PLoS ONE: Epigenetske Ušutkavanje od Mir-338-3p Doprinosi torn smjeru u rak želuca ciljajući SSX2IP

Sažetak pregled

mikrornk nedavno je prepoznata kao igrati važnu ulogu u nastanku tumora i metastaza. Evo, javili smo da Mir-338-3p epigenetically su utihnuli kod raka želuca, a Smanjivanje bilo značajno povezano sa rakom želuca kliničkopatološkim značajke. Nevjerojatno, vraćanje Mir-338-3p izraz u SGC-7901 stanica raka želuca inhibirana proliferacija, migracija, invazije i torn smjeru In vitro pregled i in vivo pregled, barem djelomično, kroz indukciju apoptoze. Osim toga, mi pokazati onkogena SSX2IP je meta Mir-338-3p. Predlažemo da Mir-338-3p djeluje kao supresor tumora kod raka želuca, a status metilacije svog otoka CpG mogla poslužiti kao potencijalni dijagnostički biljeg za karcinom želuca pregled

Izvor:. Li P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) Epigenetske Ušutkavanje od Mir-338-3p Doprinosi torn smjeru u rak želuca ciljajući SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782 pregled

Urednik: Alfons Navarro, Sveučilište u Barceloni, Španjolska pregled

Primljeno: 17 siječnja 2013; Prihvaćeno: 10. svibnja 2013; Objavljeno: 24. lipnja 2013 pregled

Copyright: © 2013 Li i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od potpora iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (brojeva 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 i 81272749), znanosti i tehnologije komisije općine Šangaj (brojeva 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 i 101409042000), Šangaj Key Discipline ( S30204) i ključnih projekata u Nacionalnom Science & Tehnologija Stup program Kina (brojevi 2008BA152B03 i 2011BA203191), Kina Postdoktorska Science Foundation (broj 2011M500796). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da nema suprotstavljenih interesa postoji

Uvod

rak želuca je zloćudni tumor s visokom incidencijom i drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1]. Rana dijagnostika stopa raka želuca je nizak, a pacijenti su obično teško biti dijagnosticiran dok se rak razvio u uznapredovalom stadiju ili metastaza. Dakle, to je od velikog značaja za obavljanje in-dubina istraživanja o patogenezi karcinoma želuca i tražiti nove molekularne odluka i terapijskih ciljeva. Pregled

mikroRNA su male RNA koji reguliraju ekspresiju gena, i oni su uključeni u različitim biološkim signalnih puteva [2]. Višestruke studije su pokazale značajnu razliku mikroRNA izražavanja profiliranje između tumorskih stanica i stanica dobivenih iz normalnih tkiva, što znači da su mikroRNA igrao važnu ulogu u nastanku tumora [3], [4]. Dakle, mikroRNA nedavno postao Hotspot genetske dijagnostike i liječenja cilja kao nove onkogena ili gena za suzbijanje [5], [6]. Abnormalna izraz mikroRNA u tkivima ili serumu je usko povezan s više ljudskih malignih bolesti, uključujući rak želuca [7], [8], i nekoliko down-regulirane mikroRNA u želučanog tkiva raka imaju funkcije tumorskih suzbijanju. Na primjer, neka-7 mikrornk obitelj prvi puta naći kao represor RAS, potiskujući RAS i c-myc izražavanja na prijevodni razini [9]. Razina izraz neka-7a znatno je smanjen u želučanim tumora, dok je Ras protein je značajno viša u želučanoj tumora [10]. Štoviše, Mir-15b, Mir-16 i Mir-21 itd su povezani s razvojem i kliničke dijagnoze raka želuca [11], [12]. Naša grupa je također objavljen i antikancerogeno ulogu Mir-126, Mir-409-3p i Mir-155 kod raka želuca [13] - [15] pregled

mikrornk mikropostrojima je provedena za otkrivanje Mirne profile u želuca. rak, a otkrili smo da mir-338-3p bio je znatno niže regulirano (neobjavljeni podaci). Mir-338-3p, koji se nalazi na kromosomu 17q25.3 s dužinom od 22 nt, prvi put objavljenog u prion-inducirana neurodegenerativnih promjena kao izraza Mir-338-3p je smanjena u mozgu miševa inficiranih s mišem prilagođen struže [ ,,,0],16]. Mir-338-3p mogu regulirati razinu mRNA gena domaćina Apoptoza povezane tirozin-kinaze (AATK) u neuronima štakora [17]. S druge strane, miR-338-3p bila viša u bolesnika s povremenim amiotrofične lateralne skleroze (VRI), druga vrsta živčanog sustava lezija [18]. Važnije, uloga Mir-338-3p u nastanku tumora je ranije predložio, kao Mir-338-3p dolje je regulirano karcinoma rektuma [19], a reguliran je hepatitis B virus X proteina (HBx) da inhibiraju proliferaciju i invaziju od stanicama hepatoma vezivanjem na ciljnih gena CyclinD1 i zaglađena u hepatocelularnog karcinoma [20] - [22]. Međutim, uloga Mir-338-3p u GC je još uvijek nepoznat. Pregled

U ovom istraživanju smo dodatno analizirati ekspresiju-dolje reguliranje Mir-338-3p u GC tkiva u usporedbi s pacijenta podudara normalno tkiva, a utvrđeno je da razina ekspresije Mir-338-3p usko je povezana s kliničko varijabli GC. Ektopijska ekspresija Mir-338-3p inhibira proliferaciju, invaziju i metastaziranje stanica raka želučanog, smanjuje sposobnost tumorogene želučanih stanica karcinoma u miševima i potiče apoptozu. Mi također pokazuju da je Mir-338-3p može funkcionirati kao supresor tumora izravno ciljanje SSX2IP. Dakle, naši rezultati ukazuju na to da Mir-338-3p je potencijalni dijagnostički marker i terapijski cilj je od raka želuca. Pregled

Materijali i metode pregled

1. Staničnih linija i kultura pregled

Ljudski rak želuca stanične linije SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 i AGS su kupljene od Šangaj instituta za biološke znanosti, Kineske akademije znanosti [23] - [26]. KATO-III i SNU-1 kupljeni su od ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 i MKN45 dobiveni su iz japanske Cancer Research potencijala banke [28], besmrtnim želuca epitelnih stanica linije, GES -1, bio je dar od prof Feng Bi (Huaxi bolnice, Sveučilište Sichuan, Chengdu, Sichuan provincije, NR Kina) [29], [30]. HEK293T, ljudskog embrija stanice bubrega, bio je sačuvan u našem institutu. U staničnim linijama raka želučanih su uzgajane u RPMI1640 uz dodatak 10% FBS (fetalni goveđi serum) pri 37 ° C u vlažnoj atmosferi 5% CO2. HEK293T stanice su uzgojene u DMEM (Dulbecco-ov modificiran Eagle-ov medij) uz dodatak istim uzgojenom stanju, gore. Pregled

2. Etika Izjava pregled

Pismeni informirani pristanak u studiju koji je dobiven od svih sudionika. Protokol istraživanja je odobren od strane etičkog povjerenstva Ruijin bolnice Medicinskog fakulteta, Shanghai Jiao Tong University. Pregled

3. Uzorci tkiva

Primarni želučani tkiva raka i podudarni ne-tumorskih tkiva prikupljeni su od 66 bolesnika podvrgnutih radikalnu gastrostomy na Odjelu za kirurgiju Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Nijedan od pacijenata primili predoperativnu terapiju. Svi uzorci tkiva su prikupljeni s informirani pristanak pacijenta, a potvrđuje patološkog pregleda, a histološki tipkati se temelji na Laurenov klasifikacije. TNM klasifikacija definicije su u skladu s Međunarodne unije protiv raka (2002). Pregled

4. RNA i qPCR pregled

Ukupna RNA je izolirana iz staničnih linija i uzoraka tkiva u mir
Vana ™ Mirna izolacije Kit (tnom City, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača. Kvaliteta i količina RNA uzoraka ispitana standardnim elektroforezom i spektrofotometrijska metoda. Razina izraz Mir-338-3p u staničnim linijama i uzorcima tkiva mjeren je qPCR i obračunava kao što je opisano [13]. Razina ekspresije mRNA SSX2IP mjerena je qPCR prema TaqMan® Gene Expression određivanje aktivnosti protokol (Applied Biosystems). Razina GAPDH mRNA se koristi za normalizaciju. Pregled

5. DNA Izolacija i metiliranje analiza pregled

Genomska DNA iz uzoraka tkiva je očišćen pomoću DNAzol (Invitrogen). Natrijev bisulfit konverzija provedena pomoću Qiagen Epitect bisulfit Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. U metilacije statue je izvela metilacije specifičnom PCR (MSP). Primeri za meliliranom ili unmethylated DNA su dizajnirani od strane softvera metil Primer Express v1.0 (ABI) .The metilacije naprijed klica za CpG Mir-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 ', a zadnji primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ', u unmethylation naprijed klica za CpG Mir-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' i reverznog primera: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 'pregled

6.. Prolazna Transformacija Mirna oponaša pregled

Mirna-338-3p oponaša i negativni oponaša kontrolu su kupljene od GenePharma (Shanghai, Kina) .Cells su posađene u staničnu kulturu ploče 20 sata prije transfekcije kako bi se osiguralo 70% ušće stanica u trenutak ubacivanja. Transformacija Mirna oponaša u stanice vrši se upotrebom Lipofectamine2000 (Invitrogen) prema postupku proizvođača. Mirne oponaša radio u konačnoj koncentraciji od 100 nM. U 48 sati poslije infekcije, qPCR i Western blot su izvedene. Pregled

7. Test stanične proliferacije pregled

proliferacija stanica je određena WST (topljiva u vodi tetrazolium sol) Test pomoću brojanja Kit-8 (Dojindo) prema uputama proizvođača. 24 h nakon transfekcije s Mirni oponaša, stanice (2 x 10 ^{3 stanica /jažici) su sjeme u pločicama s 96 jažica. Ploče su inkubirane tijekom 5 dana. Broj viabilnih stanica određena je mjerenjem apsorbancije na 450 nm. Pregled}

8. Mekom agaru Colony Formacija Test pregled

GC stanice transfecirane Mirni oponaša su ponovno suspendirane s 0,3% -tnim mekanom agaru u RPMI1640 koji sadrži 10% FBS i slojevito na 0.6% agar skrutne u RPMI1640 koji sadrži 10% FBS na ploče sa 6 jažica (1 × 10 ^{3 stanica /jažici). Ploče se inkubiraju na 37 ° C u vlažnoj atmosferi s 5% CO _{2. Kolonije koje sadrže najmanje 50 stanica su izbrojani. Pregled}}

9. Migracija stanica i Test invazije pregled

Migracija stanica je izvedena primjenom QCM ^{TM24-Pa Colorimetric Assay Kit migracije (Millipore) u skladu s uputama proizvođača. Za test invazije, Cell Test invazije Kit (Millipore) se koristi u skladu s uputama proizvođača. Stanice (1 × 10 5) u 300 ul medija bez seruma doda se u gornje komore i uzgajani 48 h. Ne-migrirajući, bilo ne-napada stanice su uklonjene sa pamuk brisevi, stanicama koji su migrirali ili izvršile invaziju na dno membrane obojene su s puferom, stanice mrlja predviđen u assay opreme i izbrojene pod mikroskopom i fotografiran. Tri neovisna eksperimenta u istim uvjetima. Pregled}

10. Apoptoza analiza pregled

analiza Stanična apoptoza provedena je s Annexin V-FITC apoptoze Detection Kit I (BD) u skladu s uputama proizvođača. Svaki test je izveden u tri ponovljena tri puta samostalno. Značajka nuklearne skupljanje povezan s apoptoze pokazala Hoechst 33342 (Beyotime) prema protocol.The morfologija je vizualizirana fluorescentnim mikroskopom koja je ekscitiran valna duljina 350 nm i mjerena na 460 nm. Pregled

11. Izgradnja plazmida i Luciferaze Aktivnost pregled

fragment divljeg tipa (wt) sintetizirani su 3'UTR SSX2IP ili web mutant (MUT) 3'UTR SSX2IP sadrži potencijalni Mir-338-3p vezna mjesta , Fragmenti su klonirani u vektor pMIR-izvještaj za luciferazu (Ambion) koji sadrži Firefly
i nazvali pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{WT i pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells su sjeme u 24 jažica 24 sata prije transfekcije. 500 ng /pMIR SSX2IP-3'UTR wt ili pMIR /SSX2IP-3'UTR mut transfecirani su u svaku jažicu, zajedno s 20 ng pRL-TK vektorom (Promega) koji sadrži Renilla
luciferaze i 60 pmol Mir-338-3p ili kontrolne oponaša. Stanice su sakupljene nakon 48 h transfekcije. Firefly pregled i Renilla pregled aktivnosti luciferaze su izmjerene pomoću Dual-luciferaza reporter (Promega) prema uputama proizvođača. Pregled}

12. Stabilna transfekcija miR-338-3p Expression Vector pregled

pSilencer-miR-338-3p vektora pSilencer-miR kontrolu vektor se transficira u SGC-7901 stanice, odnosno pomoću Lipofectamine2000 (Invitrogen), a odabrani s 100 ug /ml higromicina B (Invitrogen) tijekom 4 tjedna. Stabilno transficirana stanična klonovi su pokupili i održavani na pola koncentracije odabira. Pregled

13. Tumorski modelu ksenografta pregled

SGC-7901 stanice (2 × 10 ^{6 stanica /miš) stabilno transfektirane s pSilencer-Mir-338-3p ili pSilencer kontrole vektora su potkožno ubrizgane u četiri tjedna starog mužjaka golih miševa (Institut za zoologiju, kineske akademije znanosti, Shanghai, Kina) .The miševi su provjereni tjedno, tumorske noduli su izmjereni šestarom. Miševi su eutanazirani 4 tjedna nakon ubrizgavanja, a tumori su uklonjeni i izvagani. Volumen tumora je procijenjena pomoću sljedeće formule:. Volumen = (širina + dužina) /2 × dužina širina × × 0.5236.Tumor krivulje rasta su izračunate pregled}

14. Imunohistokemijski pregled

Detekcija SSX2IP izvedena je na parafinskim rezovima, s anti-SSX2IP protutijela (Abcam, razrjeđivanje 1:1000). Imunološki kompleks je vizualizirana sa Dako REAL ^{TMEnVision ™ sustav detekcije, peroksidaze /DAB, Rabbit /Miš (Dako), u skladu s postupkom proizvođača. Jezgre su prebrojane s hematoksilinom. Pregled}

15. Statistička analiza pregled

Odnos između Mir-338-3p razine ekspresije i kliničko parametara analiziran od strane osobe X pregled, ^{2 test. Razlike među skupinama su analizirane pomoću Student t pregled testa. Sve statističke analize provedene su pomoću softvera SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) i P izvoznici < 0.05 je smatrana značajnom pregled}

Rezultati pregled

1. , Ekspresiju Mir-338-3p je Down-regulirana u GC staničnim linijama i tkivima pregled

Kako bi istražili ulogu Mir-338-3p u GC, prvo smo u odnosu na razinu ekspresije Mir-338-3p u osam želučani rak staničnih linija neuginulog normalnim želučane sluznice epitelnih stanica linije (GES-1). Kao što je prikazano na slici. 1A, Mir-338-3p značajno dolje regulirano staničnim linijama GC usporedbi s GES-1. Da biste potvrdili ovaj rezultat, mi također usporedili izraze Mir-338-3p u GC tkiva i susjednih ne-tumorskih tkiva. 66 GC paru uzorci su uključeni u ovu studiju. Rezultati pokazuju da je prosječna razina ekspresije Mir-338-3p bio značajno podregulirani u tumorskim tkivima u odnosu na susjedne non-tumorskim tkivima (Sl. 1B). Nadalje, rasvijetlio je povezanost ekspresije Mir-338-3p i kliničko faktora. Kao što je prikazano u tablici 1. 59,1% (39/66) uzoraka GC je pokazala-naniže Mir-338-3p ispod dvojak cut-off (relativni omjer izraz < 0,5), ova situacija se smatra da će biti značajno dolje -regulated. Na temelju tog cut-off, a 66 klinički slučajevi bili su podijeljeni u dvije skupine: Mir-338-3p niža ekspresija skupina (n = 39) i Mir-338-3p veći izraz (n = 27). Niži izraz skupina pokazala sklonost prema većoj veličini tumora, više limfnih čvorova metastaze, dubljim lokalne invazije i naprednije TNM stadiju, ali bez značajne korelacije s dobi, spola ili histološka tipa (Tablica 1). Pregled

2. Mir-338-3p Epigenetically je ušutkan u rak želuca Netlogu

Kao epigenetičko utišavanje je čest sredstvo za down-regulacije Mirna izraza [31], [32], odlučili smo analizirati CpG otok distribucija u promotoru područje Mir-338-3p strane metil Primer Express v1.0 softvera. Rezultati su pokazali da su CpG otoci postoje u dijelu (-690 do -241), uzvodno od transkripcijskog početnog mjesta (TSS). Ispitali smo status metilacije CpG otoka na promotorske regije po metilacije specifičan PCR (MSP), koja pokriva područje -366 do -576 (sl. 2a). Korištenjem MSP, otkrili smo da je Mir-338-3p otok CpG opsežno je metiliran u staničnim linijama GC odnosu na želučane sluznice epitelnih stanica linije (GES-1). Kao što se očekivalo, tretman s 5-aza inducirane značajan demetiliranje (sl. 2b). Reprezentativni rezultati MSP analize Mir-338-3p u GC tumorskim tkivima i odgovarajuće susjednim ne-tumorskih tkiva su prikazani na slici. 2C. U metilacije stope Mir-338-3p CpG otoka u tumorskim tkivima i susjednih ne-tumorskih tkiva od 66 GC pacijenata bili su 78,79%, odnosno 24,24%, respektivno (** P pregled. ≪ 0.01, Slika 2D) , Kada su izračunate na prijemnik radnim karakteristikama krivulja i površina ispod krivulje (AUC) za metiliranom status Mir-338-3p u GC, AUC je bio 0,773 ± 0,042, što je znatno veći nego da od nulte hipoteze ( P <
0,001), a 95% intervala pouzdanosti je 0.690 do 0,856 (Sl. 2e). Dakle, metilacije status Mir-338-3p otoku CpG mogla poslužiti kao potencijalni molekularni marker za GC. Pregled

3. Mir-338-3p Koči rak želuca stanice proliferacije pregled

Od Mir-338-3p je značajno pale regulirano u GC, kao što je prikazano gore, to može djelovati kao supresor tumora. Stoga, sljedeći utvrditi je li pretjerano izlučivanje Mir-338-3p u želučanih stanica raka može utjecati na rast stanica. Sintetička Mir-338-3p oponaša ili negativnim oponaša kontrolu klonovi ubačeni u SGC-7901 stanice u kojima je razina ekspresije Mir-338-3p je najniža, a slijede WST testom za praćenje rasta stanica. Pregled

ektopijska ekspresija Mir-338-3p u SGC-7901 stanica potvrđena je qPCR i SGC-7901 stanica s transfektiranim miR-338-3p oponaša rasli znatno manja u odnosu na kontrolnu skupinu (Sl. 3A) (* P
0,05, ** P < pregled 0,01). Za daljnju karakterizaciju učinak Mir-338-3p na rast stanica, soft-ager test koloniziranje je izvedena. Pronašli smo da je broj kolonija sa SGC-7901 stanica s transfektiranim miR-338-3p oponaša bila je značajno manje od onog iz kontrolne skupine (Slika 3B-C.) (** P pregled < 0,01) , Dosljedno, inhibicija Mir-338 inducirane proliferacije SGC-7901 (Sl S2 u File S1, * P pregled. ≪ 0,05). Slični su rezultati uočeni u kontroli GES-1 stanice (Slika S1 A-B u File S1, * P pregled. ≪ 0,05). Ukratko, ovi rezultati sugeriraju da je Mir-338-3p potiskuje rast obaju GC stanica i želučanih epitelnim stanicama na pregled, vitro.

4. Mir-338-3p tako inhibira migraciju i Invazija GC stanicama In vitro

Na temelju ideje da Mir-338-3p služi kao tumor supresor GC, možemo dodatno istražiti njegove učinke na migracija stanica i invazija, kritički određenje maligne napredovanja i metastaze. Kao što je prikazano na slici. 4, broj migracijskih SGC-7901 stanicama zaraženim s Mir-338-3p oponaša bio je znatno manje nego u kontrolnoj skupini (105,00 ± 11,16 vs 145,00 ± 7,00, ** P pregled. ≪. 0.01 Slika 4 a-B), te broj invazivnih SGC-7901 stanice transfektirane Mir-338-3p je znatno manje u odnosu na kontrolnu skupinu (41.33 ± 4.04 vs 76 ± 10,54 ** P pregled < 0.01. sl. 4 C-D). Dosljedno, inhibicija Mir-338-3p inducirane migracije i invazije SGC-7901 stanica (Slika S3 File S1, * P pregled. ≪ 0,05). Nasuprot tome, Mir-338-3p imala nikakav utjecaj na migraciju GES-1 (Sl. S1 E File S1), vjerojatno zato GES-1 stanice nemaju migraciju i invazivne prirode stanica raka. Ovi rezultati prikazuju ulogu Mir-338-3p u inhibiciji i migraciju i invaziju GC stanicama. Pregled

5. Mir-338-3p mogu izazvati rak želuca Stanice Apoptoza pregled

Da se razjasni mehanizam Mir-338-3p na učinke inhibicije rasta GC stanica, testirali smo apoptozu analizu protočnom citometrijom. Rezultati su pokazali da je apoptoze stopa bila značajno povećana u Mir-338-3p imitira transficirana skupini u odnosu na kontrolnu oponaša transficirana skupini (** P izvoznici < 0,01) (Sl. 5A-B). Mi dalje ispituje mogućnosti morfološke apoptoze uključujući kondenzirane kromatina i nuklearne fragmentacije Hoechst 33342 bojenja, a potvrdio je da je apoptoze stopa povećana na Mir-338-3p oponaša transfektirane stanice (Sl. 5c). Dosljedno, inhibicija Mir-338 inhibiran apoptoze SGC-7901 stanica (Slika S4 u File S1, * P pregled. ≪ 0,05). Slični rezultati su opaženi u kontrolnim GES-1 stanice (Sl S1 C-D u File S1, ** P pregled. ≪ 0,01). Ovi rezultati pokazuju da prekomjerna ekspresija Mir-338-3p inducira apoptozu u GC stanicama, što može doprinijeti inhibitornih svojstava rasta Mir-338-3p. Pregled

6. Mir-338-3p Koči torn smjeru i povećava apoptozu In vivo

Mi smo sljedeći testirali da li izvanmaternične izraz Mir-338-3p mogli utjecati na rast i apoptozu želučane tumora in vivo .
SGC-7901 stanice su transfektirane s miR-338-3p ekspresijski vektor (p Prigušivač pregled -miR-338-3p) ili kontrolni vektor (p Prigušivač pregled -miR -kontrolirati). Stabilni klonovi s bilo p prigušivačem pregled -miR-338-3p ili p Silencer pregled -miR kontrole su odabrani i ubrizgava potkožno u gole miševe, te formiranje tumora je praćen. SGC-7901 stanice transficirane s Mir-kontrola pokazala postupni rast, ali su inhibirane kada izvanmaterničnu ekspresiju Mir-338-3p. Nakon 28 dana, golih miševa su eutanazirani i mjereni su tumorske mase i volumena (Sl. 6 A-E). Prosječna težina tumora koji proizlaze iz pSil encer pregled -miR-338-3p stanice grupa je bila znatno manje od tumora od p Silencer
-miR-kontrolne stanice grupa (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229.52 mg, ** p pregled. < 0,01) pregled

kako bi ispitati da li apoptoza pridonosi tome primijetio in vivo
tumora inhibiciju rasta nakon Mir-338-3p više -expression, TUNEL test je izveden u tumorskim tkivima. Rezultati su pokazali da tumorsko tkivo iz p Silencer pregled -miR-338-3p sadržavao znatno više pozitivno bojenje stanica u usporedbi s kontrolnom skupinom (** P pregled. ≪ 0.01, Slika 6F-G ). Dakle, naši rezultati pokazuju da Mir-338-3p inhibira želučane tumorigenezi in vivo pregled, barem djelomično pomoću poticanja apoptoze in situ. Pregled

7. Mir-338-3p Ciljevi 3'-UTR onkogena SSX2IP

Kao miRNAs često reguliraju ekspresiju ciljnih gena, tražili smo navodne ciljeve Mir-338-3p a koriste online alate za pretraživanje (npr TargetScan, Microrna.org i PicTar). Geni predvidio svih korištenih programa smatrani su mete kandidata Mir-338-3p. Od svih hitova, SSX2IP izazvao našu pažnju, prethodne studije pokazuju da SSX2IP je akutna mijeloična leukemija-associated antigen i potencijalni imunoterapija meta leukemije [33] - [35] i naš dosadašnji rad pokazao da SSX2IP promiče invaziju i migraciju stanice karcinoma hepatocelularnog i pridonosi otpornosti kemoterapije [36]. pregled

Jedan potencijalni mir-338-3p vezno mjesto je predvidio u 3'UTR SSX2IP (sl. 7a). Da bi potvrdili ovu interakciju, stavili smo divlji tip ili mutirani 3'UTR fragment SSX2IP u luciferaze vektor pMIR-izvješće. Dobivene konstrukcije bile su kotransfektirane sa miR-338-3p imitira ili za kontrolu oponaša u HEK293T stanica, nakon čega slijedi reporterskog testa. Relativna aktivnost luciferaze od pMIR /SSX2IP-3'UTR ^{mas, ali ne pMIR /SSX2IP-3'UTR mut, značajno je potisnuto Mir-338-3p (** P
<,. 0,01), u usporedbi s onim kod kontrolnih imitira (Slika 7B), što znači da miR-338-3p izravno veže na 3'UTR SSX2IP funkcionirati kao sredstvo za suzbijanje pregled}

sljedeći ispitali utjecaj Mir-338-3p na ekspresiju SSX2IP, mjerenjem mRNA i proteina razina SSX2IP nakon transfekcije SGC-7901 stanica sa Mir-338-3p ili kontrolne oponaša. Kao što je prikazano na slici. 7C-D, miR-338-3p nije imao učinka na SSX2IP
razini mRNA, mjereno qPCR, ali uzrokuje značajno smanjenje razine SSX2IP proteina u usporedbi s kontrolnim transfektirane. Ovi rezultati ukazuju da miR-338-3p potiskuje ekspresiju SSX2IP na post-transkripcijskoj razini, vjerojatno putem vezanja na 3'UTR SSX2IP. Naime, mi smo također otkrili da capase-3 i procasepase-3, dvije važne apoptoze geni, smanjeni su u skladu s tim (Sl. 7C). Pregled

8. Ekspresiju Mir-338-3p je obrnuto s izrazom Razina SSX2IP proteina u rak želuca Netlogu

Mir-338-3p je reguliran u rak želuca i SSX2IP podržan na ciljani gen Mir-338 -3p, to nam promaknut u nagađati da SSX2IP može biti pojačana ekspresija u želučanim tkiva raka iu odnosu na podudarne ne-tumorskih tkiva. pregled

Imunohistokemijska analiza SSX2IP antigena otkriva situaciju bojenja za SSX2IP proteina u tumorskim tkivima i uskladiti ne-tumorskih tkiva u 66 želučanog karcinoma samples.65% (43/66) želučanog tkiva raka prikazan povišen immuostaining za SSX2IP proteina u usporedbi s podudarnim ne-tumorskih tkiva. Konkretno, 84% (31/37) želučanog tkiva raka prikazan povišen imunološkeg u uzorcima GC od Mir-338-3p niske ekspresije skupine, a podaci se 41% (12/29), u Mir-338-3p visoke izraz skupina. Dakle, analiza ekspresije Mir-338-3p i SSX2IP u želučanim tkiva raka potvrdio postojanje inverzne korelacije između ekspresije Mir-338-3p i njegove ciljnih gena SSX2IP (osoba hi-kvadrat test: P izvoznici < 0,001, Spearman Korelacija: r = -0,442, P izvoznici < 0,001, Slika 8) pregled

9... Ektopično Izražavanje SSX2IP spašava fenotipova zbog prevelikog proizvode Mir-338-3p u GC stanicama

Ako SSX2IP je glavni cilj potisnuti Mir-338-3p u GC, izvanmaternične izraz SSX2IP trebao spasiti fenotipova uzrokovana Mir-338-3p tijekom proizvodnje u GC stanicama. Za testiranje ove ideje i SSX2IP ekspresijski vektor ili prazan vektor pojedinačno transfektirani u sGC 7901, nakon čega slijedi citološke analize za mjerenje proliferacije stanica, migracije, invazije i apoptozu. Kao što se očekivalo, pojačanom ekspresijom SSX2IP djelomično ili potpuno poništava inhibicijski učinak Mir-338-3p u GC stanicama na svaki aspekt ispitivali smo (Sl. 9 A-D). S druge strane, SSX2IP nema utjecaja na ekspresiju Mir-338-3p (Sl. S5 u File S1). Dakle, zaključili smo da je rak supresorski funkcija Mir-338-3p u GC je barem djelomično kroz suzbijanju svoj cilj gena SSX2IP. Pregled

Rasprava pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da je niska -expression od Mir-338-3p klinički je bio povezan s većim veličine tumora, više limfnih čvorova metastaze, dubljim lokalne invazije i napredne TNM stadiju. Na citološku razini, up-regulaciji Mir-338-3p inhibiran proliferacije, stvaranje kolonija, invazije i migracije želučanih stanica raka. Osim toga, pretjerano izražavanje Mir-338-3p u želučanim stanicama raka znatno smanjen tumorigenezi na miševe in vivo pregled. Uzeti zajedno, naši rezultati snažno sugeriraju tumor supresorski ulogu Mir-338-3p za rak želuca. Pregled

MiRNAs su nedavno prepoznat kao ključna povezanih s tumorom regulatornih čimbenika. Iako je mehanizam regulacije ekspresije miRNAs u nastanku tumora je još uvijek nejasno, epigenetičko propis je sugerirao da igraju važnu ulogu [31], [32]. DNA metilacije se javlja uglavnom na otoku CpG najčešće nalazi u području promotora gena, oko 70% od regije promotora u ljudskom genomu obiluje otok CpG [37]. Smanjene izrazi Mir-34b, Mir-129 i Mir-10b svi su uzrokovane Hipermetilacija u promotorima [38], [39]. U skladu s tim pojmom, razina metilacije CpG otoku Mir-338-3p u želučanog tkiva raka, istina je pronađena veća od one podudarne susjednih ne-tumorskih tkiva, što ukazuje da je Mir-338-3p epigenetically je ušutkan u GC. Uzrok ovog epigenetičke tišini Mir-338-3p kod raka želuca i dalje izmiče, a mi nagađati da faktori kao što su CagA, koji je ranije objavljeno da epigenetically utječu na ekspresiju mikroRNA u rakom želuca [40], može sudjelovati u tom propisu , Važno je, hiper-metilacije status Mir-338-3p promotor je potencijalni biomarker za dijagnozu raka želuca. Pregled

Od miRNAs funkciji kroz koji regulira ekspresiju svojih nizvodno gena, ključno pitanje o tome kako Mir-338- 3p doprinosi GC koji gen (e) to uređuje. pregled

Ovdje smo identificirali SSX2IP kao važan novi cilj Mir-338-3p, i pod uvjetom da oba citološku i histološku dokaze koji ukazuju na tumor-promicanje uloge SSX2IP u GC. Mnoge studije pokazale su da SSX2IP akutna mijeloična leukemija povezan antigen i potencijalna meta imunoterapija leukemije [33] - [35]. Važno je, SSX2IP je prikazano u našim prethodnim studijama za promicanje pokretljivosti, invaziju i migraciju i kemoterapijom otpor stanicama hepatoma, što ukazuje na njegovu važnu ulogu u razvoju i metastaze. Njegov homologni gen kod glodavaca je ADIP pregled (afadin dil domene interakcije proteina) je aminokiselinski slijed ADIP proteina u miša i štakora pokazala je 88% i 87% identičnosti sa proteinima SSX2IP, respektivno. ADIP lokaliziran u međustanične adherens čvorišta, i to može promovirati mobilnost stanice aktivirajući Rac1 kroz Vav2 [41], [42]. Pretpostavlja se da SSX2IP može potaknuti staničnu pokretljivost, invaziju i metastaziranje kroz aktiviranje Rac1. Pregled

Zanimljivo je da je izraz Rac1 u želučanim tkiva raka, bila je veća nego u podudarne susjedne ne-tumorskih tkiva, njegova razina ekspresije bila je znatno povezana s TNM fazi. U 7 želuca staničnim linijama karcinoma, izrazi Rac1 bile su veće nego u želučane sluznice epitelnih stanica linije (GES-1) [43], koji je poklopio s pojavom smo našli sa Mir-338-3p u želučanih stanica raka i tkiva. Ovi rezultati ukazuju da miR-338-3p kao čimbenik inhibicije raka želuca, može smanjiti ekspresiju ciljnog gena SSX2IP potiskivanja Rac1 aktivaciju. Uključenost SSX2IP u više oblika raka pojačava biološke i fiziološke značaj Mir-338-3p /SSX2IP kaskade u razvoju raka, te potakla nas je da se dodatno istraži status Mir-338-3p /SSX2IP u druge vrste raka. Prepoznavanje ostale potencijalne mete Mir-338-3p je također u tijeku. Pregled

Ukratko, ova studija prvi opisao Mir-338-3p kao supresor tumora, što je često prigušivačem kroz epigenetičke Hipermetilacija na promotora regija u želučanim raka. Funkcionalno miR-338-3p inhibira metastatskih značajke GC stanicama, kao što su proliferaciju, migraciju i invaziju in vitro
te smanjuje tumorogenosti GC stanica pomoću poticanja apoptoze in vivo pregled. Nadalje, utvrdili smo SSX2IP kao ključni ciljnog gena Mir-338-3p u razvoju GC. Slika S1. Slika S2. Slika S3.

• PLoS ONE: Postoperativni kemoradioterapiji odnosu postoperativna kemoterapija kompletnom resekcijom rak želuca s D2 Limfadenektomija: meta-analiza
• PLoS ONE: Mir-184 Uvez-Site rs8126 T &C Polimorfizam u TNFAIP2 je povezana s rizikom od želučani Cancer