter Verwendung von QCM ausgeführt ^{TM24-Well Colorimetric Migration Assay Kit (Millipore) nach Herstellerangaben. Für den Invasionstest, Cell Invasion Assay Kit (Millipore) wurde gemäß den Herstellerangaben verwendet. Zellen (1 × 10 5) in 300 &mgr; l serumfreiem Medium zu den oberen Kammern wurden hinzugefügt und kultiviert für 48 Stunden. Nicht migrierenden oder nicht-eindringenden Zellen wurden mit Baumwolltupfer entfernt, die Zellen, die an der Unterseite der Membran gewandert oder eingedrungen wurden mit dem Zell stain Puffer in dem Assay-Kit zur Verfügung gestellt und unter dem Mikroskop gezählt und photographiert gefärbt. Drei unabhängige Experimente wurden für den gleichen Bedingungen durchgeführt.}

10. Apoptosis Analyse

Zell-Apoptose-Analyse wurde mit Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD) vorgeformten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Jeder Test wurde in dreifacher Ausfertigung und wiederholt dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Das Merkmal der Kern Schrumpfung mit Apoptose assoziiert wurde von Hoechst 33342 (Beyotime) zeigte nach dem Protokoll.Verfahren Morphologie durch ein Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurde, die bei einer Wellenlänge von 350 nm und gemessen bei 460 nm angeregt wurde.

11. Konstruktion von Plasmiden und Luziferase-Aktivitätstest

Das Fragment der Wildtyp (wt) 3'UTR von SSX2IP oder Webseiten-Mutante (mut) 3'UTR von SSX2IP die mutmaßliche miR-338-3p enthält Bindungsstellen wurden synthetisiert . Die Fragmente wurden kloniert in den PMIR-Report Luciferase-Vektor (Ambion) mit Firefly
und PMIR /SSX2IP-3'UTR ^{wt und PMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells benannt wurden Saatgut in den Platten mit 24 Vertiefungen 24 h vor der Transfektion. 500 ng PMIR /SSX2IP-3'UTR wt oder PMIR /SSX2IP-3'UTR mut wurden in jede Vertiefung transfiziert, zusammen mit 20 ng pRL-TK-Vektor (Promega) mit Renilla
Luciferase und 60 pmol der miR-338-3p oder Kontrolle imitiert. Die Zellen wurden nach 48 h der Transfektion geerntet. Firefly
und Renilla
Luciferase-Aktivitäten wurden unter Verwendung von Dual-Luciferase-Reporter-Assay (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.}

12. Stabile Transfektion von miR-338-3p Expression Vector

pSilencer-miR-338-3p Vektor und pSilencer-miR-Steuervektor in SGC-7901-Zellen transfiziert wurde jeweils unter Verwendung von Lipofectamine2000 (Invitrogen) und ausgewählt mit 100 ug /ml B (Invitrogen) 4 Wochen lang Hygromycin. Stabil transfizierte Zellklone wurden in der Hälfte der Auswahl Konzentration gepickt und gehalten.

13. Tumorxenotransplantates Modell

SGC-7901-Zellen (2 × 10 ^{6 Zellen /Maus) stabil mit pSilencer-miR-338-3p oder pSilencer-Steuervektor wurden in subkutan injiziert 4-Wochen alten männlichen Nacktmäuse (Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China) .Die Mäuse wöchentlich überprüft wurden, wurden die Tumorknoten mit einer Schieblehre gemessen. Die Mäuse wurden 4 Wochen nach der Injektion eingeschläfert, und die Tumore wurden entfernt und gewogen. Das Tumorvolumen wurde anhand der folgenden Formel ausgewertet:. Volumen = (Breite + Länge) /2 × Breite × Länge × 0.5236.Tumor Wachstumskurven berechnet wurden}

14. Immunhistochemie

Der Nachweis von SSX2IP wurde auf Paraffinschnitten durchgeführt mit dem Anti-SSX2IP Antikörper (Abcam, Verdünnung 1:1000). Der Immunkomplex wurde mit dem Dako REAL visualisiert ^{TMEnVision ™ Detection System, Peroxidase /DAB, Kaninchen /Maus (Dako), gemäß dem Verfahren des Herstellers. Die Kerne wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.}

15. Statistische Analyse

Die Beziehung zwischen der miR-338-3p Expressionsniveau und klinisch-pathologische Parameter wurde von der Person analysiert X
^{2-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des Student analysiert t
Test. Alle statistischen Analysen wurden mit Hilfe der SPSS 13.0 Software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt wird, und P
< 0,05 wurde als signifikant angesehen}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Postoperative Radiochemotherapie im Vergleich zu postoperativen Chemotherapie für vollständig reseziert Magenkrebs mit D2 Lymphadenektomie: Eine Meta-Analysis
• PLoS ONE: Die miR-184 Binding-Site-rs8126 T > C Polymorphismus in TNFAIP2 ist im Zusammenhang mit Risiko von Magen Cancer