PLoS ONE: epigenetisk stanse av MIR-338-3p Bidrar til tumorigenicity i magekreft ved Targeting SSX2IP

Abstract

mikroRNA har nylig blitt anerkjent som spiller en fremtredende rolle i tumordannelse og metastasering. Her rapporterer vi at Mir-338-3p ble epigenetiske stilnet i magekreft, og dens nedregule var signifikant korrelert med magekreft clinicopathological funksjoner. Påfallende, gjenopprette MIR-338-3p uttrykk i SGC-7901 magekreftceller hemmes spredning, migrasjon, invasjon og tumorgenisiteten in vitro Hotell og in vivo
, i det minste delvis gjennom å indusere apoptose. Videre viser vi til onkogen SSX2IP er et mål på MIR-338-3p. Vi foreslår at Mir-338-3p fungerer som en tumor suppressor i magekreft, og metylering status for sin CpG island kan tjene som en diagnostisk markør for magekreft

Citation. Li P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) epigenetiske stanse av MIR-338-3p Bidrar til tumorigenicity i magekreft ved målretting SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, ​​Spania

mottatt: 17 januar 2013; Godkjent: 10 mai 2013; Publisert: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (tall 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 og 81272749), Science and Technology Commission av Shanghai kommune (tall 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 og 101 409 042 000), Shanghai Key Discipline ( S30204), og viktige prosjekter i National Science & Teknologi Pillar Program of China (tall 2008BA152B03 og 2011BA203191), Kina Postdoktor Science Foundation (antall 2011M500796). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en kreft med høy forekomst og den nest største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Den tidlige diagnostiske frekvensen av magekreft er lav, og pasientene er vanligvis vanskelig å bli diagnostisert før kreften har utviklet seg til avansert stadium eller metastasering. Dermed er det av stor betydning å gjennomføre fordypning på patogenesen av magekreft og for å se etter nye molekylære stakere og terapeutiske mål.

microRNAs er små RNA som regulerer genuttrykk, og de er involvert i en rekke biologiske signalveier [2]. Flere studier har avslørt betydelig forskjell fra microRNAs uttrykk profilering mellom tumorceller og celler avledet fra normale vev, noe som indikerer at microRNAs har spilt en viktig rolle i tumorgenese [3], [4]. Dermed microRNAs har nylig blitt en hotspot for genetisk diagnostikk og behandling mål som nye onkogener eller suppressor gener [5], [6]. Unormal ekspresjon av microRNAs i vev eller serum er nært knyttet til flere humane maligniteter, inkludert magekreft [7], [8], og flere ned-regulert microRNAs i magekreft vev har tumorhemmende funksjoner. For eksempel ble det Let-7 mikroRNA familie først funnet som en repressor av RAS, undertrykke RAS og c-myc ekspresjonen på translasjonelt nivå [9]. Ekspresjonsnivået av la-7a er betydelig redusert i mage tumorer, mens Ras-proteinet er vesentlig høyere i magetumor [10]. Videre MIR-15b, MIR-16 og MIR-21 etc har vært koblet til utvikling og klinisk diagnose av magekreft [11], [12]. Vår gruppe har også rapportert anticancer rolle MIR-126, MIR-409-3p og MIR-155 i magekreft [13] - [15]

mikroRNA mikromatriser ble utført for å oppdage miRNA profilene i mage. kreft, og vi fant ut at Mir-338-3p var signifikant nedregulert (upubliserte data). MIR-338-3p, som ligger på kromosom 17q25.3 med en lengde på 22 nt, ble først rapportert i prion-indusert nevrodegenerasjon som uttrykk for MIR-338-3p reduseres i hjernen til mus infisert med mus-tilpasset skrape [ ,,,0],16]. MIR-338-3p kunne regulere mRNA nivået av verten sin gen apoptose-assosiert tyrosin kinase (AATK) i rotte nevroner [17]. På den annen side, MIR-338-3p var oppregulert hos pasienter med sporadisk amyotrofisk lateralsklerose (sals), en annen form for nervesystem lesjoner [18]. Viktigere, en rolle MIR-338-3p i tumorgenese har tidligere blitt foreslått, som MIR-338-3p er nedregulert i endetarmskreft [19], og er regulert av hepatitt B-virus X-protein (HBX) for å hemme proliferasjon og invasjon av hepatomceller ved binding til målgener CyclinD1 og glattes i hepatocellulær karsinom [20] - [22]. Imidlertid er rollen til MIR-338-3p i GC fortsatt ukjent.

I denne studien har vi ytterligere analysert nedregule uttrykk for MIR-338-3p i GC vev sammenlignet med pasient matchet normal vev, og bestemt at uttrykket nivået av MIR-338-3p var nært korrelert med clinicopathologic variabler av GC. Ektopisk uttrykk for MIR-338-3p hemmer spredning, invasjon og metastasering av magekreftceller, reduserer tumorigen evne av magekreftceller i nakne mus, og fremmer apoptose. Vi viser også at Mir-338-3p kunne fungere som en tumor suppressor ved direkte rettet mot SSX2IP. Dermed våre resultater tyder på at MIR-338-3p er en diagnostisk markør og terapeutiske målet for magekreft.

Materialer og metoder

1. Cellelinjer og kultur

Den menneskelige magekreft cellelinjer SGC-7901, ble NCI-N87, BGC-823 og AGS kjøpt fra Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences [23] - [26]. KATO-III og SNU-1 ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 og MKN45 ble oppnådd fra det japanske Cancer Research Resources Bank [28], den udødelig gastriske epitel cellelinje, GES -1, var en gave fra professor Feng Bi (Huaxi Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan-provinsen, Kina) [29], [30]. HEK293T, humane embryonale nyrecellelinje, ble bevart i vårt institutt. De magekreft cellelinjer ble dyrket i RPMI1640 supplementert med 10% FBS (føtalt bovint serum) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. HEK293T-celler ble dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) supplert med den samme dyrket tilstand ovenfor.

2. Etikk Uttalelse

Skriftlig informert samtykke i studien ble innhentet fra alle deltakerne. Studien protokollen ble godkjent av etisk komité for Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

3. Vevsprøver

Primær mage kreft vev og de matchet ikke-tumorvev ble samlet inn fra 66 pasienter som gjennomgår radikal gastrostomy ved Kirurgisk avdeling, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Ingen av pasientene fikk preoperativ behandling. Alle de vevsprøver ble samlet inn med pasientens informerte samtykke og bekreftet av patologisk undersøkelse, og histologisk typing var basert på Lauren klassifisering. Klassifiserings definisjoner TNM ble ifølge International Union mot kreft (2002).

4. RNA Isolation og qPCR

Total RNA ble isolert fra cellelinjer og vevsprøver av mir
Vana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvaliteten og kvantiteten av RNA-prøvene ble bestemt ved standard-elektroforese og spektrofotometriske metoder. Ekspresjonsnivået av MIR-338-3p i cellelinjer og vevsprøver ble målt ved qPCR og beregnet som beskrevet [13]. Ekspresjonsnivået av SSX2IP mRNA ble målt ved qPCR i henhold til den TaqMan® Gene Expression Assays protokoll (Applied Biosystems). GAPDH mRNA nivået ble brukt for normalisering.

5. DNA Isolasjon og Metylering analyse

Genomisk DNA fra vevsprøver ble renset ved hjelp DNAzol (Invitrogen). Natriumbisulfit omdannelse ble utført under anvendelse av Qiagen Epitect Bisulfite Kit (Qiagen) ifølge produsentens. De metylering statuene ble utført ved metylering spesifikk PCR (MSP). De primere for metylert eller unmethylated DNA ble designet av programvaren metyl Primer Express v1.0 (ABI) sikret metylering forover primer for CpG av MIR-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 'og omvendt primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ', den unmethylation forover primer for den CpG av mir-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' og den reverse primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 '

6.. Forbigående Transfeksjon av miRNA Ligner

miRNA-338-3p ligner og negative kontrollligner ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina) .Cells ble sådd på cellekulturplater 20 timer før transfeksjon å sikre 70% celle samløpet på øyeblikk av transfeksjon. Transfeksjon av miRNA etterligner i celler ble utført ved hjelp av Lipofectamine2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens prosedyre. Mirna ligner arbeidet ved endelig konsentrasjon på 100 nM. På 48 timer etter transfeksjon ble qPCR og Western blot utføres.

7. Celleproliferasjonsanalyse

celle proliferasjon ble bedømt ved WST (vannløselig tetrazoliumsalt) analyse ved anvendelse av en celletelling leder-8 (Dojindo) i henhold til produsentens instruksjoner. Ved 24 timer etter transfeksjon med miRNA etterligner, celler (2 x 10 ^{3 celler /brønn) ble sådd i 96-brønners plater. Platene ble inkubert i 5 dager. Antall levedyktige celler ble bestemt ved måling av absorbansen ved 450 nm.}

8. Myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen

GC-celler transfektert med miRNA ligner ble resuspendert med 0,3% myk agar i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS og lagvis på 0,6% størknet agar i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS i 6-brønners plater (1 × 10 ^{3 celler /brønn). Platene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO _{2. Kolonier som inneholder minst 50 celler ble talt opp.}}

9. Cell migrasjon og invasjon analysen

Migrasjon av celler ble utført ved hjelp av QCM ^{TM24-Well Colorimetric Migration Assay Kit (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. For invasjonen analysen ble Cell Invasion Assay Kit (Millipore) som brukes i henhold til produsentens instruksjoner. -Celler (1 x 10 5) i 300 ul serumfritt medium ble tilsatt til de øvre kamre og dyrket i 48 timer. Ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler ble fjernet med bomullsservietter, Celler som migrerte eller invaderte til bunnen av membranen ble farget med celle flekk buffer gitt i testsettet og tellet under mikroskop og fotografert. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for de samme betingelser.}

10. Apoptose Analyse

Cell apoptose analyse ble utført med Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I (BD) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver analyse ble utført i triplikat og gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre. Funksjonen av atom krymping forbundet med apoptose ble vist av Hoechst 33342 (Beyotime) i henhold til den protocol.The morfologi ble visualisert ved hjelp av et fluorescerende mikroskop som ble eksitert ved 350 nm bølgelengde og målt ved 460 nm.

11. Bygging av plasmider og Luciferase aktivitetsanalyse

fragment av villtype (wt) 3'UTR av SSX2IP eller nettsteder mutant (Mut) 3'UTR av SSX2IP inneholder den antatte MIR-338-3p bindingsseter ble syntetisert . Fragmentene ble klonet inn i pMIR-Rapport luciferase vektor (Ambion) som inneholder Firefly Hotell og navngitte pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{wt og pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells var frø inn i 24-brønners plater 24 timer før transfeksjon. 500 ng av pMIR /SSX2IP-3'UTR vekt eller pMIR /SSX2IP-3'UTR mut ble transfektert inn i hver brønn, sammen med 20 ng av PRL-TK vektor (Promega) som inneholder Renilla
luciferase og 60 pmol av Mir-338-3p eller kontrolletterligner. Cellene ble høstet etter 48 timers transfeksjon. Firefly Hotell og Renilla
luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferase reporter analysen (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.}

12. Stabil Transfeksjon av MIR-338-3p Ekspresionsvektor

pSilencer-MIR-338-3p vektor og pSilencer-MIR-kontroll vektor ble transfektert inn SGC-7901 celler henholdsvis ved hjelp Lipofectamine2000 (Invitrogen), og valgt med 100 mikrogram /ml hygromycin B (Invitrogen) i 4 uker. Stabilt transfekterte cellekloner ble plukket og vedlikeholdes i halvparten av utvalget konsentrasjon.

13. Tumor Xenotransplantat Modell

SGC-7901 celler (2 × 10 ^{6 celler /mus) stabilt transfektert med pSilencer-MIR-338-3p eller pSilencer-kontroll vektor ble subkutant injisert i fire uker gammel mannlig nakne mus (Institute of Zoology, kinesiske Academy of Sciences, Shanghai, Kina) .De mus ble sjekket ukentlig, ble tumornoduler målt med en caliper. Mus ble avlivet 4 uker etter injeksjon, og tumorene ble fjernet og veiet. Tumor volum ble evaluert ved hjelp av følgende formel:. Volume = (bredde + lengde) /2 × bredde × lengde × 0.5236.Tumor vekstkurver ble beregnet}

14. Immunhistokjemi

Påvisning av SSX2IP ble utført på parafinsnitt med anti-SSX2IP antistoff (Abcam, fortynning 1:1000). Immunkomplekset ble visualisert med Dako REAL ^{TMEnVision ™ Detection System, Peroxidase /DAB, Kanin /Mouse (Dako), i henhold til produsentens prosedyre. Kjernene ble kontra med hematoksylin.}

15. Statistisk analyse

Forholdet mellom MIR-338-3p uttrykk nivå og clinicopathologic parametre ble analysert ved Person X
^{2 test. Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student t
test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (SPSS Inc, Chicago, IL, USA), og P
< 0,05 ble betraktet som signifikant}

Resultater

1. . Expression of Mir-338-3p er nedregulert i GC cellelinjer og vev

For å undersøke hvilken rolle MIR-338-3p i GC, må vi først sammen uttrykket nivået av MIR-338-3p i åtte gastrisk cancer cellelinjer med en immortalisert normal gastrisk mucosal epitelcellelinje (GES-1). Som vist på fig. 1A, MIR-338-3p var signifikant nedregulert i GC-cellelinjer sammenlignet med GES-1. For å bekrefte dette resultatet, vi også sammenlignet uttrykk for Mir-338-3p i GC vev og tilstøtende ikke-tumorvev. 66 GC-parede prøver ble inkludert i denne studien. Resultatene viser at den gjennomsnittlige ekspresjonsnivået av MIR-338-3p var signifikant nedregulert i tumorvev sammenlignet med de tilstøtende ikke-tumorvev (Fig. 1B). Videre belyses vi sammenhengen mellom MIR-338-3p uttrykk og clinicopathologic faktorer. Som vist i tabell 1. 59,1% (39/66) av GC prøvene viste nedregulering av MIR-338-3p under to gangers cut-off (relativ ekspresjon forholdet < 0,5), denne situasjonen ble ansett å være signifikant ned -regulated. Basert på denne cut-off, ble de 66 kliniske tilfeller delt inn i to grupper: MIR-338-3p lavere uttrykk gruppe (n = 39) og Mir-338-3p høyere uttrykk (n = 27). Den nedre uttrykk gruppen viste helling mot større tumor størrelse, mer lymfeknutemetastase, dypere lokal invasjon og mer avansert TNM stadium, men ingen signifikant korrelasjon med alder, kjønn eller histologisk type (tabell 1).

2. MIR-338-3p er epigenetiske Silenced i Gastric Cancer

Som epigenetisk lyddemping er en vanlig måte for nedregulering av miRNA uttrykk [31], [32], bestemte vi oss for å analysere CpG island fordelingen i promoter regionen MIR-338-3p av metyl Primer Express v1.0 programvare. Resultatene viste at CpG øyer eksistere i seksjonen (-690 til -241) oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (TSS). Vi undersøkte metylering status av CpG-øyene i promotorområdet ved metylering-spesifikk PCR (MSP), som dekker området -366 til -576 (fig. 2A). Ved å bruke MSP, fant vi at MIR-338-3p CpG island ble omfattende metylert i GC cellelinjer i forhold til i mage mucosal epitel cellelinje (GES-1). Som forventet, behandling med 5-aza induserte signifikant demetylering (Fig. 2B). De representative Resultatene av MSP analyse av MIR-338-3p i GC tumorvev og tilstøtende passet ikke-tumorvev ble vist i fig. 2C. De metylering priser av MIR-338-3p CpG øyer i tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev fra 66 GC pasientene var 78,79% og 24,24%, henholdsvis (** P
. ≪ 0,01, Fig 2D) . Når Receiver Operating Kjennetegn kurve og areal under kurven (AUC) for metylert status av MIR-338-3p i GC ble beregnet, AUC var 0,773 ± 0,042, betydelig høyere enn for nullhypotesen ( P <
0,001), og 95% konfidensintervall var 0,690 til 0,856 (fig. 2E). Dermed kunne metylering status for MIR-338-3p CpG island tjene som en potensiell molekylær markør for GC.

3. MIR-338-3p Hemmer Gastric Cancer Celler Proliferation

Siden MIR-338-3p er betydelig nedregulert i GC, som vist ovenfor, kan det fungere som en tumor suppressor. Derfor neste fastsatte vi enten overekspresjon av MIR-338-3p i magekreftceller kan påvirke cellevekst. Syntetisk MIR-338-3p etterligner eller negative kontrollligner ble transfektert inn SGC-7901 celler der uttrykket nivået av MIR-338-3p er den laveste, etterfulgt av WST analyse for å overvåke cellevekst.

ektopisk uttrykk for MIR-338-3p i SGC-7901-celler ble bekreftet av qPCR og SGC-7901 celler transfektert med MIR-338-3p ligner vokste betydelig tregere enn kontrollgruppen (fig. 3A) (* P
< 0,05, ** P <
0,01). For ytterligere å karakterisere effekten av MIR-338-3p på cellevekst, ble myk-ager kolonidannelse analysen utført. Vi har funnet at antall kolonier fra SGC-7901-celler transfektert med MIR-338-3p etterligner var betydelig mindre enn den til kontrollgruppen (figur 3B-C.) (** P
< 0,01) . Konsekvent, hemming av MIR-338 indusert spredning av SGC-7901 (fig S2 i File S1, * P
. ≪ 0,05). Lignende resultater ble observert i kontroll GES-1 celler (fig S1 A-B i File S1, * P
. ≪ 0,05). Oppsummert disse resultatene antydet at Mir-338-3p undertrykker vekst av både GC-celler og mage epitelceller i
vitro.

4. MIR-338-3p hemmer migrasjon og invasjon av GC Cells in vitro

Basert på ideen om at Mir-338-3p fungerer som en tumor suppressor av GC, vi videre utforsket dens virkninger på celle migrasjon og invasjon, en kritisk determinate av ondartet progresjon og metastasering. Som vist på fig. 4, antall trekkende SGC-7901 celler transfektert med MIR-338-3p ligner var betydelig mindre enn kontrollgruppen (105,00 ± 11,16 vs 145,00 ± 7,00, ** P
. ≪. 0.01 Fig 4 A-B), og antall invasive SGC-7901 celler transfektert med MIR-338-3p ble betydelig mindre sammenlignet med kontrollgruppen (41,33 ± 4,04 vs 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. fig. 4 C-D). Konsekvent, hemming av MIR-338-3p indusert migrasjon og invasjon av SGC-7901-celler (fig S3 i File S1, * P
. ≪ 0,05). I motsetning MIR-338-3p hadde ingen innflytelse på migrasjon av GES-1 (fig. S1 E i File S1), sannsynligvis fordi GES-1 celler mangler migrasjon og invasiv natur av kreftceller. Resultatene viste en rolle MIR-338-3p i begrenser både migrasjon og invasjon av GC-celler.

5. MIR-338-3p kan indusere mage kreft celler Apoptose

For å belyse mekanismen av MIR-338-3p på GC celleveksthemmende effekter, testet vi apoptose analyse av flowcytometri. Resultatene indikerte at apoptotiske hastigheten øker betydelig hos MIR-338-3p ligner transfektert gruppe sammenlignet med kontrollligner transfektert gruppe (** P
< 0,01) (Fig. 5A-B). Vi videre undersøkt morfologiske trekk ved apoptose inkludert kondensert kromatin og kjernekraft fragmentering av Hoechst 33342 flekker, og bekreftet at den apoptotiske hastigheten ble økt i MIR-338-3p ligner transfekterte celler (Fig. 5C). Konsekvent, hemming av MIR-338 hemmet apoptose av SGC-7901-celler (fig S4 i File S1, * P
. ≪ 0,05). Lignende resultater ble observert i kontroll GES-1 celler (Fig S1 C-D i File S1, ** P
. ≪ 0,01). Resultatene indikerte at overekspresjon av MIR-338-3p induserer apoptose i GC-celler, noe som kan bidra til vekst hemmende egenskaper MIR-338-3p.

6. MIR-338-3p Hemmer tumorigenitet og øker apoptose in vivo

Vi neste testet om ektopisk uttrykk for MIR-338-3p kan påvirke vekst og apoptose av mage tumor in vivo .
SGC-7901 celler ble transfektert med MIR-338-3p ekspresjonsvektor (p Silencer
-miR-338-3p) eller kontroll vektor (p Silencer
-miR -kontroll). De stabile kloner med enten p Silencer
-miR-338-3p eller p Silencer
-miR-kontroll ble valgt og injisert subkutant i nakne mus, og det tumordannelse ble overvåket. SGC-7901 celler transfektert med MIR-kontroll viste progressiv vekst, men ble hemmet når ektopisk uttrykk for MIR-338-3p. Etter 28 dager ble musene avlivet nakne, og tumorvektene og volum ble målt (fig. 6 A-E). Den gjennomsnittlige vekten av svulster som følge av pSil encer
-miR-338-3p celler gruppe var betydelig mindre enn svulster fra p Silencer
-miR-kontrollceller gruppe (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, ** P
. < 0,01)

for å undersøke om apoptose bidrar til dette observert in vivo
tumorvekstinhibitering på MIR-338-3p løpet -ekspresjon, TUNEL assay ble utført i tumorvev. Resultatene viste at tumorvev fra p Silencer
-miR-338-3p inneholdt betydelig mer positiv farging celler sammenlignet med kontrollgruppen (** P
. ≪ 0,01, figur 6F-G ). Dermed resultatene indikerte at Mir-338-3p hemmer gastrisk tumorigenesis in vivo
, i det minste delvis ved å indusere apoptose in situ.

7. MIR-338-3p Targets 3'-UTR av onkogen SSX2IP

Som mirnas ofte regulerer uttrykket av målgener, vi søkte MIR-338-3p sin antatte mål ved hjelp av elektroniske søkeverktøy (f.eks TargetScan, Microrna.org og PicTar). Genene spådd av alle brukte programmene ble vurdert søker mål av MIR-338-3p. Blant alle treff, SSX2IP forårsaket vår oppmerksomhet, tidligere studier indikerte at SSX2IP er en akutt myeloid leukemi-assosiert antigen og et potensielt immunterapi mål for leukemi [33] - [35] og vårt tidligere arbeid viste at SSX2IP fremmer invasjonen og migrasjon av leverkreft celler og bidrar til kjemoterapi motstand [36].

en mulig MIR-338-3p bindingssetet ble spådd i 3'UTR av SSX2IP (fig. 7A). For å validere dette samspillet, setter vi en villtype eller mutant 3'UTR fragment av SSX2IP inn i pMIR-RAPPORT luciferase vektor. De resulterende konstruksjonene ble ko-transfektert med MIR-338-3p etterligner eller kontrollligner inn HEK293T celler, etterfulgt av luciferase reporter analysen. Den relative luciferase aktiviteten pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{vekt, men ikke pMIR /SSX2IP-3'UTR Mut, ble betydelig undertrykt av MIR-338-3p (** P
<.. 0,01) sammenlignet med den av (fig 7B) styreetterligner, som indikerer at MIR-338-3p direkte binder til 3'UTR av SSX2IP å fungere som en suppressor}

neste undersøkt innflytelsen av MIR-338-3p på uttrykk for SSX2IP, ved å måle mRNA og proteinnivåer SSX2IP etter transfeksjon SGC-7901 celler med MIR-338-3p eller kontrolletterligner. Som vist på fig. 7C-D, MIR-338-3p hadde ingen effekt på SSX2IP
mRNA nivå målt ved qPCR, men forårsaket betydelig reduksjon av SSX2IP protein nivå sammenlignet med kontroll-transfektert. Disse resultater antyder at MIR-338-3p undertrykker ekspresjonen av SSX2IP på det post-transkripsjonelle nivå, sannsynligvis ved binding til den 3'UTR av SSX2IP. Spesielt, fant vi også at Capase-3 og procasepase-3, to viktige apoptose gener, ble redusert tilsvarende (Fig. 7C).

8. Expression of Mir-338-3p er omvendt korrelert med Expression Nivå SSX2IP Protein i Gastric Cancer

MIR-338-3p er nedregulert i magekreft og SSX2IP støttes til et mål gen av MIR-338 -3p, det fremmes oss å spekulere i at SSX2IP kan være overekspresjon i mage kreft vev og i forhold til matchet ikke-tumorvev.

Immunhistokjemisk analyse av SSX2IP antigen avslørte situasjonen for farging for SSX2IP protein i tumorvev og matchet non-tumorvev i 66 magekreft samples.65% (43/66) av magekreft vev vises forhøyet immuostaining for SSX2IP protein sammenlignet med matchede ikke-tumorvev. vises Spesielt 84% (31/37) av magekreft vev forhøyet farging i GC prøver av MIR-338-3p lav-uttrykk gruppe, mens dataene er 41% (12/29) i MIR-338-3p høy-uttrykk gruppe. Dermed analyse av uttrykket av MIR-338-3p og SSX2IP i mage kreft vev bekreftet eksistensen av invers korrelasjon mellom uttrykket av MIR-338-3p og målet genet SSX2IP (Person Chi-kvadrat test: P
< 0,001, Spearman korrelasjon: r = -0,442, P
< 0,001, figur 8)

9... Ektopisk Uttrykk for SSX2IP redder fenotyper forårsaket av over produserende MIR-338-3p i GC Cells

Hvis SSX2IP er hovedmåltrykkes av MIR-338-3p i GC, bør ektopisk uttrykk for SSX2IP redde fenotyper forårsaket av MIR-338-3p over produksjonen i GC-celler. For å teste denne ideen, og SSX2IP uttrykk vektor eller tom vektor ble individuelt transfektert inn SGC-7901, etterfulgt av cytologiske prøver for å måle celleproliferasjon, migrasjon, invasjon og apoptose. Som forventet, overekspresjon av SSX2IP delvis eller fullstendig reverserer den hemmende effekten av MIR-338-3p i GC-celler på hvert aspekt vi undersøkt (Fig. 9 A-D). På den annen side, har SSX2IP ingen innflytelse på uttrykk for MIR-338-3p (Fig. S5 i File S1). Dermed konkluderte vi at kreften suppressor funksjon av MIR-338-3p i GC er i det minste delvis gjennom å undertrykke sitt mål genet SSX2IP.

Diskusjoner

I denne studien fant vi at den lave uttrykking av MIR-338-3p ble klinisk forbundet med større tumor størrelse, mer lymfeknutemetastase, dypere lokal utbredelse og avansert TNM stadium. På cytologisk nivå, oppregulering av MIR-338-3p inhiberte proliferasjon, kolonidannelsen, invasjon og migrering av magekreftceller. Videre over-uttrykker Mir-338-3p i magekreftceller betydelig redusert tumordannelse i nakne mus in vivo
. Til sammen våre resultater sterkeste at en tumor suppressor rolle MIR-338-3p for magekreft.

mirnas har nylig blitt anerkjent som avgjørende tumor-assosiert regulatoriske forhold. Selv om reguleringsmekanisme av miRNAs uttrykk i tumordannelse er fortsatt uklart, har epigenetisk regulering blitt foreslått å spille en viktig rolle [31], [32]. DNA-metylering forekommer hovedsakelig i CpG øy vanligvis plassert i den promoter-regionen av genet, ca 70% av promotorområdene i det humane genom som er rik på CpG øy [37]. De reduserte uttrykk for Mir-34b, MIR-129 og Mir-10b er alle forårsaket av hypermethylation i arrangører [38], [39]. I samsvar med dette begrepet ble metylering nivået av CpG øyen MIR-338-3p i magekreft vev faktisk funnet høyere enn den til de matchede tilstøtende ikke-tumorvev, noe som tyder på at MIR-338-3p er epigenetiske dempet i GC. Årsaken til dette epigenetisk stillhet MIR-338-3p i magekreft fortsatt ukjent, og vi spekulerer i at faktorer som CagA, som tidligere er rapportert til epigenetiske påvirke uttrykket av microRNAs i magekreft [40], kan delta i denne forskriften . Viktigere er det hyper-metylering status for MIR-338-3p promoter en potensiell biomarkør for magekreft diagnose.

Siden mirnas funksjon gjennom å regulere uttrykket av sine nedstrøms gener, er det avgjørende spørsmålet om hvordan MIR-338- 3p bidrar til GC er hvilket gen (er) den regulerer.

Her har vi identifisert SSX2IP som en viktig roman mål av MIR-338-3p, og gitt både cytologiske og histologiske tegn som tyder på svulsten fremmende rolle SSX2IP i GC. Mange studier indikerte at SSX2IP er en akutt myeloid leukemi-assosiert antigen og et potensielt mål for immunterapi leukemi [33] - [35]. Viktigere SSX2IP ble vist i våre tidligere studier for å fremme motilitet, invasjon og migrering og kjemoterapi motstand av hepatomceller, noe som indikerer dens viktig rolle i utviklingen og metastasering. Den homologe gen i gnagere er ADIP plakater (afadin DIL domene-veksel protein), aminosyresekvensen av ADIP protein i mus og rotte viste 88% og 87% identitet med SSX2IP protein, respektivt. ADIP lokalisert i celle-celle-adherens veikryss, og det kan fremme cellemobilitet ved aktivering Rac1 gjennom Vav2 [41], [42]. Det er spekulert i at SSX2IP kan fremme cellemotilitet, invasjon og metastasering gjennom aktivering Rac1.

Det er interessant uttrykk for Rac1 i mage kreft vev var høyere enn i de matchet tilstøtende ikke-tumorvev, uttrykket nivået var signifikant assosiert med TNM stadium. I 7 gastrisk kreft-cellelinjer, uttrykk for Rac1 var høyere enn i gastrisk mucosal epitelcellelinje (GES-1) [43], som var sammenfallende med den fenomen fant vi med MIR-338-3p i magekreftceller og vev. Disse resultater antyder at MIR-338-3p, som en inhiberende faktor for magekreft, kan redusere ekspresjon av målgen SSX2IP for å undertrykke Rac1 aktivering. Involvering av SSX2IP i flere kreftformer forsterker den biologiske og fysiologiske betydningen av MIR-338-3p /SSX2IP kaskade i kreftutvikling, og har bedt oss om å videre undersøke status for MIR-338-3p /SSX2IP i andre typer kreft. Identifisere andre potensielle mål av MIR-338-3p er også et arbeid som pågår.

I sammendraget, denne studien først beskrevet MIR-338-3p som en svulst suppressor, som ofte forstummet gjennom epigenetisk hypermethylation på arrangøren region i mage kreft. Funksjonelt, hemmer MIR-338-3p de metastatiske egenskaper av GC celler som spredning, migrasjon og invasjon in vitro
, og reduserer tumorgenisiteten av GC-celler ved å indusere apoptose in vivo
. Videre identifiserte vi SSX2IP som et viktig mål gen av MIR-338-3p i GC utvikling.

• PLoS ONE: Postoperativ kjemoradioterapi versus Postoperativ kjemoterapi for Completely resected Gastric Cancer med D2 lymphadenectomy: A Meta-Analysis
• PLoS ONE: Mir-184 Binding-Site rs8126 T > C polymorfisme i TNFAIP2 er forbundet med risiko for magekreft