PLoS ONE: Epigenetische Silencing van miR-338-3p Draagt ​​bij aan tumorvorming bij maagkanker door zich te richten SSX2IP

Abstract

MicroRNA is onlangs erkend als een prominente rol spelen in het ontstaan ​​van tumoren en metastase. Hier vermelden wij dat miR-338-3p epigenetisch stil bij maagkanker, en de down-regulatie was significant gecorreleerd met maagkanker klinische en pathologische kenmerken. Opvallend is het herstel van miR-338-3p expressie in SGC-7901 maagkanker cellen remde proliferatie, migratie, invasie en tumorigeniteit In vitro Kopen en In vivo
, althans gedeeltelijk door het induceren van apoptose. Verder tonen we het oncogen SSX2IP is een doelwit van miR-338-3p. Wij stellen voor dat miR-338-3p functioneert als een tumor suppressor bij maagkanker, en de methylatie status van zijn CpG eiland als een potentiële diagnostische marker voor maagkanker kunnen dienen

Visum:. Li P, Chen X, Su L, Li C, Q Zhi, Yu B, et al. (2013) Epigenetische Silencing van miR-338-3p Draagt ​​bij aan tumorvorming bij maagkanker door zich te richten SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10.1371 /journal.pone.0066782

Editor: Alfons Navarro, Universiteit van Barcelona, ​​Spanje

Ontvangen: 17 januari 2013; Geaccepteerd: 10 mei 2013; Gepubliceerd: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nummers 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 en 81272749), Wetenschap en Technologie Commissie van Shanghai gemeente (nummers 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 en 101.409.042.000), Shanghai Key Discipline ( S30204), en Key Projecten in de National Science & Technology Pillar Program van China (nummers 2008BA152B03 en 2011BA203191), China Postdoctorale Science Foundation (nummer 2011M500796). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de bereiding van manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een maligniteit met een hoge incidentie en de tweede belangrijke oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. De vroege diagnose tarief van maagkanker is laag, en de patiënten zijn meestal moeilijk te worden gediagnosticeerd totdat de kanker zich heeft ontwikkeld tot een vergevorderd stadium of metastase. Het is dus van groot belang in diepgaande studie uit te voeren over de pathogenese van maagkanker en te zoeken naar nieuwe moleculaire merkers en therapeutische doelwitten.

MicroRNAs zijn kleine RNA dat de genexpressie reguleren, en ze betrokken zijn in een verscheidenheid van biologische signaalwegen [2]. Meerdere studies hebben significant verschil microRNA expressieprofielen tussen tumorcellen en cellen afkomstig van normale weefsels toonde, wat aangeeft dat microRNAs belangrijke rol in tumorvorming gespeeld [3], [4]. Zo heeft MicroRNAs kort een hotspot van genetische diagnose en behandeling doel als nieuwe oncogenen of suppressor genen [5], [6]. Abnormale expressie van miRNA in weefsels of serum is nauw verwant aan meerdere menselijke maligniteiten zoals maagkanker [7], [8], en verschillende downgereguleerd miRNA bij maagkanker weefsels tumor onderdrukkende functies. Zo werd de Laat-7 microRNA familie eerst gevonden als een repressor van RAS, het onderdrukken van RAS en c-myc expressie op translationeel niveau [9]. Het expressieniveau van let-7a wordt aanzienlijk verminderd in maagtumoren, terwijl Ras eiwit significant hoger in maagtumor [10]. Bovendien hebben miR-15b, miR-16 en miR-21 etc aangesloten op de ontwikkeling en klinische diagnose van maagkanker [11], [12]. Onze fractie is ook melding gemaakt van het antikanker rol van miR-126, miR-409-3p en miR-155 in maagkanker [13] - [15]

MicroRNA microarray werd uitgevoerd om de miRNA profielen in de maag te detecteren. kanker, en we vonden dat miR-338-3p was significant neerwaarts gereguleerd (ongepubliceerde gegevens). miR-338-3p, gelegen op chromosoom 17q25.3 met een lengte van 22 nt, werd voor het eerst in-prion geïnduceerde neurodegeneratie zoals de expressie van miR-338-3p wordt verminderd in de hersenen van muizen geïnfecteerd met muis-aangepaste schaaf [ ,,,0],16]. miR-338-3p kon het mRNA niveau van zijn gastheer gen apoptose-geassocieerde tyrosine kinase (AATK) in de rat neuronen [17] te reguleren. Anderzijds, miR-338-3p was opwaarts gereguleerd bij patiënten met sporadische amyotrofische laterale sclerose (sALS), een ander soort zenuwstelsel laesies [18]. Belangrijk is dat een rol van miR-338-3p in het ontstaan ​​van tumoren is eerder gesuggereerd, als miR-338-3p naar beneden wordt geregeld in rectumkanker [19], en wordt gereguleerd door het hepatitis B virus X eiwit (HBx) om proliferatie en de invasie te remmen van hepatoma cellen door binding aan doelgenen CyclinD1 en smoothened hepatocellulair carcinoom [20] - [22]. Echter, de rol van miR-338-3p in GC is nog onbekend.

In de huidige studie, we verder de down-regulatie expressie van miR-338-3p in GC weefsels in vergelijking met geanalyseerd patiënt afgestemd normaal weefsels, en bepaald dat de expressie van miR-338-3p nauw gecorreleerd met de clinicopathologic variabelen van GC. Ectopische expressie van miR-338-3p remt proliferatie, invasie en metastase van maagkanker cellen, vermindert het tumorigene vermogen van maagkanker cellen in naakt muizen en stimuleert apoptose. We tonen ook aan dat miR-338-3p kan functioneren als een tumor suppressor door direct targeting SSX2IP. Zo, onze resultaten suggereren dat miR-338-3p is een potentiële diagnostische merker en therapeutisch doel van maagkanker.

Materialen en methoden

1. Cellijnen en Cultuur

De menselijke maagkanker cellijnen SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 en AGS werden gekocht van Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academie van Wetenschappen [23] - [26]. KATO III en SNU-1 werd gekocht van de ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 en MKN45 werden verkregen van de Japanse Cancer Research Resources Bank [28], het onsterfelijk maagepitheel cellijn GES -1, was een geschenk van Prof. Feng Bi (Huaxi Hospital, Sichuan University, Chengdu, provincie Sichuan, PR China) [29], [30]. HEK293T, humane embryonale niercellijn, werd bewaard in ons instituut. De maagkanker cellijnen werden gekweekt in RPMI1640 gesupplementeerd met 10% FBS (foetaal runderserum) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. HEK293T-cellen werden gekweekt in DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) aangevuld met dezelfde gekweekte staat hierboven.

2. Ethiek Verklaring

Geschreven informed consent in de studie werd verkregen van alle deelnemers. De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Ruijin Ziekenhuis, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

3. Tissue Monsters

Primary maagkanker weefsels en de bijbehorende niet-tumorweefsels werden verzameld van 66 patiënten die een radicale gastrostomy op de afdeling Chirurgie, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Geen van de patiënten preoperatieve behandeling. Alle weefselmonsters werden verzameld met informed consent van patiënten en bevestigd door het pathologisch onderzoek, en de histologische typen was gebaseerd op de indeling van de Lauren's. De TNM classificatie definities waren volgens de Internationale Unie tegen Kanker (2002).

4. RNA isolatie en qPCR

Totaal RNA werd uit cellijnen en weefselmonsters geïsoleerd door mir
Vana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De kwaliteit en kwantiteit van de RNA-monsters werden door standaard elektroforese en spectrofotometrische methoden. Het expressieniveau van miR-338-3p in cellijnen en weefselmonsters werd gemeten door qPCR en berekend zoals is beschreven [13]. Het expressieniveau van SSX2IP mRNA werd gemeten door qPCR volgens de TaqMan® Gene Expression Assays protocol (Applied Biosystems). De GAPDH mRNA-niveau werd gebruikt voor normalisatie.

5. DNA-isolatie en methylatie analyse

Genomisch DNA van weefselmonsters werd gezuiverd met DNAzol (Invitrogen). Natrium bisulfiet conversie werd uitgevoerd met behulp van de Qiagen Epitect bisulfiet Kit (Qiagen) volgens de fabrikant. De methylering beelden werd uitgevoerd door methylatie specifieke PCR (MSP). De primers voor gemethyleerd of niet-gemethyleerd DNA werden ontworpen door de software Methyl Primer Express v1.0 (ABI) .De methylatie voorwaartse primer voor de CpG van miR-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 'en de reverse primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ', de unmethylation voorwaartse primer voor de CpG van miR-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' en de reverse primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 '

6.. Transient Transfectie van miRNA Mimics

miRNA-338-3p bootst en negatieve controle bootst werden gekocht van GenePharma (Shanghai, China) .Cells werden gezaaid in celcultuur platen 20 uur voor transfectie om ervoor te zorgen 70% cel samenvloeiing bij de moment van transfectie. Transfectie van miRNA nabootst in cellen werd uitgevoerd onder toepassing Lipofectamine2000 (Invitrogen) volgens de procedure van de fabrikant. Het miRNA bootst werkte bij de uiteindelijke concentratie van 100 nM. Op 48 uur na transfectie qPCR en Western blot uitgevoerd.

7. Cell Proliferation Assay

celproliferatie werd vastgesteld door WST (wateroplosbare tetrazolium zout) test met behulp van een cel Counting kit-8 (DOJINDO) volgens de instructies van de fabrikant. Op 24 uur na transfectie met miRNA bootst cellen (2 x 10 ^{3 cellen /putje) werden zaden in 96-well platen. De platen werden gedurende 5 dagen. Het aantal levensvatbare cellen werd bepaald door meting van de absorptie bij 450 nm.}

8. Zachte agar kolonievorming Assay

GC cellen getransfecteerd met miRNA bootst werden opnieuw gesuspendeerd met 0,3% zachte agar in RPMI 1640 bevattende 10% FBS en gelaagd op 0,6% agar gestold in RPMI1640 met 10% FBS in 6-well platen (1 × 10 ^{3 cellen /putje). De platen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2. Kolonies bevattende ten minste 50 cellen geteld.}}

9. Cell Migratie en Invasion Assay

Migratie van cellen werd uitgevoerd met behulp van QCM ^{TM24-Well Colorimetrische Migratie Assay Kit (Millipore) volgens de instructies van de fabrikant. Voor de invasie assay Cell Invasion Assay Kit (Millipore) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Cellen (1 x 10 5) in 300 ul serumvrij medium werden de bovenkamers toegevoegd en gedurende 48 uur. Niet-migrerende of niet-binnendringende cellen werden verwijderd met katoenen wattenstaafjes cellen dat gemigreerd of vielen naar de bodem van het membraan werden gekleurd met de vlek cel verschafte buffer in de testkit en geteld onder de microscoop en gefotografeerd. Drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd voor dezelfde voorwaarden.}

10. Apoptose analyse

Cell apoptose analyse voorgevormd met Annexine V-FITC Apoptose Detectie Kit I (BD) volgens de instructies van de fabrikant. Elke bepaling werd in drievoud uitgevoerd en herhaald driemaal onafhankelijk. De eigenschap van nucleaire krimp geassocieerd met apoptose vertoonden door Hoechst 33342 (Beyotime) volgens de protocol.The morfologie werd gevisualiseerd door een fluorescentiemicroscoop die werd geëxciteerd bij 350 nm golflengte en gemeten bij 460 nm.

11. Constructie van plasmiden en Luciferase activiteit Assay

Het fragment van de wild-type (wt) 3'UTR van SSX2IP of sites mutant (mut) 3'UTR van SSX2IP met de vermeende miR-338-3p bindingsplaatsen werden gesynthetiseerd . De fragmenten werden gekloond in de PMIR-Report luciferase vector (Ambion) die Firefly Kopen en noemde PMIR /SSX2IP-3'UTR ^{wt en PMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells waren zaad in de 24-well platen 24 uur voor transfectie. 500 ng van PMIR /SSX2IP-3'UTR wt of PMIR /SSX2IP-3'UTR mut werden getransfecteerd in elk putje, samen met 20 ng van pRL-TK vector (Promega) met Renilla
luciferase en 60 pmol van de miR-338-3p of de controle imiteert. Cellen werden geoogst na 48 uur transfectie. Firefly Kopen en Renilla
luciferase activiteiten werden gemeten door het gebruik van Dual-luciferase reporter assay (Promega) volgens de instructies van de fabrikant.}

12. Stabiele Transfectie van miR-338-3p Expression Vector

pSilencer-miR-338-3p vector en pSilencer-miR-control vector werd getransfecteerd in SGC-7901-cellen respectievelijk met behulp van Lipofectamine2000 (Invitrogen), en geselecteerd met 100 ug /ml hygromycine B (Invitrogen) gedurende 4 weken. Stabiel getransfecteerde celklonen werden opgepikt en onderhouden helft van de selectie concentratie.

13. Tumor xenograft model

SGC-7901-cellen (2 x 10 ^{6 cellen /muis) stabiel getransfecteerd met pSilencer-miR-338-3p of pSilencer-controlevector werden subcutaan geïnjecteerd in 4 weken oude mannelijke naakt muizen (Institute of Zoology, de Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China) .De muizen werden wekelijks gecontroleerd, werden de tumoren gemeten met een schuifmaat. Muizen werden gedood 4 weken na injectie, en de tumoren werden verwijderd en gewogen. Het tumorvolume werd geëvalueerd volgens de volgende formule:. Volume = (breedte + lengte) /2 x breedte x lengte x 0.5236.Tumor groeicurven berekend}

14. Immunohistochemie

Detectie van SSX2IP werd uitgevoerd op paraffine secties met de anti-antilichaam SSX2IP (Abcam, verdunning 1:1000). Het immuuncomplex werd gevisualiseerd met de Dako REAL ^{TMEnVision ™ Detectiesysteem, Peroxidase /DAB, Rabbit /Mouse (Dako) volgens de procedure van de fabrikant. De kernen werden tegengekleurd met hematoxyline.}

15. Statistische analyse

De relatie tussen de miR-338-3p expressie niveau en clinicopathologic parameters werd geanalyseerd door de Persoon X
^{2-test. De verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd met behulp van de Student t Electronics Test. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) en P
< 0,05 werd significant geacht}

Resultaten

1. . De expressie van miR-338-3p is down-gereguleerd in GC cellijnen en weefsels

Om de rol van miR-338-3p in GC verkennen we eerst vergeleek de expressie van miR-338-3p in acht maagkanker cellijnen met een onsterfelijk normale maagslijmvlies epitheliale cellijn (GES-1). Zoals getoond in Fig. 1A, miR-338-3p was significant down-gereguleerd in GC cellijnen ten opzichte van GES-1. Om dit resultaat te bevestigen, hebben wij ook ten opzichte van de uitingen van miR-338-3p in GC weefsels en naburige niet-tumorweefsels. 66 GC gepaarde monsters werden in dit onderzoek. De resultaten tonen aan dat de gemiddelde expressieniveau van miR-338-3p significant neerwaarts gereguleerd in tumorweefsels in vergelijking met de naburige niet-tumorweefsels (Fig. 1B). Verder opgehelderd we de correlatie tussen miR-338-3p expressie en clinicopathologic factoren. Zoals getoond in Tabel 1 59,1% (39/66) van GC toonden neerwaartse regulatie van miR-338-3p onderstaande tweevoudige cut-off (relatieve expressie verhouding < 0,5), deze situatie werd als significant beneden -gereguleerde. Op basis van deze cut-off, werden de 66 klinische gevallen verdeeld in twee groepen: miR-338-3p lagere expressie groep (n = 39) en miR-338-3p hogere expressie (n = 27). De lagere expressie groep vertoonde grotere neiging tot tumorgrootte meer lymfeknoop metastase, lokale invasie diepere en meer geavanceerde TNM, maar geen significante correlatie met leeftijd, geslacht of weefseltype (tabel 1).

2. miR-338-3p is epigenetisch Silenced bij maagkanker

Omdat epigenetische silencing is een veel voorkomend middel voor het down-regulatie van miRNA meningsuiting [31], [32], hebben we besloten om de CpG eiland distributie in de promotor te analyseren regio van miR-338-3p door Methyl Primer Express v1.0 software. De resultaten toonden aan dat CpG eilanden bestaan ​​in het deel (-690 tot -241) stroomopwaarts van de transcriptie startplaats (TSS). Onderzochten we de methylatie status van de CpG eilanden in de promotor regio van methylatie-specifieke PCR (MSP), voor de regio van -366 tot -576 (Fig. 2A). Via MSP, vonden we dat miR-338-3p CpG eiland uitvoerig werd gemethyleerd in de GC cellijnen vergeleken met het maagslijmvlies epitheliale cellijn (GES-1). Zoals verwacht, behandeling met 5-AZA induceerde significante demethylering (fig. 2B). De representatieve resultaten van MSP analyse van miR-338-3p GC tumorweefsels en afgestemd naburige niet-tumorweefsels worden getoond in Fig. 2C. De methylering tarieven van miR-338-3p CpG eilanden in tumorweefsels en naburige niet-tumorweefsels vanaf 66 GC patiënten waren 78,79% en 24,24%, respectievelijk (** P
. ≪ 0,01, Fig 2D) . Als de Receiver Operating Kenmerken curve en de Area Under Curve (AUC) voor gemethyleerde status van miR-338-3p in GC werden berekend, de AUC was 0,773 ± 0,042, aanzienlijk hoger dan die van de nulhypothese ( P <
0,001), en de 95% betrouwbaarheidsinterval was 0,690-0,856 (fig. 2E). Zo zou de methylatie status van miR-338-3p CpG eiland dienen als een potentiële moleculaire marker voor GC.

3. miR-338-3p Remt MaagKanker Cells Proliferatie

Sinds miR-338-3p significant neerwaarts gereguleerd in GC, zoals hierboven weergegeven, kan functioneren als een tumor suppressor. Daarom hebben we de volgende bepaald of overexpressie van miR-338-3p bij maagkanker cellen kunnen beïnvloeden celgroei. Synthetische miR-338-3p nabootst of negatieve controle bootst getransfecteerd in SGC-7901 cellen waarin het expressieniveau van de miR-338-3p is de laagste, gevolgd door WST bepaling om celgroei te volgen.

De ectopische expressie van miR-338-3p in SGC-7901-cellen werd bevestigd door qPCR en SGC-7901-cellen die met miR-338-3p bootst groeide aanzienlijk langzamer dan de controlegroep (Fig. 3A) (* P
< 0,05, ** P <
0,01). Om het effect van miR-338-3p op celgroei verder te karakteriseren, werd zacht-ager kolonievorming assay uitgevoerd. We vonden dat het aantal kolonies van SGC-7901-cellen die met miR-338-3p bootst was significant minder dan die van de controlegroep (figuur 3B-C.) (** P
< 0,01) . Consequent, remming van miR-338 geïnduceerde de proliferatie van SGC-7901 (Fig S2 in File S1, * P
. ≪ 0,05). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in de controlegroep GES-1-cellen (Fig S1 A-B in File S1, * P
<. 0,05). Kortom, deze resultaten suggereren dat miR-338-3p onderdrukt de groei van zowel GC cellen en de maag epitheelcellen in
vitro.

4. miR-338-3p Remt Migratie en invasie van GC Cells In vitro

Op basis van de gedachte dat miR-338-3p fungeert als een tumor suppressor van GC, we verder onderzocht de effecten ervan op celmigratie en invasie, een kritische bepaald van kwaadaardige progressie en metastase. Zoals getoond in Fig. 4, het aantal migrerende SGC-7901-cellen die met miR-338-3p bootst was significant lager dan de controlegroep (105,00 ± 11,16 145,00 ± 7,00 vs, ** P
<.. 0,01 Fig 4 A-B) en het aantal invasieve SGC-7901-cellen die met miR-338-3p significant minder in vergelijking met de controlegroep (41,33 ± 4,04 versus 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. fig. 4 C-D). Consequent, remming van miR-338-3p geïnduceerde migratie en invasie van SGC-7901-cellen (Fig S3 in File S1, * P
. ≪ 0,05). Daarentegen miR-338-3p had geen invloed op de migratie van GES-1 (Fig. S1 E in File S1), waarschijnlijk omdat GES-1 cellen missen de migratie en de invasieve aard van kankercellen. Deze resultaten toonde een rol van miR-338-3p bij het remmen van zowel migratie en invasie van GC cellen.

5. miR-338-3p kan induceren MaagKanker Cells apoptose

Om het mechanisme van miR-338-3p op GC celgroei remmende effecten toe te lichten, we apoptose analyse getest door flowcytometrie. De resultaten gaven aan dat de apoptotische percentage aanzienlijk miR-338-3p bootst getransfecteerde groep was verhoogd vergeleken met de controle imiteert getransfecteerde groepen (** P
< 0,01) (fig. 5A-B). We onderzochten verder de morfologische kenmerken van apoptose waaronder gecondenseerde chromatine en nucleaire fragmentatie door Hoechst 33342 vlekken, en bevestigde dat de apoptotische tarief werd verhoogd in miR-338-3p bootst getransfecteerde cellen (Fig. 5C). Consequent, remming van miR-338 remde apoptose van SGC-7901-cellen (Fig S4 in File S1, * P
. ≪ 0,05). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in de controlegroep GES-1-cellen (Fig S1 C-D in File S1, ** P
<. 0,01). Deze resultaten gaven aan dat overexpressie van miR-338-3p induceert apoptose in GC-cellen, die kunnen bijdragen tot het groeiremmende eigenschappen van miR-338-3p.

6. miR-338-3p Remt tumorgeniciteit en verhoogt apoptose In vivo

We komende getest of ectopische expressie van miR-338-3p de groei en apoptose van maagtumor In vivo kunnen beïnvloeden .
SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met de miR-338-3p expressie vector (p Silencer
-miR-338-3p) of de controle vector (p Silencer
-miR -controle). De stabiele klonen met beide p Silencer
-miR-338-3p of p Silencer
-miR-controle werden geselecteerd en subcutaan geïnjecteerd in naakt muizen, en de vorming tumor werd gevolgd. SGC-7901-cellen die met miR-control vertoonde progressieve groei, maar werden geremd toen ectopische expressie van miR-338-3p. Na 28 dagen werden de muizen gedood naakt en de tumorgewichten werden gemeten en het volume (fig. 6 A-E). Het gemiddelde gewicht van tumoren als gevolg van pSil encer
-miR-338-3p cellen was significant minder dan tumoren van p Silencer
-miR-controle cellen groep (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, ** P
. < 0,01)

om te onderzoeken of apoptose draagt ​​bij aan deze waargenomen in vivo
tumor groeiremming bij miR-338-3p boven -expressie, TUNEL assay werd uitgevoerd in de tumorweefsels. De resultaten toonden aan dat tumorweefsels uit p Geluiddemper
-miR-338-3p bevatten significant positief kleurende cellen vergeleken met controlegroep (** P
<. 0,01, figuur 6F-G ). Aldus onze resultaten aan dat miR-338-3p maag remt tumorigenese In vivo
, ten minste gedeeltelijk door het induceren van apoptose in situ.

7. miR-338-3p Targets het 3'-UTR van het oncogen SSX2IP

Omdat miRNAs vaak de expressie van target genen, zijn we op zoek vermeende doelwitten miR-338-3p met behulp van online zoekfuncties (bv TargetScan, Microrna.org en PicTar). De genen voorspeld door alle gebruikte programma's werden beschouwd als kandidaat doelwit van miR-338-3p. Van alle hits, SSX2IP onze aandacht veroorzaakt, eerdere studies aangetoond dat SSX2IP is een acute myeloïde leukemie antigen en een potentieel immunotherapie doelwit voor leukemie [33] - [35] en onze eerdere werk is gebleken dat SSX2IP bevordert de invasie en migratie van hepatocellulaire carcinoomcellen en bijdraagt ​​aan de resistentie tegen chemotherapie [36].

Een mogelijke miR-338-3p bindingsplaats werd voorspeld in de 3'UTR van SSX2IP (fig. 7A). Om deze interactie te valideren, zetten we een wild-type of mutant 3'UTR fragment van SSX2IP in de PMIR-REPORT luciferase vector. De resulterende constructen werden gecotransfecteerd met miR-338-3p nabootst of controle bootst in HEK293T-cellen, gevolgd door luciferase reporter assay. De relatieve luciferaseactiviteit van PMIR /SSX2IP-3'UTR ^{wt, maar niet PMIR /SSX2IP-3'UTR mut, werd significant onderdrukt door miR-338-3p (** P
<.. 0,01) in vergelijking met die van de controle imiteert (figuur 7B), wat aangeeft dat miR-338-3p direct bindt aan het 3'UTR van SSX2IP om als een suppressor}

We vervolgens onderzocht de invloed van miR-338-3p op de expressie van SSX2IP, door het meten van het mRNA en eiwitniveaus van SSX2IP na transfectie SGC-7901 cellen met miR-338-3p of controle imiteert. Zoals getoond in Fig. 7C-D, miR-338-3p had geen effect op de SSX2IP
mRNA-niveau, zoals gemeten door qPCR, maar veroorzaakte significante vermindering van de SSX2IP eiwitgehalte in vergelijking met controle-getransfecteerde. Deze resultaten suggereren dat miR-338-3p onderdrukt de expressie van SSX2IP bij de post-transcriptie niveau, waarschijnlijk door binding aan de 3'UTR van SSX2IP. Met name, vonden we ook dat capase-3 en procasepase-3, twee belangrijke apoptose genen werden dienovereenkomstig aangepast (fig. 7C).

8. De expressie van miR-338-3p is omgekeerd gecorreleerd met de expressie van SSX2IP Protein bij maagkanker

miR-338-3p is vastgelegd geregeld bij maagkanker en SSX2IP wordt ondersteund om een ​​doelwit-gen van miR-338 -3p, bevorderde ons om te speculeren dat SSX2IP overexpressie bij maagkanker weefsels en ten opzichte van aangepaste non-tumor weefsel zou kunnen zijn.

Immunohistochemische analyse van SSX2IP antigen bleek de situatie van kleuring voor SSX2IP eiwit in tumor weefsels en gematched non-tumor weefsel in 66 maagkanker samples.65% (43/66) van maagkanker weefsels weergegeven verhoogde immuostaining voor SSX2IP eiwit in vergelijking met matchende niet-tumorweefsels. In het bijzonder, 84% (31/37) van maagkanker weefsels weergegeven verhoogde immunokleuring in GC monsters van de miR-338-3p low-expressie groep, terwijl de gegevens is 41% (12/29) in de miR-338-3p high-expressie groep. De analyse van de expressie van miR-338-3p en SSX2IP bij maagkanker weefsels bevestigde het bestaan ​​van inverse correlatie tussen de expressie van miR-338-3p en de target-gen SSX2IP (Person Chi-kwadraat test: P Restaurant < 0,001, Spearman Correlatie: r = -0,442, P Restaurant < 0,001, Fig 8)

9... Ectopische expressie van SSX2IP Redt de fenotypes veroorzaakt door overmatige productie van miR-338-3p in GC Cells

Als SSX2IP is een hoofddoel onderdrukt door miR-338-3p in GC, ectopische expressie van SSX2IP moet redden van de fenotypes veroorzaakt door miR-338-3p over de productie in GC cellen. Om dit idee te testen, en SSX2IP expressievector of lege vector werd afzonderlijk getransfecteerd in SGC-7901, gevolgd door cytologisch assays voor celproliferatie, migratie, invasie en apoptose te meten. Zoals verwacht, overexpressie van SSX2IP geheel of gedeeltelijk keert het remmende effect van miR-338-3p GC cellen elk aspect we onderzocht (Fig. 9 A-D). Anderzijds, SSX2IP heeft geen invloed op de expressie van miR-338-3p (fig. S5 in File S1). Zo hebben we geconcludeerd dat de kanker suppressor functie van miR-338-3p in GC ten minste ten dele door middel van het onderdrukken van haar target-gen SSX2IP.

Discussie

In deze studie hebben we vastgesteld dat de lage -expressie van miR-338-3p werd klinisch geassocieerd met een grotere grootte van de tumor, meer lymfeklieren metastase, dieper lokale invasie en geavanceerde TNM stadium. Op het cytologisch niveau, up-regulatie van miR-338-3p remde proliferatie, vorming kolonie, invasie en migratie van maagkanker cellen. Bovendien overexpressie miR-338-3p bij maagkanker cellen aanzienlijk verminderd het ontstaan ​​van tumoren in muizen naakt In vivo
. Bij elkaar genomen, onze resultaten suggereren sterk een tumor suppressor rol van miR-338-3p voor maagkanker.

MiRNAs zijn onlangs erkend als cruciaal tumor-geassocieerde regulerende factoren. Hoewel het regelgevend mechanisme van miRNA meningsuiting in het ontstaan ​​van tumoren is nog onduidelijk, is epigenetische regulatie is gesuggereerd dat een belangrijke rol [31], [32] spelen. DNA methylatie komt vooral in de CpG eiland zich gewoonlijk in het promotergebied van het gen, ongeveer 70% van de promotergebieden in menselijk genoom is rijk aan CpG eiland [37]. De verminderde uitingen van miR-34b, miR-129 en miR-10b zijn allemaal veroorzaakt door Hypermethylering in promoters [38], [39]. Consistent met deze gedachte is het niveau van methylatie CpG eiland miR-338-3p bij maagkanker weefsels inderdaad hoger hebben dan die van de afgedekte naburige niet-tumorweefsels, wat suggereert dat miR-338-3p epigenetisch zwijgen in GC. De oorzaak van deze epigenetische stilte van miR-338-3p bij maagkanker blijft ongrijpbaar, en we speculeren dat factoren zoals CagA, die eerder is gemeld aan epigenetisch invloed op de expressie van microRNAs in maagkanker [40], kunnen deelnemen aan deze regeling . Belangrijk is dat de hyper-methylatie status van miR-338-3p promotor is een potentiële biomarker voor maagkanker diagnose.

Sinds miRNAs functie door middel van het reguleren van de expressie van hun downstream genen, de belangrijkste vraag met betrekking tot hoe miR-338- 3p draagt ​​bij aan GC is welk gen (s) het reguleert.

Hier zijn we geïdentificeerd SSX2IP als een belangrijk nieuw target van miR-338-3p, en op voorwaarde dat zowel cytologisch en histologisch bewijs suggereert dat de tumor-bevorderende rol van SSX2IP GC. Vele studies aangegeven dat SSX2IP een acute myeloïde-leukemie-antigen en een potentieel doelwit voor immunotherapie leukemie [33] - [35]. Belangrijker SSX2IP werd getoond in onze eerdere studies naar de beweeglijkheid, invasie en migratie en chemotherapie weerstand van hepatoma cellen te bevorderen, wat aangeeft zijn belangrijke rol bij de ontwikkeling en metastase. De homologe gen in knaagdieren is ADIP
(afadin DIL-domein interagerende proteïne), de aminozuursequentie van ADIP eiwit in muizen en ratten toonden 88% en 87% identiteit met SSX2IP eiwit. ADIP gelokaliseerd in cel-cel-contactplaatsen, en kan celbeweging bevorderen door het activeren Rac1 tot Vav2 [41], [42]. Er wordt gespeculeerd dat SSX2IP cel beweeglijkheid, invasie en metastase kunnen bevorderen door het activeren Rac1.

Interessant is dat de expressie van Rac1 bij maagkanker weefsels hoger dan in de overeenkomende naburige niet-tumorweefsels, het expressieniveau nam significant geassocieerd met TNM stadium. In 7 maagkanker cellijnen, uitingen van Rac1 hoger dan in maagslijmvlies epitheliale cellijn (GES-1) [43], die samenviel met het fenomeen we met miR-338-3p bij maagkanker cellen en weefsels. Deze resultaten suggereren dat miR-338-3p, als remmende factor maagkanker, kan de expressie van doelgen SSX2IP om Rac1 activering onderdrukken verminderen. De betrokkenheid van SSX2IP in meerdere vormen van kanker versterkt de biologische en fysiologische betekenis van de miR-338-3p /SSX2IP cascade in de ontwikkeling van kanker, en heeft ons gevraagd om de status van miR-338-3p /SSX2IP verder te onderzoeken in andere vormen van kanker. Het identificeren van andere potentiële doelwitten van miR-338-3p is ook een work in progress.

Kortom, deze studie voor het eerst beschreven miR-338-3p als een tumor suppressor, die vaak wordt het zwijgen opgelegd door middel van epigenetische hypermethylering bij de promotor regio maagkanker. Functioneel, miR-338-3p remt de metastatische eigenschappen van GC cellen zoals proliferatie, migratie en invasie in vitro
en vermindert de tumorigeniciteit van GC cellen door apoptose In vivo
. Bovendien identificeerden we SSX2IP als een cruciale doelgen van miR-338-3p in GC ontwikkeling.

• PLoS ONE: Postoperatieve chemoradiotherapie versus Postoperatieve chemotherapie voor een compleet verwijderd maagkanker met D2 Lymfadenectomie: een meta-analyse
• PLoS ONE: De miR-184 Binding-Site rs8126 T > C polymorfisme in TNFAIP2 wordt geassocieerd met risico op maagkanker