Ploche ONE: epigenetické Umlčanie Mir-338-3p Prispieva k tumorigenicity u rakoviny žalúdka zacielením SSX2IP

abstraktné

mikroRNA bol nedávno uznaný ako hrať významnú úlohu pri vzniku nádorov a metastáz. Tu sme správu, že mier-338-3p bol umlčaný epigenetické u karcinómu žalúdka, a ich down-regulácia významne koreluje s rakovinou žalúdka klinicko-funkcií. Pozoruhodné je, že obnovenie MIR-338-3p expresie v SGC-7901 buniek karcinómu žalúdka inhibovaná množenia sa, migrácie, invázie a karcinogenity in vitro stroje a in vivo
, aspoň čiastočne cez indukciu apoptózy. Ďalej ukazujú onkogén SSX2IP je cieľom MIR-338-3p. Navrhujeme, že mier-338-3p funguje ako nádorový supresor v karcinómu žalúdka, a metylačného statusu CPG ostrova jeho by mohli slúžiť ako potenciálny diagnostický marker pre rakovinu žalúdka

Citácia :. Li P, Chen X, su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) epigenetické Umlčanie MIR-338-3p Prispieva k tumorigenicity u rakoviny žalúdka zacielením SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Španielsko |

prijatá: 17. januára 2013; Prijaté: 10.05.2013; Uverejnené: 24.júna 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený dotácií z Národného Natural Science Foundation Číny (čísel 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 a 81272749), vedy a techniky komisie magistrátu Šanghaja (čísla 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 a 101409042000), Shanghai kľúčovú disciplínou ( S30204), a kľúčové projekty v National Science & Technológia pilier Program of China (čísla 2008BA152B03 a 2011BA203191), Čína Postdoctoral Science Foundation (číslo 2011M500796). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo príprave rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je zhubný nádor s vysokým výskytom a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete [1]. Skorá diagnostika Miera rakoviny žalúdka je nízka, a pacienti sú zvyčajne veľmi ťažké, aby sa určil ako kým sa nádor vyvinul v pokročilej fáze alebo metastáz. Tak, to má veľký význam, aby uskutočnila hĺbkovú štúdiu o patogenéze rakoviny žalúdka a hľadať nové molekulárnej tvorcov a terapeutických cieľov.

mikroRNA sú malé RNA, ktoré regulujú génovú expresiu, a sú zapojení v rôznych biologických signálnych dráh [2]. Početné štúdie ukázali významný rozdiel mikroRNA expresného profilu medzi nádorových buniek a buniek odvodených z normálneho tkaniva, čo naznačuje, že microRNA hrajú dôležité úlohy v vzniku nádorov [3], [4]. Tak, mikroRNA stala v poslednej dobe hotspot genetickej diagnostiky a liečby cieľu, ako nových onkogénov alebo supresorových génov [5], [6]. Abnormálne expresie mikroRNA v tkanivách alebo sére je úzko spätý s niekoľkými ľudských malignít vrátane rakoviny žalúdka [7], [8], a niekoľko down-regulované mikroRNA v žalúdočnej rakovinové tkanive majú funkcie nádorové potlačenie. Napríklad, microRNA rodina Let-7 bol najprv zistené, ako represor RAS, potláčať RAS a c-myc expresie na úrovni translácie [9]. Úroveň expresie rokov-7a je významne znížená u nádorov žalúdka, zatiaľ čo Ras proteín je výrazne vyššia v nádore žalúdku [10]. Okrem toho, mier-15b, mier-16 a mier-21 atď boli pripojené k rozvoju a klinickou diagnózou karcinómu žalúdka [11], [12]. Naša skupina tiež označená protirakovinové úlohu MIR-126, mier-409-3p a mier-155 v karcinómu žalúdka [13] - [15]

microRNA microarray bolo vykonané pre detekciu profily miRNA v žalúdku. rakovina, a zistili sme, že mier-338-3p bola významne down-regulované (nepublikované údaje). MIR-338-3p, ktorý sa nachádza na chromozóme 17q25.3 o dĺžke 22 nukleotidov, bol prvýkrát zaznamenaná v priónových vyvolané neurodegeneráciu ako vyjadrenie Mir-338-3p sa zníži v mozgoch myší infikovaných myšou prispôsobené seškrabovacího [ ,,,0],16]. MIR-338-3p mohla regulovať hladinu mRNA u svojho hostiteľa gén Apoptózu spojené tyrozínkinázy (AATK) v potkaních neurónov [17]. Na druhej strane, mier-338-3p bola up-regulovaná u pacientov s ojedinelých amyotrofická laterálna skleróza (Salsa), iný druh nervového systému lézií [18]. Dôležité je, že úloha Mir-338-3p v vzniku nádorov bolo skôr naznačené, ako je MIR-338-3p je dole regulovaný pri karcinóme konečníka [19], a je regulovaná vírusu hepatitídy B X proteínu (HBX) pre inhibíciu proliferácie a invázie z buniek hepatómy väzbou na cieľové gény CyclinD1 a vyhladená v hepatocelulárneho karcinómu [20] - [22]. Avšak úloha Mir-338-3p v GC je stále neznámy.

V tejto štúdii sme ďalej analyzovali na down-regulácia expresie MIR-338-3p v GC tkanivách v porovnaní s pacientmi uzavreté normálnou tkaniva, a určí, že hladina expresie MIR-338-3p úzko koreluje s patologickým premennými GC. Ektopická expresia MIR-338-3p inhibuje proliferáciu, inváziu a metastázovaniu buniek karcinómu žalúdka, znižuje tumorogénnu schopnosť buniek karcinómu žalúdka u nahých myší, a podporuje apoptózu. Tiež ukazujú, že mier-338-3p môže pôsobiť ako nádorový supresor priamo zacielenia SSX2IP. Tak, naše výsledky naznačujú, že mier-338-3p je potenciálnym diagnostickým markerom a terapeutickým cieľom rakoviny žalúdka.

Materiály a metódy

1. Bunkové línie a kultúra

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 a AGS boli zakúpené od Shanghai inštitútov pre biologických vied, Čínskej akadémie vied [23] - [26]. KATO-III a SNU-1 boli zakúpené od ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 a MKN45 boli získané z japonského Cancer Research Resources Bank [28], imortalizované žalúdočné epiteliálne bunkové línie, GES -1, bol dar od Prof. Feng Bi (nemocnicou Huaxi, univerzita v Sichuan, Chengdu v provincii Sichuan, PR Čína) [29], [30]. HEK293T, ľudských embryonálnych obličiek bunkovej línie, udržuje sa v našom ústave. Rakovinové bunkové línie boli kultivované v žalúdočnej RPMI1640 doplnenom 10% FBS (fetálne hovädzie sérum) pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO2. HEK293T bunky boli kultivované v DMEM (Dulbecco modifikovanom Eaglovho média) s prídavkom rovnakého kultivované stavu vyššie.

2. Etika Vyhlásenie

písomný informovaný súhlas v štúdii bol získaný od všetkých účastníkov. Protokol štúdie bol schválený etickou komisiou Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

3. Tkanivové vzorky

primárnej rakoviny tkaniva žalúdočné a zodpovedajúce non-nádorového tkaniva boli odobraté z 66 pacientov, ktorí podstúpili radikálnu gastrostomy na oddelení chirurgie, Nemocnice Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Žiadny z pacientov bola predoperačné liečbu. Všetky vzorky tkaniva boli odobraté s informovaným súhlasom pacienta a potvrdil patologickým vyšetrením a histologické písanie bola založená na klasifikáciu Lauren. Definícia TNM klasifikácie bolo podľa Medzinárodnej únie proti rakovine (2002).

4. Izolácia RNA a qPCR

Celková RNA bola izolovaná z bunkových línií a vzorkách tkanív pomocou mir
Vaňa ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Kvalita a množstvo vzoriek RNA boli stanovené štandardné elektroforézou a spektrofotometrické metódy. Úroveň expresie Mir-338-3p v bunkových línií a vzorkách tkanív bola meraná pomocou qPCR a vypočítané podľa [13]. Úroveň expresie mRNA SSX2IP meraná qPCR v závislosti na TaqMan® Gene Expression testoch protokolu (Applied Biosystems). Hladina GAPDH mRNA bol použitý pre normalizáciu.

5. DNA Izolácia a analýza metylácie

Genomická DNA zo vzoriek tkaniva sa čistí DNAzol (Invitrogen). Roztoku hydrogensiričitanom konverzie bolo vykonané s použitím Qiagen Epitect hydrogénsiričitanu Kit (Qiagen) podľa údajov výrobcu. Metylácia sochy bola vykonaná metyláciou špecifickou PCR (MSP). Primery pre methylata alebo nemethylované DNA boli navrhnuté softvérom metyl Primer Express v1.0 (ABI) .v metylácie dopredný primer pre CPG Mir-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 'a reverzné primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 'sa unmethylation priamy primer pre CPG MIR-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' a reverzné primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 '

6 .. Prechodné transfekcia miRNA Napodobňuje

Mirna-338-3p napodobňuje a negatívne kontrolné napodobňuje boli zakúpené od GenePharma (Shanghai, Čína) .Cells boli vrúbľovať do dosky pre kultiváciu buniek 20 hodín pred transfekcia s cieľom zabezpečiť 70% buniek pri sútoku okamih transfekciu. Transfekcia miRNA napodobňuje do buniek sa vykonáva za použitia Lipofectamine2000 (Invitrogen) podľa postupu výrobcu. Mirna napodobňuje pracoval v konečnej koncentrácii 100 nM. V 48 hodín po transfekciu, boli vykonané qPCR a Western blot.

7. Test proliferácie buniek

Bunková proliferácia bola hodnotená WST (vo vode rozpustné tetrazoliové soli) test za použitia Cell počítanie Kit-8 (Dojindo) podľa inštrukcií výrobcu. 24 hodín po transfekciu s miRNA napodobňuje, bunky (2 x 10 ^{3 buniek /jamku) boli osivo do 96-jamkových doštičiek. Doštičky boli inkubované počas 5 dní. Celkový počet životaschopných buniek bola stanovená meraním absorbancie pri 450 nm.}

8. Soft Agar Assay Colony môžu vytvárať

GC buniek transfekciou miRNA napodobňuje boli resuspendované s 0,3% mäkkom agare v RPMI1640 obsahujúcom 10% FBS a navrstvená na 0,6% agar stuhnúť v RPMI1640 obsahujúcom 10% FBS v 6-jamkových doštičiek (1 × 10 ^{3 buniek /jamku). Doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO _{2. Kolónie, ktoré obsahujú aspoň 50 bunky boli spočítané.}}

9. Bunkové migrácie a invázie Assay

Migrácia buniek bola vykonávaná s použitím riešenia QCM ^{TM24-Well Colorimetric migrácia Assay Kit (Millipore) podľa návodu výrobcu. Pre test invázie, bol použitý invázie buniek Assay Kit (Millipore) podľa pokynov výrobcu. Bunky (1 x 10 5) v 300 ul bolo pridané bezsérové ​​médium do horných komôr a kultivované po dobu 48 hodín. Non-Migrácia alebo non-napádať bunky boli odstránené pomocou bavlnu tampóny, bunky, ktoré migrovali, alebo napadol na dno membrány boli zafarbené s bunkovou škvŕn vyrovnávacej pamäte stanoveného v testovacej súprave a počítané pod mikroskopom a fotografovaný. Tri nezávislé experimenty boli vykonané za rovnakých podmienok.}

10. Apoptóza Analýza

analýza buniek apoptózu bolo vykonané s annexin V-FITC apoptózy Detection Kit I (BD) v súlade s pokynmi výrobcu. Každý test bol vykonaný v triplikátech a opakuje trikrát nezávisle na sebe. Funkcia jadrovej zmrštenie spojené s apoptózou sa ukázalo, Hoechst 33342 (Beyotime) Podľa protocol.The morfológia bol vizualizovaný pomocou fluorescenčného mikroskopu, ktorý bol excitované pri vlnovej dĺžke 350 nm a merané pri 460 nm.

11. Konštrukcia plazmidov a Luciferase Assay aktivity

fragment divokého typu (WT) 3 'UTR SSX2IP alebo miest mutant (mut) 3' UTR SSX2IP obsahujúce putativní väzbové miesta pre mier-338-3p boli syntetizované , Fragmenty boli klonované do pMIR-Report Luciferase vektora (Ambion) obsahujúce Firefly stroje a pomenované pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{WT a pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells boli osivo do 24 jamkami 24 hodín pred transfekcia. 500 ng /pMIR SSX2IP-3 'UTR hmôt alebo pMIR /SSX2IP-3'UTR mut boli transfekovány do každej jamky, spolu s 20 ng PRL-TK vektora (Promega), ktorý obsahuje Renilla
luciferázy a 60 pmol mir-338-3p alebo kontrolných napodobňuje. Bunky boli zozbierané po 48 h transfekciu. Firefly stroje a Renilla
luciferázové aktivity boli merané pomocou Dual-luciferázového reporterového testu (Promega) podľa inštrukcií výrobcu.}

12. Stabilná transfekcia MIR-338-3p expresného vektora

pSilencer-MIR-338-3p vektora a pSilencer-MIR-kontrolný vektor bol transfekován do SGC-7901 buniek, respektíve za použitia Lipofectamine2000 (Invitrogen), a vybrané so 100 ug /ml hygromycinu B (Invitrogen) počas 4 týždňov. Stabilne transfekované klony boli vybrané a udržiavané v polovici koncentrácie výberu.

13. Nádor modelu xenoimplantátu

SGC-7901 bunky (2 x 10 ^{6 buniek /myš), stabilne transfekované pSilencer-MIR-338-3p alebo pSilencer-kontrolným vektorom boli injikované subkutánne do 4 týždňov starí samci nahých myší (ústav zoológie, čínskej akadémie vied, Shanghai, Čína) .v myši boli kontrolované raz týždenne, nádorové uzliny boli merané dotykovým meradlom. Myši bolo vynakladanie 4 týždne po injekcii, a nádory boli vybraté a zvážené. Objem nádoru bola hodnotená za použitia nasledujúceho vzorca :. objem = (šírka + dĺžka) /2 x šírka x dĺžka x 0.5236.Tumor rastových kriviek boli získané}

14. Imunohistochémia

Detekcia SSX2IP bola vykonaná na parafínových rezoch s anti-SSX2IP protilátky (abca, riedenie 1: 1000). Imunitný komplex bol vizualizovaný s Dako REAL ^{Systém TMEnVision ™ Detection, peroxidázy /DAB, Králik /Mouse (Dako), podľa postupu výrobcu. Jadrá bola kontrastne zafarbené hematoxylínom.}

15. Štatistická analýza

Vzťah medzi MIR-338-3p úrovne expresie a patologickým parametrov bola analyzovaná osobou X
^{2 testu. Rozdiely medzi skupinami sa analyzovali za použitia Študent t
testu. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softwaru (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) na SPSS 13,0 a P Hotel < 0,05 bola považovaná za významnú}

Výsledky

1. , Expresie Mir-338-3p je down-regulované v GC bunkových línií a tkanivách

Ak chcete preskúmať úlohu Mir-338-3p v GC, sme sa prvýkrát v porovnaní hladiny expresie Mir-338-3p v osem žalúdočné rakovina bunkové línie s imortalizovanou normálnou žalúdočnej sliznice epitelové bunkové línie (GES-1). Ako je znázornené na Obr. 1A, mier-338-3p významne down-regulované v bunkových líniách GC v porovnaní s GES-1. K potvrdeniu tohto výsledku sme tiež porovnali vyjadrenie Mir-338-3p v GC tkanív a okolitom normálnom tkanive. 66 GC párované vzorky boli zahrnuté v tejto štúdii. Výsledky ukazujú, že priemerná úroveň expresie MIR-338-3p bol významne down-regulovaná v nádorových tkanivách v porovnaní so susednými normálnom tkanive (obr. 1B). Ďalej poukázali na koreláciu medzi Mir-338-3p prejavu a patologickým faktorov. Ako je uvedené v tabuľke 1. 59,1% (39/66) vzoriek GC ukázala, down-reguláciu MIR-338-3p pod dvojaký cut-off (relatívna expresia pomer < 0,5), táto situácia bola považovaná za podstatne dole -regulated. Na tomto základe hraničné, 66 klinické prípady boli rozdelené do dvoch skupín: Mir-338-3p nižšia výrazom skupina (n = 39) a mier-338-3p vyššiu expresiu (n = 27). Nižšia výraz skupina vykazovala sklon k väčšej veľkosti nádoru, čo je viac lymfatických uzlín, hlbšie miestnej invázie a vyspelejšie TNM štádiu, ale žiadnu významnú koreláciu s vekom, pohlavím alebo histologickom typu (tabuľka 1).

2. Mier-338-3p je epigenetické tlmičom v rakovina žalúdka

Rovnako ako epigenetické umlčanie je bežným prostriedkom pre down-reguláciu expresie miRNA [31], [32], rozhodli sme sa analyzovať rozloženie CPG ostrov v promótor región MIR-338-3p metyl Primer Express v1.0 softvér. Výsledky ukázali, že CPG ostrovy existujú v časti (-690 do -241), proti smeru od miesta štartu transkripcie (TSS). Skúmali sme metylačného statusu CPG ostrovov v oblasti promotora metyláciou špecifickou PCR (MSP), pokrývajúce oblasť -366 do -576 (obr. 2A). Pomocou MSP, sme zistili, že mier-338-3p CPG ostrov bol značne methyluje v bunkových líniách GC v porovnaní s v žalúdočnej sliznice epiteliálne bunkové línie (GES-1). Ako sa dalo očakávať, liečba 5-aza indukovanej významný demetyláciu (obr. 2B). Reprezentatívne výsledky MSP analýzu Mir-338-3p v GC nádorových tkanivách a uzavreté okolitom normálnom tkanív bolo znázornené na obr. 2C. V metylácie sadzby MIR-338-3p CPG ostrovov v nádorovom tkanive a okolitom normálnom tkanive od pacientov 66 GC bolo 78,79% a 24,24%, v uvedenom poradí (** P
. ≪ 0,01, obr 2D) , Keď boli vypočítané prijímač prevádzkových charakteristík krivka a plocha pod krivkou (AUC) pre denaturovaným stav Mir-338-3p v GC, hodnota AUC bola 0,773 ± 0,042, výrazne vyššia ako nulovej hypotézy ( P <
0,001), a 95% interval spoľahlivosti je 0,690 do 0.856 (obr. 2E). To znamená, že stav metylácie MIR-338-3p CPG ostrova by mohli slúžiť ako potenciálny molekulárne marker pre GC.

3. MIR-338-3p inhibuje žalúdočné rakovinové bunky, proliferácia

Vzhľadom k tomu, Mir-338-3p je významne down-regulované v GC, ako je uvedené vyššie, môže pôsobiť ako nádorový supresor. Preto ďalšie určiť, či zvýšená expresia Mir-338-3p v nádorových bunkách žalúdka by mohlo mať vplyv na rast buniek. Syntetické MIR-338-3p napodobňuje alebo negatívne kontrolou, má rovnakú funkciu ako boli transfekovány do SGC-7901 buniek, v ktorých hladina expresie MIR-338-3p je najnižšia, s následným WST test pre sledovanie rastu buniek.

ektopická expresia Mir-338-3p v SGC-7901 buniek bola potvrdená qPCR a SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-338-3p napodobňuje rástla výrazne pomalší, než v kontrolnej skupine (obr. 3A) (* P
< 0,05, ** P <
0,01). Pre ďalšie charakterizáciu účinku Mir-338-3p na rast buniek, bol vykonaný test tvorby kolónií soft-Ager. Zistili sme, že počet kolónií z SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-338-3p napodobňuje bola výrazne menej, než v kontrolnej skupine (obr 3B-C.) (** P Hotel &0,01) , Dôsledne inhibícia MIR-338 indukovanú proliferáciu SGC-7901 (obr S2 v spise S1, * P
. ≪ 0,05). Podobné výsledky boli pozorované u kontrolnej GES-1 buniek (obr S1 A-B v súbore S1, * P
. ≪ 0,05). V súhrne tieto výsledky naznačujú, že mier-338-3p potláča rast oboch GC buniek a žalúdočného epitelu v
vitro.

4. MIR-338-3p inhibuje migrácie a invázie do GC buniek in vitro

na myšlienke, že mier-338-3p slúži ako nádorový supresor GC, sme ďalej skúmať účinky na migráciu buniek a invázie, kritický určitý malígny progresie a metastáz. Ako je znázornené na Obr. 4, počet ťažných SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-338-3p napodobňuje bola významne nižšia ako u kontrolnej skupiny (105,00 ± 11,16 vs 145.00 ± 7,00, ** P
< .. 0,01 obr.4 a-B), a počet invazívnych SGC-7901 buniek transfektovaných s Mir-338-3p bol významne nižší v porovnaní s kontrolnou skupinou (41,33 ± 4,04 vs 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. obr. 4 C-D). Dôsledne inhibícia MIR-338-3p indukovanej migrácie a invázie do SGC-7901 buniek (obr S3 v súbore S1, * P
. ≪ 0,05). Naproti tomu MIR-338-3p nemal žiadny vplyv na migráciu GES-1 (obr. S1 E v súbore S1), pravdepodobne preto, že bunky GES-1 chýba migráciu a invazívne povahu rakovinových buniek. Tieto výsledky zobrazené úlohu MIR-338-3p pri inhibícii ako migrácii a invázii GC buniek.

5. MIR-338-3p môže spôsobiť žalúdočné rakovinové bunky Apoptóza

Na objasnenie mechanizmu MIR-338-3p o účinkoch na inhibičný GC rast buniek, sme testovali analýzu apoptózy pomocou prietokovej cytometrie. Výsledky ukázali, že proapoptotický rýchlosť bola významne zvýšená v Mir-338-3p simuluje transfekciou skupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou (napodobňuje prenesené ** P Hotel &0,01) (obr. 5A-B). Ďalej sme skúmali vlastnosti morfologické apoptózy vrátane kondenzovaným chromatín a nukleárnej fragmentácia Hoechst 33342 farbenie a znovu potvrdila, že proapoptotický sadzba bola zvýšená v Mir-338-3p napodobňuje transfekované bunky (obr. 5c). Dôsledne inhibícia MIR-338 inhibuje apoptózy SGC-7901 buniek (obr S4 v súbore S1, * P
. ≪ 0,05). Podobné výsledky boli pozorované u kontrolných GES-1 buniek (Obr S1 C-D v spise S1 ** P
. ≪ 0,01). Tieto výsledky ukazujú, že nadmerná expresia MIR-338-3p indukuje apoptózu v GC buniek, ktoré by mohli prispieť k inhibičný vlastnosti rast MIR-338-3p.

6. MIR-338-3p Inhibuje tumorigeničnosti a zvyšuje Apoptosis in vivo

Máme ďalšie otestuje, či ektopická expresia MIR-338-3p by mohli ovplyvniť rast a apoptózu žalúdočného nádoru in vivo .
SGC-7901 bunky boli transfekovány s Mir-338-3p expresného vektora (p tlmič
-miR-338-3p) alebo kontrolným vektorom (p tlmič
-miR -kontrola). Stabilné klony buď s p tlmičom
-miR-338-3p alebo p Tlmič
-miR-control boli vybrané a podkožného injekciou do holých myší a vytvorenie nádoru bola monitorovaná. SGC-7901 bunky prenesené s Mir-control ukázala progresívny rast, ale boli potlačené v prípade mimomaternicového expresie MIR-338-3p. Po 28 dňoch boli nahé myši usmrtené a boli merané nádorové hmotnosti a objemu (obr. 6 A-E). Priemerná hmotnosť nádorov vyplývajúcich z Psili encer
-miR-338-3p bunky skupina bola výrazne nižšia, ako sú nádory z p Tlmič
-miR-kontrolná bunky skupina (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229.52 mg, ** P
. < 0,01)

Ak chcete skontrolovať, či apoptóza prispieva k tomu poznamenal vivo
nádoru inhibícia rastu upon MIR-338-3p nad -expression, TUNEL test bol vykonaný v nádorových tkanivách. Výsledky ukázali, že nádorové tkanivá od p tlmič
-miR-338-3p obsahovala podstatne viac pozitívne farbenie buniek v porovnaní s kontrolnou skupinou (** P
. ≪ 0,01, obr 6F-G ). Tak, naše výsledky ukazujú, že mier-338-3p inhibuje žalúdočné tumorigenezi in vivo
, aspoň čiastočne indukciu apoptózy in situ.

7. MIR-338-3p Ciele 3'-UTR z Oncogene SSX2IP

Ako miRNA často regulujú expresiu cieľových génov, hľadali sme predpokladané ciele Mir-338-3p je pomocou on-line nástroje pre vyhľadávanie (napr TargetScan, Microrna.org a PicTar). Gény predpovedané všetkých používaných programov bol považovaný za kandidáta cieľov MIR-338-3p. Medzi všetkými hity, SSX2IP spôsobil našu pozornosť, predchádzajúce štúdie ukázali, že SSX2IP je akútna myeloidná leukémia asociované s antigénom a potenciálne imunoterapia cieľ pre leukémia [33] - [35] a našej predchádzajúcej práce ukázali, že SSX2IP podporuje inváziu a migráciu hepatocelulárny karcinóm bunky a prispieva k odolnosti voči chemoterapii [36].

Jeden potenciálny MIR-338-3p väzobné miesto bolo predpovedané v 3 'UTR SSX2IP (obr. 7A). Na overenie tejto interakcie, dáme divokého typu alebo mutantný 3'UTR fragment SSX2IP do pMIR-REPORT Luciferase vektora. Výsledné konštrukty boli ko-transfekovány s MIR-338-3p napodobňuje alebo kontrolné má rovnakú funkciu ako v bunkách HEK293T, nasledovaný luciferázy reporterového testu. Relatívna aktivita luciferázy z pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{hmôt, ale nie pMIR /SSX2IP-3'UTR mut, bola významne potlačená MIR-338-3p (** P
< .. 0,01) v porovnaní s tým kontrolných napodobňuje (obr 7B), čo ukazuje, že mier-338-3p priamo viaže na 3 'UTR SSX2IP fungovať ako supresor}

Ďalej sme skúmali vplyv Mir-338-3p na expresiu SSX2IP, meraním hladiny mRNA a proteínové SSX2IP po transfekciu SGC-7901 buniek s Mir-338-3p alebo kontroly napodobňuje. Ako je znázornené na Obr. 7C-D, MIR-338-3p nemal žiadny vplyv na SSX2IP
úrovni mRNA, merané qPCR, ale spôsobilo významné zníženie hladiny SSX2IP proteínu v porovnaní s kontrolnou transfekované. Tieto výsledky naznačujú, že mier-338-3p potláča expresiu SSX2IP na posttranskripční úrovni, pravdepodobne v dôsledku väzby na 3 'UTR SSX2IP. Pozoruhodne, sme tiež zistili, že Capas-3 a procasepase-3, dva dôležité apoptóza gény, boli zodpovedajúcim spôsobom znížilo (Obr. 7C).

8. Expresie MIR-338-3p nepriamo koreluje s hladinou expresie SSX2IP proteínu v karcinómu žalúdka

MIR-338-3p je dole regulovaný u karcinómu žalúdka a SSX2IP je podporovaný k cieľovému génu MIR-338 -3p, nás podporoval špekulovať, že SSX2IP by mohla byť zvýšená expresia v žalúdočných rakovinové tkanive a relatívnej so zodpovedajúcimi nenádorových tkanív.

imunohistochemická analýza odhalila SSX2IP antigénu situáciu farbenie na SSX2IP proteínu v nádorových tkanivách a uzavreté non-nádorové tkanivá v 66 žalúdočné rakovina samples.65% (43/66) na žalúdočné rakovinu tkanív zobrazená zvýšenej immuostaining pre SSX2IP proteínu v porovnaní s spárovaných nenádorových tkanív. Najmä, 84% (tridsať jedna tridsať sedminy) žalúdočného rakovinových tkanív zobrazená zvýšenej imunologické vo vzorkách GC Mir-338-3p low-expresie skupiny, zatiaľ čo dáta je 41% (12/29) u Mir-338-3p high-výraz skupina. To znamená, že analýza expresie Mir-338-3p a SSX2IP v žalúdočných rakovinových tkanív potvrdila existenciu inverzný korelácia medzi expresiou Mir-338-3p a jeho cieľových génov SSX2IP (osoba Chi-kvadrát test: P Hotel < 0,001, Spearman Korelácia: r = -0,442, P Hotel < 0,001, obr 8)

9 ... Mimomaternicové Vyjadrenie SSX2IP zachráni fenotypov spôsobených nadmerným produkujúcich Mir-338-3p v GC buniek

Ak SSX2IP je hlavným cieľom potlačiť Mir-338-3p v GC, ektopická expresia SSX2IP by mal zachrániť fenotypov spôsobené MIR-338-3p počas výroby v GC buniek. Ak chcete vyskúšať túto myšlienku, a SSX2IP expresné vektor alebo prázdnym vektorom bol individuálne transfekován do SGC-7901, nasledovaný cytologické testy pre meranie bunkovej proliferácie, migrácie, invázie a apoptózu. Ako sa dalo očakávať, že nadmerná expresia SSX2IP čiastočne alebo úplne obracia inhibičný účinok Mir-338-3p v GC buniek na každý aspekt sme skúmali (obr. 9, A-D). Na druhej strane, SSX2IP nemá žiadny vplyv na expresiu Mir-338-3p (obr. S5 v súbore S1). Takto sme dospeli k záveru, že funkcia rakovina supresor Mir-338-3p v GC je aspoň čiastočne cez jeho potlačenie cieľového génu SSX2IP.

Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že nízka -expression MIR-338-3p bol klinicky spojená s väčšou veľkosťou nádoru, viac lymfatických uzlín, hlbšie miestnej invázie a pokročilom štádiu TNM. At cytologickom úrovni up-regulácia MIR-338-3p inhibuje proliferáciu, tvorbu kolónií, invázie a migrácie buniek karcinómu žalúdka. Okrem toho, s nadmernou expresiou Mir-338-3p do buniek karcinómu žalúdka výrazne znížená vzniku nádorov u nahých myší in vivo
. Celkovo vzaté, naše výsledky silne naznačujú tumor supresorové úlohu MIR-338-3p pre rakovinu žalúdka.

miRNA boli v poslednej dobe uznané za hlavné regulačné faktory súvisiace s nádorom. Hoci regulačný mechanizmus expresie miRNA v vzniku nádorov je stále nejasná, epigenetické regulácia bolo navrhnuté, aby hrali dôležitú úlohu [31] [32]. DNA metylácie sa vyskytuje hlavne v CPG ostrova bežne nachádza v promotorové oblasti génu, približne 70% z promotorových oblastí v ľudskom genóme je bohaté na CPG ostrova [37]. Znížené prejavy MIR-34b, mier-129 a mier-10b sú spôsobené hypermetylace v promotérov [38], [39]. V súlade s touto predstavou, bolo skutočne zistené, že úroveň metylácie CPG ostrova Mir-338-3p v žalúdočnej rakovinové tkanive vyššie ako spárovaných okolitom normálnom tkanív, čo naznačuje, že mier-338-3p je epigenetické umlčaný v GC. Príčinou tohto epigenetické tichu MIR-338-3p rakoviny žalúdka zostáva nejasná, a my špekulovať, že faktory, ako ČAGA, ktorý bol predtým oznámené epigenetické ovplyvniť expresiu mikroRNA v rakoviny žalúdka [40], sa môžu zúčastniť v tomto nariadení , Dôležité je, že stav hyper-metylácie MIR-338-3p promótor je potenciálny biomarker pre žalúdočné diagnózu rakoviny.

Vzhľadom k tomu, funkcie miRNA cez reguláciu expresie ich následných génov je kľúčovou otázkou týkajúce sa ako Mir-338- 3p prispieva k GC ktorý gén (y) reguluje.

Tu sme identifikovali SSX2IP ako dôležitý nové ciele MIR-338-3p, a za predpokladu, ako cytologických a histologické dôkazy naznačujúce role nádor podporujúci o SSX2IP v GC. Mnohé štúdie ukázali, že SSX2IP je akútna myeloidná leukémia asociované s antigénom a potenciálny cieľ pre imunoterapiu leukémia [33] - [35]. Dôležité je, že SSX2IP bolo uvedené v predchádzajúcich štúdiách, aby podporovali motilitu, inváziu a migráciu a chemoterapia odolnosti buniek hepatómy, s uvedením jeho významnú úlohu pri vývoji a metastáz. Jej homologické gén u hlodavcov je ADIP
(afadin domény-interagujúce proteín DIL), aminokyselinová sekvencia z ADIP proteínu v myší a potkanov ukázali, 88% a 87% identitu s proteínom SSX2IP, v danom poradí. ADIP lokalizované v bunka-bunka adhézne križovatiek, a to môže podporovať mobilitu bunkovú aktiváciou prostredníctvom Rac1 Vav2 [41], [42]. Uvažuje sa o tom, že by mohol podporiť SSX2IP pohyblivosť buniek, invázia a metastáz pomocou aktivácie Rac1.

Je zaujímavé, že expresia Rac1 v žalúdočných rakovinových tkanivách vyššie ako v spárovaných okolitom normálnom tkanív, jeho hladina expresie bola významne spojené s TNM fáze. V 7 žalúdočné rakovinové bunkové línie, sú výrazy Rac1 boli vyššie ako v žalúdočnej sliznice epiteliálne bunkové línie (GES-1) [43], ktorý sa zhodoval s fenoménom sme našli s Mir-338-3p v nádorových bunkách a tkanivách žalúdka. Tieto výsledky naznačujú, že mier-338-3p, ako inhibičný faktor rakoviny žalúdka, môže znížiť expresiu cieľového génu SSX2IP potlačiť aktiváciu Rac1. Zapojenie SSX2IP v rôznych rakovín posilňuje biologické a fyziologické význam kaskády MIR-338-3p /SSX2IP vo vývoji rakoviny, a nás viedla ďalej skúmať stav MIR-338-3p /SSX2IP v iných typov rakoviny. Identifikáciu ďalších potenciálnych cieľov MIR-338-3p je tiež work in progress.

Stručne povedané, táto štúdia prvýkrát popísaná Mir-338-3p ako nádorový supresor, ktorý je často tlmičom prostredníctvom epigenetické hypermetylace na promótor región v žalúdočných rakovín. Funkčne, mier-338-3p inhibuje metastatické vlastnosti GC buniek, ako je proliferácia, migrácia a invázia in vitro
, a znižuje karcinogenity GC buniek indukciou apoptózy in vivo
. Navyše sme identifikovali SSX2IP ako kľúčový cieľový gén Mir-338-3p vo vývoji GC.

• Ploche ONE: pooperačné chemorádioterapiu v porovnaní s pooperačnou chemoterapiou pre Kompletne resekciou rakoviny žalúdka s D2 lymfadenektómia: Metaanalýza
• Ploche ONE: Mir-184 Väzba-Site rs8126 T > C polymorfizmus v TNFAIP2 je spojená s Riziko rakoviny žalúdka