Plos ONE: Epigensko dušenje zvoka miR-338-3p Prispeva k tumorogenosti želodčnega raka, ki ga ciljanje SSX2IP

Povzetek

MicroRNA je bila nedavno priznana kot igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze in metastaz. Tu poročajo, da je bil miR-338-3p epigenetically utišani pri raku želodca in njeno navzdol uredba je bila močno povezana z rakom želodca clinicopathological funkcije. Presenetljivo, obnavljanje miR-338-3p izraz v SGC-7901 z rakom želodca celic inhibira proliferacijo, migracijo, invazijo in tumorogenosti in vitro
in in vivo
, vsaj delno skozi inducira apoptozo. Poleg tega smo prikazali onkogena SSX2IP je cilj miR-338-3p. Predlagamo, da bi miR-338-3p deluje kot supresorski tumorjev pri raku želodca in metilacijskega statusa otoku CpG služi kot potencialno diagnostično označevalca raka želodca

Navedba. Li P, Chen X, su L, Li C Zhi Q Yu B, s sod. (2013) Epigensko dušenje zvoka miR-338-3p Prispeva k tumorogenosti želodčnega raka z usmerjanjem SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

Urednik: Alfons Navarro, Univerza v Barceloni, Španija

Prejeto: 17. januar, 2013; Sprejeto: 10. maj 2013; Objavljeno: 24. junij 2013

Copyright: © 2013 Li et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (številk 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 in 81272749), znanost in tehnologijo komisije občine Shanghai (številke 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 in 101409042000), Shanghai Key disciplini ( S30204), in ključni projekti v National Science & Tehnologija steber Program Kitajske (številke 2008BA152B03 in 2011BA203191), Kitajska Podoktorski Science Foundation (število 2011M500796). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da niso konkurenčni interesi obstajajo

Uvod

rak želodca je malignosti z visoko incidenco in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po svetu [1]. Zgodnja diagnostika stopnja raka želodca je nizka, in bolniki so običajno težko diagnosticirati, dokler se je rak razvil v končni fazi ali metastaz. Zato je zelo pomembno, da opravi poglobljeno študijo o patogenezi raka želodca in iskati novih molekularnih oblikovalcev in terapevtskih ciljev.
MicroRNAs so majhne RNA, ki uravnavajo izražanje genov, in so vključeni

v različnih bioloških poti signalizacije [2]. Več študij je pokazalo, da je razlika microRNAs izražanja profiliranje med tumorskih celic in celic, pridobljenih iz zdravega tkiva, kar pomeni, da so microRNAs igral pomembno vlogo v tumorigeneze [3], [4]. Tako je MicroRNAs pred kratkim postala dostopna točka genetske diagnostike in cilje zdravljenja, kot novega onkogeni ali genih, zaviralcih [5], [6]. Nenormalno izraz microRNAs v tkivih in serumu je tesno povezana s številnimi človeškimi malignih bolezni, vključno z rakom želodca [7], [8], in več navzdol regulirane microRNAs v želodcu tkivih z rakom imajo tumorske zatiranja funkcije. Na primer, je bil Let, 7 microRNA družina najprej ugotovila, kot represorju za RAS, zatiranje RAS in c-myc izraz na translacijskih ravni [9]. Stopnja izraz Naj-7a se bistveno zmanjša v želodčnih tumorjev, medtem ko Ras protein je bistveno višja pri tumorja želodca [10]. Poleg tega so bili miR-15b, miR-16 in miR-21 itd povezana z razvojem in klinično diagnozo raka želodca [11], [12]. Naša skupina je poročala tudi vlogo proti raku miR-126, miR-409-3p in miR-155 z rakom želodca [13] - [15]

MicroRNA mikromrež je bila izvedena za odkrivanje profilov Mirne želodca. rak, in smo ugotovili, da je miR-338-3p občutno navzdol regulirano (neobjavljeni podatki). miR-338-3p, ki se nahaja na kromosomu 17q25.3 z dolžino 22 nt, je bila prvič poročali v-prionov povzročene nevrodegeneracije kot izraz pokoj-338-3p se zmanjša v možganih miši, okuženih z mišjim prilagojeno povzetkih [ ,,,0],16]. miR-338-3p lahko uravnavajo raven mRNA svojih genov gostitelja Apoptoza, povezano tirozin-kinaza (AATK) pri podganjih nevronov [17]. Po drugi strani pa je miR-338-3p navzgor regulirano pri bolnikih s sporadičnimi amiotrofično lateralno sklerozo (loge), druga vrsta živčnega sistema lezij [18]. Pomembno je, da vloga miR-338-3p v tumorigeneze je že predlagala, saj je miR-338-3p navzdol urejeno z rakom danke [19], ki jo ureja hepatitis B virus X beljakovin (HBx), da zavira proliferacijo in invazijo od hepatomom celic z vezavo za ciljanje genov CyclinD1 in gladka v karcinomom jetrnih celic [20] - [22]. Vendar pa je vloga pokoj-338-3p v GC še ni znan.

V tej študiji smo dodatno analizirali down-regulacije izražanja v Mira-338-3p v GC tkiva v primerjavi z ambulantnim ujema normalno tkiva, in ugotovili, da je nivo izražanja miR-338-3p tesno povezana s clinicopathologic spremenljivk GC. Ektopična ekspresija miR-338-3p zavira proliferacijo, invazijo in metastaze želodčnih rakavih celic, zmanjšuje tumorogeno sposobnost želodčnih rakavih celic v golih miših, ter spodbuja apoptozo. Prav tako smo pokazali, da lahko miR-338-3p deluje kot zaviralnih neposredno ciljanje SSX2IP. Tako, naši rezultati kažejo, da je miR-338-3p potencialno diagnostično dvojno podajo in terapevtski cilj raka želodca.

Materiali in metode

1. Celične linije in kultura

Linije človekovih želodčni rak celic SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 in AGS so bile kupljene od Shanghai inštituti za biološke znanosti, kitajske akademije znanosti [23] - [26]. KATO-III in snu-1 so bile kupljene iz ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 in MKN45 so bili pridobljeni iz japonske Cancer Research virov banke [28], je ovekovečil želodca epitelijskega linije, GES -1, je bil darilo od prof Feng Bi (Hospital Huaxi, Sichuan University, Chengdu, v provinci Sečuan, PR Kitajska) [29], [30]. HEK293T, človeške embrionalne ledvične celično linijo, se je ohranila v našem zavodu. Želodčni rak celične linije smo kultivirali v RPMI1640 dopolnjenem z 10% FBS (fetalni goveji serum) pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO2. HEK293T celice gojimo v DMEM (Dulbecco modificirana srednje Eagle) dopolni z istim kulturnega stanja zgoraj.

2. Etika Izjava

Pisna privolitev v študiji je bila pridobljena iz vseh udeležencev. Protokol študije je odobril odbor za etiko bolnišnice Ruijin, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

3. Tkivo Vzorci

Primarni želodčni rak tkiva in izravnana non-tumor tkiva so bili zbrani iz 66 bolnikih z radikalno gastrostomo na oddelku za kirurgijo, Bolnišnica Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Nobeden od bolnikov je prejelo preoperativno zdravljenje. Vse vzorce tkiva so bili zbrani s privolitev bolnikov in potrjeno s patološkim pregledom in histološko tipkanje je temeljila na razvrstitvi Lauren. Opredelitve, klasifikacijske TNM so po Mednarodne zveze za boj proti raku (2002).

4. RNA Isolation in qPCR

Total RNA smo izolirali iz celic in tkivnih vzorcev, ki jih mir
Vana ™ Mirna Izolacija Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Kakovost in količina vzorcev RNA smo ocenili s standardno elektroforezo in spektrofotometričnih metod. Nivo izražanja miR-338-3p v celičnih linijah in vzorce tkiva smo merili s qPCR in se izračuna kot je opisano [13]. Nivo izražanja SSX2IP mRNA smo izmerili s qPCR po TaqMan® Gene Expression testih protokola (Applied Biosystems). Stopnja GAPDH mRNA je bila uporabljena za normalizacijo.

5. DNK Izolacija in Metiliranje Analiza

Genomsko DNA iz vzorcev tkiva smo očistili z uporabo DNAzol (Invitrogen). Natrijev bisulfit pretvorba je bila izvedena s pomočjo Qiagen Epitect bisulfit Kit (Qiagen) skladu z navodili proizvajalca. Metilacije kipi so opravili metilacije specifične PCR (PPN). Primerji za metiliranega ali nemetiliran DNK je oblikoval programsko opremo metil Primer Express v1.0 (ABI) .The metilacija naprej premaz za CPG Mir-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 "in obrnjene temeljni premaz: 5 ' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ", je unmethylation naprej premaz za CPG mir-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3 'in obratno primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3'

6.. Prehodna Transfekcija miRNA Posnema

so bile kupljene od GenePharma (Šanghaj, Kitajska) .Cells Mirna-338-3p posnema in negativne kontrole posnema smo posejali v celične kulture plošče 20 ur pred transfekciji zagotoviti 70% sotočje celico na trenutek transfekciji. Transfekciji Mirna posnema v celicah je bila izvedena s pomočjo Lipofectamine2000 (Invitrogen), v skladu s postopkom proizvajalca. Mirne posnema delal na končno koncentracijo 100 nM. Ob 48 h post-transfekciji smo izvedli qPCR in Western blot.

7. Celično proliferacijo Vsebnost

proliferacije celic smo ocenili s WST (vodotopna tetrazolij sol) test z uporabo štetje celic Kit-8 (Dojindo) po navodilih proizvajalca. Ob 24 h post-transfekciji z miRNA posnema, celic (2 x 10 ^{3 celic /vdolbinico) so semena v 96 vdolbinami. Plošče inkubiramo 5 dni. Število živih celic smo ocenili z merjenjem absorbance pri 450 nm.}

8. Mehko Agar kolonija Formation Vsebnost

GC celice transficirane z miRNA posnema smo ponovno suspendirali v 0,3% mehkega agarja v RPMI1640 vsebuje 10% FBS in večplastna na 0,6% strjen agar v RPMI1640, ki vsebuje 10% FBS v 6 vdolbinami (1 × 10 ^{3 celic /jamico). Plošče smo inkubirali pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO _{2. Kolonije, ki vsebujejo najmanj 50 celic so bili prešteti.}}

9. Cell migracije in Invasion Vsebnost

migracija celic je bila izvedena z QCM ^{TM24-No Kolorimetrijska migracije Test Kit (Millipore), v skladu z navodili proizvajalca. Za invazijo testu smo celice invazijo Vsebnost Kit (Millipore), uporabljene v skladu z navodili proizvajalca. Celice (1 x 10 5) v 300 ul smo medij brez seruma dodamo k zgornji komorah in kultiviramo 48 ur. Non-prehajajo ali celice, ki niso iz preplavljajo smo odstranili z bombaž brisi, celice, ki preselile ali vdrli na dno membrane so obarvanih s celičnimi madežev pufrom priloženim v kompletu testa in šteta pod mikroskopom in fotografirali. Tri neodvisne poskuse smo izvedli pri enakih pogojih.}

10. Apoptoza Analiza

Analiza Cell apoptoza je bila izvedena z aneksin FITC-apoptoza Detection Kit I (BD), v skladu z navodili proizvajalca. Vsak test je bil izveden v trojniku in ponovili trikrat neodvisno. Značilnost jedrske krčenja, povezanih z apoptozo je pokazala Hoechst 33342 (Beyotime) glede na morfologijo protocol.The smo vizualizirali s fluorescentnim mikroskopom, ki je bil na vzbujanje na valovno dolžino 350 nm in izmerjene pri 460 nm.

11. Gradnja plazmidov in luciferazno aktivnost Vsebnost

fragment divjega tipa (WT) smo sintetizirali 3'UTR SSX2IP ali območij mutant (Mut) 3'UTR SSX2IP vsebuje domnevnega MIR-338-3p zavezujoč mesta . Fragmenti so klonirane v pMIR-poročilo luciferazno vektorja (Ambion), ki vsebuje Firefly
in poimenovali pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{ut in pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells bilo seme v 24-vdolbinami od 24 h pred transfekcijo. 500 ng pMIR /SSX2IP-3'UTR mas ali pMIR /SSX2IP-3'UTR mut transfektirali v vsaki dobro skupaj s 20 ng PRL-TK vektor (Promega), ki vsebuje Renilla
luciferaza in 60 pmol miR-338-3p ali nadzora posnema. Celice smo zbrali po 48 h transfekciji. Firefly
in Renilla
luciferazne aktivnosti so bile izmerjene z uporabo Dual-luciferaza novinar testa (Promega) v skladu z navodili proizvajalca.}

12. Stabilno Transfekcija miR-338-3p izražanja Vector

pSilencer-miR-338-3p vektor in pSilencer-miR-nadzor vektorja smo transfektirali v SGC-7901 celic oziroma uporabo Lipofectamine2000 (Invitrogen) in izbrali s 100 ug /ml higromicin B (Invitrogen), 4 tedne. Stabilno transficirane celične klone zberemo in vzdržuje v polovici koncentracije izbire.

13. Tumorskega ksenotransplantata Model

SGC-7901 celic (2 x 10 ^{6 celic /miš) stabilno transfektirane s pSilencer-pokoj-338-3p ali pSilencer kontrolo vektorja so subkutano injicirali v 4 tednov starega moškega golih miši (inštitut za zoologijo, kitajske akademije znanosti, Shanghai, Kitajska) .The miši so bile pregledane na teden, so tumor vozlički merijo s šestilom. Miši smo evtanazirali 4 tedne po injekciji in tumorji smo odstranili in stehtali. volumen tumorja je bila ocenjena z uporabo naslednje formule:. Volumen = (širina + dolžina) /2 × širina dolžina × × 0.5236.Tumor krivulje rasti je bilo izračunano}

14. Imunohistokemija

Odkrivanje SSX2IP je bila izvedena na parafinskih odsekih z anti-SSX2IP protitelesa (Abcam, redčenje 1:1000). Imunski kompleks smo vizualizirali s Dako REAL ^{Sistem TMEnVision ™ Detection, peroksidaze /DAB, Rabbit /Mouse (Dako), v skladu s postopkom proizvajalca. Jedra so jih nasprotno s hematoksilinom.}

15. Statistična analiza

Razmerje med miR-338-3p ravni izražanja in clinicopathologic parametrov smo analizirali s strani osebe, X
^{2 testa. Razlike med skupinami smo analizirali s Študent t
testa. Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo programa SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, ZDA) in P
< 0.05 je zdelo pomembno}

Rezultati

1. . Izražanje miR-338-3p je Dol-urejeno v GC celičnih linijah in tkiv

Če želite raziskati vlogo pokoj-338-3p v PK, smo najprej primerjali stopnjo ekspresije pokoj-338-3p v osem želodčne linije rakava celica z imortalizirana normalno želodčne sluznice celične linije epitelnega (GES-1). Kot je prikazano na sliki. 1A, miR-338-3p je močno zmanjšalo, urejena v celičnih linijah GC primerjavi z GES-1. Za potrditev tega rezultata, smo primerjali tudi izraze pokoj-338-3p v GC tkiv in sosednjih non-tumorskih tkivih. 66 GC paru vzorci so bili vključeni v to študijo. Rezultati kažejo, da je bila povprečna stopnja izraz miR-338-3p močno navzdol reguliranim v tumorskih tkivih v primerjavi s sosednjima ne tumorskih tkiv (sl. 1B). Poleg tega smo pojasnili povezavo med miR-338-3p izražanja in clinicopathologic dejavnikov. Kot je prikazano v tabeli 1. 59,1% (39/66) vzorcev GC pokazala navzdol ureditev pokoj-338-3p spodaj dvojni svetlo-temno (relativni izraz razmerje < 0,5), je bilo to šteje za znatno zmanjšanje -regulated. Na podlagi te svetlo-temno, so 66 klinični primeri razdelimo v dve skupini: miR-338-3p nižja izraz skupina (n = 39) in miR-338-3p višja izraz (n = 27). Spodnji izraz skupina pokazala nagnjenje k večji velikosti tumorja, več bezgavkah metastaze, globlje lokalne invazije in bolj fazi TNM, ne pa tudi značilni korelaciji s starostjo, spolom ali histološki tip (tabela 1).

2. miR-338-3p je Epigenetically Tihi želodčnega raka

Ker je epigenetsko utišanje pogosta sredstvo za down-regulacijo miRNA izražanja [31], [32], smo se odločili za analizo porazdelitve CpG otok promotor regija pokoj-338-3p s strani programske opreme metil Primer Express v1.0. Rezultati so pokazali, da obstajajo CpG otokov v oddelku (-690 do -241) gorvodno od začetnim mestom transkripcije (TSS). preučil smo metilacijskega statusa CpG otokov v promotorski regiji, ki jo metilacije specifične PCR (PPN), ki pokriva območje -366 do -576 (sl. 2A). Z uporabo PPN smo ugotovili, da je miR-338-3p otok CpG obširno metiliramo v celičnih linijah GC primerjavi v želodčne sluznice celične linije epitelnega (GES-1). Kot je bilo pričakovati, zdravljenje s 5-aza povzroča znatno demetilacijo (sl. 2B). Reprezentativne rezultate PPN analize miR-338-3p v GC tumorskih tkiv in izravnanih sosednjih non-tumorskih tkiv so bili prikazani na sl. 2C. Stopnje metilacije Mir-338-3p CpG otokov v tumorskih tkivih in sosednjih non-tumorskih tkiv pri bolnikih 66 GC bilo 78,79% in 24,24%, v tem zaporedju (** P
. ≪ 0,01, slika 2D) . Ko smo izračunali sprejemnika Značilnosti delovanja krivulje in površina pod krivuljo (AUC) za metiliranega statusa pokoj-338-3p v PK, je bil AUC 0,773 ± 0,042, kar je precej višja od ničelne hipoteze ( P <
0,001), in 95% interval zaupanja je bil 0,690 do 0.856 (sl. 2E). Tako bi bilo mogoče status metilacija miR-338-3p otoku CpG služijo kot potencialni molekularni označevalec GC.

3. miR-338-3p Zavira želodca rakavih celic orožja

Ker miR-338-3p občutno navzdol urejeno v GC, kot je prikazano zgoraj, lahko delujejo kot zaviralnih. Zato smo poleg ugotoviti, ali lahko prekomerno miR-338-3p v želodcu rakavih celic vpliva na rast celic. Sintetična miR-338-3p posnema ali negativne kontrole posnema transfektirali v SGC-7901 celic, v katerih je stopnja izraz MIR-338-3p najnižji, sledijo WST testom za spremljanje rasti celic.

zunajmaternične izraz pokoj-338-3p v SGC-7901 celic je bila potrjena s qPCR in SGC-7901 celic transfekciji z miR-338-3p posnema rasli bistveno počasneje kot v kontrolni skupini (sl. 3A) (* P
< 0,05, ** P <
0,01). Za nadaljnjo opredelitev učinek pokoj-338-3p na rast celic, je soft-ager tvorbe kolonij test opravili. Ugotovili smo, da je bilo število kolonij iz SGC-7901 celic, transfektiranih s miR-338-3p posnema bistveno manj kot pri kontrolni skupini (slika 3B-C.) (** P
< 0,01) . Dosledno, zaviranje miR-338 povzroča širjenje SGC-7901 (slika S2 v datoteke S1, * P
. ≪ 0,05). Podobni rezultati so bili v kontrolni ges-1 celic opazili (. Fig S1 A-B datotek S1, * P
< 0,05). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da miR-338-3p zavira rast obeh GC celic in epitelijskih celic želodca v
vitro.

4. miR-338-3p zavira migracije in Invazija GC celice in vitro

Glede na idejo, da miR-338-3p služi kot zaviralnih GC, smo podrobneje preučiti njegove učinke na migracije in invazijo celic, kritična determinate malignega napredovanje in metastaz. Kot je prikazano na sliki. 4, je bilo število migracijskih SGC-7901 celic, transfektiranih s miR-338-3p posnema bistveno manj kot v kontrolni skupini (105,00 ± 11.16 vs 145,00 ± 7,00, ** P
. ≪. 0,01 Slika 4 A-B), in število invazivnih SGC-7901 celic, transfektiranih s miR-338-3p je bistveno manj v primerjavi s kontrolno skupino (41,33 ± 4,04 v primerjavi z 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. Sl. 4 C-D). Dosledno, zaviranje miR-338-3p povzroča migracije in invazije SGC-7901 celic (slika S3 v datoteke S1, * P
. ≪ 0,05). Nasprotno pa je bilo miR-338-3p nima vpliva na migracijo ges-1 (sl. S1 E v Datoteka S1), verjetno zato, ker celice GES-1 nimajo migracije in invazivne narave rakavih celic. Ti rezultati so pokazali vlogo pokoj-338-3p pri zaviranju tako migracije in invazije GC celic.

5. miR-338-3p lahko povzroči želodčne rakavih celic, apoptoza

Za pojasnitev mehanizma pokoj-338-3p o rasti GC celic zaviralne učinke, smo testirali analizo apoptoze s pretočno citometrijo. Rezultati so pokazali, da je bila apoptotske stopnja v miR-338-3p posnema transfektirane skupine znatno povečal v primerjavi s kontrolo posnema transfektirane skupino (** P
< 0,01) (. Slika 5A-B). Mi še preučila značilnosti morfološke apoptoze, vključno z zgoščeno kromatina in jedrske razdrobljenosti ga Hoechst 33342 barvanja, in potrdil, da je bil apoptotske mera v miR-338-3p posnema transficirane celice (sl. 5c) povečala. Dosledno, zaviranje miR-338 blokiranem apoptozo SGC-7901 celic (slika S4 File S1, * P
. ≪ 0,05). Podobni rezultati so bili v nadzornih GES-1 celicah opazili (. Slika S1 C-D v datoteke S1, ** P
< 0,01). Ti rezultati so pokazali, da prekomerno miR-338-3p inducira apoptozo v GC celic, ki bi lahko prispevale k rasti inhibitornih lastnosti pokoj-338-3p.

6. miR-338-3p Zavira tumorogenosti in poveča apoptozo in vivo

Naslednja testirali, ali bi zunajmaternične izraz pokoj-338-3p vplivajo na rast in apoptozo tumorja želodca in vivo .
SGC-7901 celice smo transfektirali z mIR-338-3p izražanja vektor (p Silencer
-miR-338-3p) ali nadzor vektor (p Silencer
-miR -nadzorovalnik). Stabilne kloni z eno p dušilec zvoka
-miR-338-3p ali p Silencer
so -miR-control izbrani in injiciramo subkutano v golih miših, in nastanek tumorja je spremljala. SGC-7901 transfektiranih s pokoj-nadzora je pokazala postopno rast, ki pa je bila inhibicija kadar zunajmaternično izraz pokoj-338-3p. Po 28 dneh smo evtanazirali v golih miši, in smo izmerili tumorske uteži in volumen (sl. 6 A-E). Povprečna teža tumorjev, ki izhajajo iz pSil encer
-miR-338-3p celice skupina je precej manj kot tumorji iz p Silencer
-miR-kontrolnih celicah skupina (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229.52 mg, ** P
. < 0,01)

da bi preverili, ali apoptoza prispeva k temu opaziti vivo
zaviranje rasti tumorja na pokoj-338-3p več -expression je TUNEL test izvedemo v tumorskih tkivih. Rezultati so pokazali, da je tumor tkiva iz p Silencer
-miR-338-3p vsebuje bistveno bolj pozitivno barvanje celic v primerjavi s kontrolno skupino (** P
. ≪ 0,01, slika 6F-G ). Tako, naši rezultati so pokazali, da miR-338-3p zavira želodčne tumorigeneze in vivo
, vsaj delno z indukcijo apoptoze in situ.

7. miR-338-3p Cilji 3'-UTR v onkogena SSX2IP

Kot miRNAs pogosto regulira izražanje tarčnih genov, smo iskali domnevna cilje MIR-338-3p je s pomočjo spletnih iskalnikov (npr TargetScan, Microrna.org in PicTar). Geni vseh uporabljenih programov Napovedane so bile upoštevane ciljev kandidatke Mir-338-3p. Med vsemi zadetkov, SSX2IP povzroča našo pozornost, prejšnje študije pokazale, da je SSX2IP akutno mieloidno levkemijo povezan antigen in potencialna tarča imunoterapija za levkemijo [33] - [35] in naše prejšnje delo je pokazalo, da SSX2IP spodbuja invazijo in prenos karcinomom jetrnih celic in prispeva k odpornosti kemoterapije [36].

Ena od možnih miR-338-3p vezavno mesto je bilo napovedano v 3'UTR SSX2IP (sl. 7A). Za potrditev tega vzajemnega delovanja, smo se divjim tipom ali mutirani 3'UTR fragment SSX2IP v pMIR-POROČILO luciferazne vektorja. Dobljene konstrukti so bile sočasno transfektirali z miR-338-3p posnema ali nadzorni posnema v HEK293T celic, čemur sledi luciferazni reporterskega testa. Relativna luciferazno aktivnost pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{mas, vendar ne pMIR /SSX2IP-3'UTR mut, je pomembno zavirajo pokoj-338-3p (** P
<.. 0,01) v primerjavi s kontrolno posnema (slika 7b), kar kaže, da miR-338-3p neposredno veže na 3'UTR SSX2IP, da deluje kot supresorski}

Naslednja preučila vpliv miR-338-3p na izražanje SSX2IP, z merjenjem ravni mRNA in proteinskih SSX2IP po transfekcijo SGC-7901 celic z miR-338-3p ali nadzora posnema. Kot je prikazano na sliki. 7C-D, je bilo miR-338-3p ne vpliva na SSX2IP
ravni mRNA, merjena s qPCR, je pa povzročil znatno zmanjšanje ravni SSX2IP beljakovin v primerjavi z nadzorne transfekcije. Ti rezultati kažejo, da miR-338-3p zavira izražanje SSX2IP na post-transkripcijski ravni, najverjetneje z vezavo na 3'UTR SSX2IP. Predvsem pa smo tudi ugotovili, da capase-3 in procasepase-3, dva pomembna apoptosis geni, so bili ustrezno zmanjšala (sl. 7C).

8. Izražanje miR-338-3p je v obratnem sorazmerju s stopnjo izražanja SSX2IP beljakovin želodčnega raka

miR-338-3p je navzdol ureja raka želodca in SSX2IP je podprt na ciljni gen miR-338 -3p, da spodbuja nas, da špekulirajo, da bi lahko SSX2IP prekomerno v želodčnih tkivih raka in glede na ujema non-tumorskih tkivih.

Imunohistokemično analiza SSX2IP antigena pokazala stanje barvanjem za SSX2IP beljakovin v tumorskih tkivih in uskladiti non-tumor tkiva v 66 želodca raka samples.65% (43/66) v želodcu tkiv raka prikaže povišan immuostaining za SSX2IP beljakovin v primerjavi z ujemanjem non-tumorskih tkivih. Zlasti 84% (31/37) želodčnih tkiv rakom prikazani zvišanega imunskim barvanjem v vzorcih GC na miR-338-3p nizke ekspresije skupino, medtem ko so podatki 41% (12/29) v miR-338-3p visoko ekspresijo skupina. Tako je analiza izražanja miR-338-3p in SSX2IP v želodčnih tkiva raka potrdila obstoj inverzne povezave med izražanjem pokoj-338-3p in njenega ciljnega gena SSX2IP (oseba hi-kvadrat test: P
< 0,001, Spearman Korelacija: r = -0,442, P
< 0,001, slika 8)

9... Zunajmaternična Izražanje SSX2IP reorganizacije v fenotipov s prekomerno proizvodnjo MIR-338-3p v GC celice

Če SSX2IP je glavni cilj, ki ga pokoj-338-3p v PK zatreti, bi zunajmaternične izraz SSX2IP reševanje fenotipov povzročile s pokoj-338-3p povzročil nad proizvodnjo v GC celicah. Če želite preizkusiti to idejo, in SSX2IP izražanje vektor ali prazen vektor posamično transfektirali v SGC-7901, nato pa citoloških testih za merjenje proliferacije celic, migracijo, invazijo in apoptozo. Kot je bilo pričakovati, čezmernim SSX2IP delno ali popolnoma obrne inhibitornega učinka miR-338-3p v GC celicah za vsak vidik smo pregledanega (sl. 9 A-D). Po drugi strani, SSX2IP nima vpliva na izražanje pokoj-338-3p (sl. S5 v Datoteka S1). Tako smo ugotovili, da je funkcija rak supresorski miR-338-3p v GC vsaj delno skozi zatirati svoje tarčnega gena SSX2IP.

Pogovor

V tej študiji smo ugotovili, da je nizka -expression miR-338-3p je klinično povezana z večjo velikost tumorja, več bezgavkah metastaze, globlje lokalne invazije in poznejši fazi TNM. Na PAP citološki ravni, up-regulacijo miR-338-3p blokiranem orožja, nastanek družin, invazijo in migracije želodca rakavih celic. Poleg tega pretirano izražanje miR-338-3p v želodčnih rakavih celic znatno zmanjšala tumorigeneze v golih miših in vivo
. Skupaj, naši rezultati jasno kažejo na tumor dušenje vlogo pokoj-338-3p za raka želodca.

MiRNAs so bile nedavno priznane kot ključnih regulatornih dejavnikov, povezanih s tumorji. Čeprav je regulativni mehanizem miRNAs izražanja v tumorigeneze je še vedno nejasno, je epigenetsko ureditev predlagala, da igrajo pomembno vlogo [31], [32]. DNA metilacija pojavlja predvsem v otoku CpG običajno nahaja v promotorski regiji gena, približno 70% od promotorja regij v človeškem genomu je bogata otoku CpG [37]. Znižane izrazi pokoj-34b, MIR-129 in pokoj-10b jih hypermethylation vse povzroča v promotorjev [38], [39]. V skladu s tem pojmom, je bila raven metilacija otoka CpG Mir-338-3p v želodcu tkivih raka dejansko ugotovljeno, višja od tiste, ki se ujemajo sosednjih non-tumorskih tkivih, kar kaže, da je miR-338-3p epigenetically utišani v GC. Vzrok za to epigenetske molka pokoj-338-3p raka želodca še vedno težko, zato domnevajo, da lahko dejavniki, kot CagA, ki je bil pred tem poročali, da epigenetically vpliva na izražanje microRNAs v rakom želodca [40], lahko sodelujejo v tej uredbi . Pomembno je, da je stanje hiper-metilacija miR-338-3p promotorja je potencialni biološki marker želodčne diagnozo raka.

Ker je funkcija miRNAs z regulacijo izražanje njihovih prodajnih genov, je ključno vprašanje v zvezi s tem, kako miR-338- 3p prispeva k GC je kateri gen (e) se ureja.

Tu smo ugotovili SSX2IP kot pomemben novega cilja pokoj-338-3p, in če tako citološke in histološke dokaze, ki kažejo na vlogo tumorjem spodbujanje za SSX2IP v GC. Številne študije so pokazale, da je SSX2IP akutno mieloidno levkemijo povezan antigen in potencialna tarča imunoterapija za levkemijo [33] - [35]. Pomembno je, da se je SSX2IP prikazano v naših prejšnjih študij, ki spodbujajo gibljivost, invazijo ter migracije in odpornost proti kemoterapiji hepatomom celic, kar kaže na njegovo pomembno vlogo pri razvoju in metastaz. Njena homologni gen pri glodalcih je ADIP
(afadin DIL-domene interakcije proteina), zaporedje aminokislin ADIP beljakovin v miših in podganah je pokazala 88% in 87% identičnost z SSX2IP beljakovin oz. ADIP lokalizirana v mobilni celici adherens križišč, in lahko spodbuja mobilnost celic z aktiviranjem Rac1 skozi Vav2 [41], [42]. To je razmišljal, da bi SSX2IP spodbujajo celično gibljivost, invazijo in metastaze skozi aktiviranje Rac1.

Zanimivo je, da je bil izraz Rac1 v želodčnih tkiva raka višja kot v izravnanih sosednjih non-tumorskih tkivih, je bil njen izraz raven bistveno povezana s stopnjo TNM. V 7 želodčnih raka celičnih linijah, so izrazi Rac1 višja kot v želodčne sluznice epitelijskega liniji (GES-1) [43], ki je sovpadal s pojavom smo ugotovili z miR-338-3p v želodcu rakavih celic in tkiv. Ti rezultati kažejo, da miR-338-3p, kot zaviralnega dejavnika raka želodca, lahko zmanjša ekspresijo ciljnega gena SSX2IP za zatiranje aktivacijo Rac1. Vključevanje SSX2IP v več rakavih obolenj krepi biološko in fiziološko pomen kaskade miR-338-3p /SSX2IP pri razvoju raka, in nas je spodbudilo k nadaljnji preiskavi status pokoj-338-3p /SSX2IP pri drugih vrstah raka. Prepoznavanje druge potencialne tarče pokoj-338-3p je tudi delo v nastajanju.

Na kratko, ta študija je prvi opisal MIR-338-3p kot supresorski tumorja, ki je pogosto utišati z epigenetske hypermethylation na promotor regija v želodcu raka. Funkcionalno, miR-338-3p zavira metastaznih značilnosti GC celic, kot jedrskega orožja, migracije in invazije in vitro
in zmanjšuje pojav tumorjev v GC celic z indukcijo apoptoze in vivo
. Poleg tega smo ugotovili SSX2IP kot ključni ciljni gen pokoj-338-3p v razvoju GC.

• Plos ONE: Pooperativno kemoterapijo v primerjavi Pooperativni kemoterapijo za popolnoma odstranjenimi Rak želodca z D2 limfadenektomijo: metaanalizi
• Plos ONE: MIR-184 Binding-Site rs8126 T > C polimorfizma v TNFAIP2 je povezano s tveganjem za želodčne Cancer