PLOS ONE: La visualización no invasiva de microARN-16 en la quimiorresistencia del cáncer gástrico El uso de un doble gen reportero de imágenes System

Extracto

Los microARN (miARN) se han implicado a desempeñar un papel central en el desarrollo de resistencia a los medicamentos en una variedad de tumores malignos. Sin embargo, muchos estudios se realizaron en el in vitro
nivel y no podían proporcionar la in vivo
información sobre las funciones de miRNAs en la resistencia a los medicamentos contra el cáncer. Aquí, hemos introducido un sistema de doble gen reportero de imagen no invasiva para el seguimiento de la cinética de expresión de los genes miARN-16 durante la quimio-resistencia en el cáncer gástrico tanto in vitro
y in vivo
. cotransportador humano yoduro de sodio (hNIS) y los genes de luciferasa de luciérnaga (Fluc) se unen para formar gen indicador de fusión hNIS /Fluc doble y luego generar la línea celular de cáncer gástrico humano NF-3xmir16 y su línea celular de resistencia a múltiples fármacos NF-3xmir16 /VCR. la captación de yodo radioactivo y las señales de luminiscencia Fluc in vitro
una buena correlación con el número de células viables. La captación de yodo radioactivo y actividades de luciferasa en células NF-3xmir16 fueron notablemente reprimida por exógeno o endógeno miARN-16. El NF-3xmir16 /células VCR mostró un aumento significativo de ^{131I absorción y luminiscencia intensidad en comparación con las células NF-3xmir16. La radiactividad de in vivo
99mTc-pertecnetato de imagen y la intensidad de imágenes de bioluminiscencia también se incrementaron en NF-3xmir16 /VCR comparación con la de xenoinjertos de tumores de NF-3xmir16. Por otra parte, el uso de este sistema de gen indicador, se encontró que el etopósido (VP-16) y 5-fluorouracilo (5-FU) activamos miARN-16 expresión in vitro
y in vivo
, y la regulación al alza de los genes miARN-16 es p38MAPK dependiente de NF-kB, pero independiente. Este gen reportero de imagen dual puede servir como una herramienta novedosa para in vivo
imágenes de microRNAs en la quimio-resistencia de los cánceres, así como para la detección precoz y el diagnóstico en la clínica}

Visto:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) La visualización no invasiva de microARN-16 en la quimiorresistencia del cáncer gástrico El uso de un sistema de imágenes Gen Reportero Dual. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |

Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: March 13, 2013; Publicado: 17 Abril 2013

Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa del Programa Nacional de Investigación básica y Desarrollo de China (973) con la subvención No. 2012CB518101, 2011CB707702, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China bajo la subvención Nos. 81090272, 81090274, 81227901, equipo de innovación Desarrollo de subvención por el Departamento de China de Educación (2010CXTD01), Programa 863 de China (2012AA02A603) y el Programa Nacional de Apoyo a Key Technology con la subvención No. 2012BAI23B06. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Co-autor Xiaoyuan Chen sirve como editor de esta revista. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

El cáncer gástrico sigue siendo la primera causa de muerte por cáncer en China y el cuarto más común malignidad en todo el mundo a pesar de una disminución dramática en su mortalidad y la morbilidad en los últimos tres décadas [1]. La quimioterapia ha sido ampliamente utilizado para tratar tanto el cáncer gástrico resecable y avanzada, lo que conduce a mejoras en la supervivencia global, así como la calidad de vida de los pacientes [2], [3]. Sin embargo, la quimioterapia a largo plazo a menudo falla para eliminar todas las células tumorales debido a la intrínseca o adquirida resistencia a múltiples fármacos (MDR), que es la causa más principal de la recurrencia del tumor [4]. En la actualidad, la MDR se ha considerado como un fenómeno multifactorial que implica varios mecanismos principales, incluyendo el aumento del metabolismo de fármacos, la disminución de la absorción de fármacos solubles en agua, blancos de la droga alteradas, disminución de la concentración intracelular de los fármacos por las bombas de eflujo, alterado puntos de control del ciclo celular y inducida emergencia genes de respuesta a deterioran las vías de apoptosis, etc
[5]. Aunque los mecanismos de MDR se han explorado ampliamente, los principales determinantes de este fenómeno permanecen en gran medida poco clara.

Los microARN (miRNA) son una nueva clase de pequeños ARN no codificantes endógenos (19-23 nucleótidos) que regulan negativamente la expresión de los genes en el nivel post-transcripcional de base de sincronización perfecta o imperfecta con la región 3 'no traducida (UTR) del ARNm diana y con ello inducir la degradación de mRNAs o traducción represión [6]. En la actualidad, los estudios emergentes han sugerido la existencia y la importancia de miRNAs en la evolución de la resistencia a los medicamentos contra el cáncer y miRNAs perfiles de expresión puede estar correlacionado con el desarrollo de resistencia a los medicamentos [7] - [10], lo que indica que la forma de resistencia a los medicamentos miARN mediada agrega otro mecanismo de MDR. En nuestro estudio anterior, se informó de que dos miRNAs, miARN-15b y miRNA-16, fueron expresados ​​diferencialmente en una línea celular de cáncer gástrico humano resistente a múltiples fármacos SGC7901 /VCR y su línea celular de sus padres SGC7901 [11]. Sin embargo, se llevó a cabo sólo en el in vitro
nivel y no podía reflejar los en la información
vivo en las funciones de miRNAs en la resistencia a los medicamentos contra el cáncer.

Los recientes avances en las técnicas de imagen molecular permite la visualización no invasiva de los procesos celulares normales y anormales en sujetos vivos a nivel molecular en lugar de en el nivel anatómico [12]. Varias estrategias no invasivas, tales como el uso de una proteína fluorescente, gen indicador de luciferasa, aptámero nucleolina o nanopartículas conjugado baliza molecular fluorescente, se han desarrollado para controlar los patrones de expresión de diversas miRNAs durante la carcinogénesis, la neurogénesis o la miogénesis in vitro
y in vivo
[13] - [16]. El presente estudio fue la introducción de un método no invasivo para el seguimiento de los genes miARN-16 en la quimio-resistencia del cáncer gástrico a través de un sistema de gen indicador dual de formación de imágenes en el que el yoduro de sodio humana cotransportador (hNIS) y luciferasa de luciérnaga (Fluc) los genes estaban relacionados con un gen de fusión de bioluminiscencia de imágenes y ^{imagen de la cámara gamma 99mTc-pertecnetato in vivo
.}

Materiales y Métodos

Animales

libres de patógenos específicos de 8 semanas -old mujeres ratones BALB /c desnudos se obtuvieron del centro de animales de Shanghai en china y se han criado en el centro de animales de la Universidad médica Militar Cuarto, china. Todas las ratas fueron alojados bajo condiciones libres de patógenos específicos. Los protocolos de los animales utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética Cuarta Universidad Médica Militar. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Cuarta Universidad Médica Militar Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio formuladas por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica.

Reactivos y anticuerpos

Anticuerpo monoclonal de ratón contra hNIS (ab17795) se adquirió de Abcam. anticuerpo policlonal de conejo específico para Bcl-2 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (inhibidor de NF-kappa B) y SB203580 (p38 inhibidor de MAPK) se obtuvieron de Beyotime Instituto de Biotecnología (Shanghai, China). Los medicamentos contra el cáncer, incluyendo vincristina (VCR), etopósido (VP-16), mitomicina C (MMC), cisplatino (CDDP), 5-fluorouracilo (5-FU) y adriamicina (ADR) se adquirieron de Wolsen Biotecnología (Xi'an, China). El plásmido lentivirus GV260-Fluc-puro se obtuvo de Shanghai GeneChem Company (Shanghai, China). Todos los medios de cultivo de células y el suero fueron adquiridos de Gibco (Grand Island, NY).

Dual plásmido de gen informador construir

La secuencia codificante del gen hNIS se amplificó por PCR a partir de un plásmido proporcionado amablemente por el el Dr. Yang Weidong (Cuarta Universidad médica Militar, china) usando los siguientes cebadores:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-3-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC '

Para la construcción de un vector de expresión dual, el ADNc del gen hNIS se insertó en el BamH I y
Edad sitios de enzimas de restricción
I de un vector lentiviral GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, china) que codifica un gen Fluc bajo el control del promotor de ubiquitina. El constructo de expresión dual-GV260 hNIS /Fluc resultante se utilizó además para generar GV260-hNIS plásmido /Fluc-3xmir16. Tres copias de secuencias complementarias contra miARN-16 (3xmir16) se insertaron después del codón de terminación del gen de fusión hNIS /Fluc para generar GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (Figura 1A). Una secuencia de nucleótidos codificada de longitud similar a 3xmir16 también se insertó en el 3'UTR del gen de fusión hNIS /Fluc para obtener una construcción de control (GV260-hNIS /Fluc-scramble. Se obtuvo la secuencia 3xmir16 secuencia o scramble recociendo los siguientes oligonucleótidos :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

cultivo de células de cáncer gástrico y la generación de la línea celular estable

línea celular de cáncer gástrico humano SGC7901 y su multirresistente variante SGC7901 /VCR (establecido y mantenido en nuestro laboratorio como se describe anteriormente [11]) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 unidades de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen ). Para mantener el fenotipo MDR, vincristina (con concentración final de 1 mg /ml) se añadió al medio de cultivo para las células SGC7901 /VCR. Para generar la línea celular estable, lentivirus vector GV260-hNIS /o Fluc GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 se cotransfectaron primera en células 293T con plásmidos de envases ( gag, pol, VSV-G
). El medio de crecimiento se cambió a las 6 horas después de la transfección y el sobrenadante que contiene lentivirus se recogió a las 48 h después de la transfección. sobrenadantes recogidas se centrifugaron a 4000 g durante 10 min para sedimentar los residuos celulares. virus concentrado se tituló en células 293T. SGC7901 células y células SGC7901 /VCR se transdujeron con GV260-hNIS /Fluc y virus GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 respectivamente a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. A continuación, las células se seleccionaron con puromicina durante 3 semanas y las colonias de células eran recogido a ampliado para próximos experimentos paso

oligonucleótidos de ARN y transfección

El control de los genes miARN-16 y negativo (NC) oligonucleótidos de ARN se sintetizan (Shanghai GenePharma, china) mediante el uso de las siguientes secuencias.:

miARN-16 sentido: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miARN-16 anti-sentido: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

sentido de Carolina del Norte: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

Carolina del Norte anti-sentido: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Antes de la transfección, SGCC7901 células se sembraron a 1 × 10 ^{5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y crecer durante 24 h. La transfección se realizó con el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todo transfección se llevaron a cabo por triplicado.}

Quantitative PCR en tiempo real (qRT-PCR) análisis

ARN total fue aislado de las células cultivadas utilizando Trizol (Invitrogen). RT se realizó con PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japón) y qPCR se realizó con Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) y ABI sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo del fabricante . Los productos de PCR se analizaron en 3% geles de agarosa. La cantidad relativa de los genes miARN-16 se normalizó a U6 snRNA. Y la cantidad relativa de Fluc se normalizó a gen GAPDH. El factor de cambio para el gen miRNA-16 o Fluc del grupo experimental respecto al grupo de control se calculó utilizando el método 2 ^{-ΔΔCt, donde ΔΔCt = Ct experimento - Control y Ct Ct = Ct miARN - Ct = Ct o U6 Ct Fluc - Ct GAPDH. PCR se realizó por triplicado. Los cebadores utilizados para tallo-bucle RT-PCR para el miR-16 son las siguientes:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-3-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT '

miR-16 RT-5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 '

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

miR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

análisis de transferencia Western

SGC7901 células se lavaron tres veces con PBS y después se lisaron en tampón de lisis frío (NaCl 20 mM, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1% de Triton X-100 y 1% de aprotinina) durante 30 min en hielo. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante y cantidades idénticas de proteína se resolvieron por 8% SDS-PAGE y después se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en solución que contiene 5% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente de bloqueo, y luego a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando un kit de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ).

MTT ensayo

Para determinar las tasas de crecimiento de NF-vacío, NF-3xmir16 y NF-3xmir16 células /VCR, estos tres tipos de células se inocularon en placas de 96 pocillos con los mismos números (5.000 células) por pocillo. En diferentes puntos de tiempo (24, 48, 72, 96 h), 25 l de 5,0 mg /ml filtrado 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 estéril, 5- difenil tetrazolio bromuro (MTT; Sigma) se añadió a cada pocillo. El colorante sin reaccionar se retiró después de 4 h de incubación, y los cristales de formazán insolubles se disolvieron en 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). La absorbancia a 570 nm (longitud de onda de referencia, 630 nm) se midió con un lector de microplacas multimodo Sinergia II (BioTech Instruments, VT).

captación de yoduro radiactivo ensayo

Para identificar la relación entre el yoduro la captación y el número de células, una serie de dilución de las células se inocularon en placas de 24 pocillos. Después de 12 h de incubación, se examinó el nivel de captación ^{131I. La captación de yoduro se determinó incubando las células con solución salina equilibrada de 500 l de Hanks (HBSS) que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino con 37 kBq de Na sin portador 131I y NaI 10 mM durante 30 min. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces tan rápidamente como sea posible con 1 ml de tampón HBSS enfriado con hielo. Las células se separaron con tripsina 200 l, y se midió la radiactividad usando un contador γ-(Perkin-Elmer). Para evaluar la expresión funcional de hNIS en el sistema de gen indicador, células NF-3xmir16 se sembraron en a 1 x 10 5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, a continuación, se transfectaron oligos miARN-16 y NC . 24 h más tarde, la captación de yoduro se midieron como se describe anteriormente.}

In vitro
imágenes de bioluminiscencia ensayo

Para identificar la relación entre las señales de luminiscencia y el número de células, una serie de dilución de las células se inocularon en placas de 24 pocillos. Después de 12 h de incubación, cada pocillo se lavó con solución salina beffered con fosfato (PBS). A continuación, se añadió D-luciferina (Xenogen) a una concentración de 0,5 mmol /L inmediatamente antes del ensayo. La bioluminiscencia se midió con un sistema de imágenes IVIS 100 (Xenogen) y analizados mediante el software versión 2.50 de estar Imagen (Xenogen). Para evaluar la expresión funcional de Fluc en el sistema de gen indicador, células NF-3xmir16 se sembraron en a 1 x 10 ^{5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, a continuación, se transfectaron oligos miARN-16 y NC . 24 h más tarde, el ensayo de bioluminiscencia se midió como se describe anteriormente.}

bioluminiscente y imágenes 99mTc-pertecnetato en ratones desnudos

números iguales (5 × 10 ^{6 células) de NF-vacío y NF-3xmir16, o NF-3xmir16 /VCR y las células NF-3xmir16, eran xenoinjertado vía subcutánea en el flanco trasero izquierda y derecha de cada ratón desnudo, como se indica en los resultados. bioluminiscente de imágenes fue adquirida un día después de la inyección de células. Todos los ratones fueron anestesiados con isoflurano gas 2,5% en oxígeno a un caudal de 1,5 L /min. Una solución acuosa de D-luciferina (150 mg /kg de peso corporal) se inyectó por vía percutánea 10 min antes de formación de imágenes. Las imágenes de todo el cuerpo para señales Fluc fueron adquiridos durante 2 min y Living software de imagen (Xenogen) se ejecutan para obtener imágenes bioluminiscentes. Un retorno de la inversión fue seleccionada manualmente sobre la intensidad de la señal. señales de bioluminiscencia se expresan en forma de fotones por segundo por centímetro cúbico por estereorradián (p /seg /cm 2 /sr) dentro de un retorno de la inversión.}

En medicina nuclear, el tumor de ratones portadores se inyecta por vía intraperitoneal con 18,5 MBq de ^{99m Tc-pertecnetato a 2 semanas después de la inyección de células. 30 min después de la inyección, el animal se colocó en una posición desplegada en posición supina sobre la cama del escáner SPECT (Symbia T2, Siemens). La anestesia se realizó con 1% -2% de isoflurano en el 100% de O _{2 durante la inyección y de imagen. Todas las imágenes fueron reconstruidas con subconjuntos ordenados de 2 dimensiones algoritmo de máxima expectación. La actividad se cuantificó mediante la visualización de las regiones de interés (ROI) en los tumores y el área de la ROI se mantuvo constante para todas las imágenes nucleares y ópticas. Después bioluminiscente y 99mTc-pertecnetato de imágenes , se recogieron los tumores y se pesaron.}}

El análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Los datos que muestran las comparaciones entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. Las comparaciones entre más de dos grupos se evaluaron mediante análisis de la varianza (ANOVA) con la prueba post hoc apropiado. los valores <P;. 0,05 se consideraron estadísticamente significativos

Resultados

Establecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico expresan de forma estable hNIS y genes Fluc

Para generar un gen reportero de fusión (GV260- hNIS /Fluc, se refiere NF-vacío), el ADNc hNIS se clonó en un vector de lentivirus (GV260-Fluc-puro) que codifica un gen Fluc para generar una proteína de fusión, que estaba bajo el control del promotor de ubiquitina. A continuación, se insertaron tres copias de secuencias complementarias contra miRNA-16 (3xmir16) después del codón de parada del gen de fusión hNIS /Fluc para generar otra construcción (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, se hace referencia a NF-3xmir16) (Figura 1A). Una secuencia de nucleótidos codificada de longitud similar a 3xmir16 también se insertó en el 3'UTR del gen de fusión hNIS /Fluc para obtener una construcción de control (GV260-hNIS /Fluc-scramble, se refirió a NF-scramble). In vitro
imágenes de bioluminiscencia mostraron que la actividad de genes a partir de células Fluc NF-vacíos fue similar a la de las células NF-scramble (Figura S1A). Así que elegimos el constructo NF-vacía en un estudio adicional. Dos líneas celulares, un ser humano gástrico línea celular de cáncer SGC7901 /VCR MDR y su línea celular de sus padres SGC7901, fueron transducidas con lentivirus que contiene el NF-vacío o gen NF-3xmir16, respectivamente, para establecer tres líneas celulares estables NF-vacío /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 y NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (denominado NF-vacío, NF-3xmir16 y NF-3xmir16 /VCR). En primer lugar se realizó un ensayo de MTT para medir las tasas de crecimiento de estas tres líneas celulares (Figura S1B). Luego perfomed ensayo qPCR para investigar las copias integradas de construcciones indicadoras en las tres líneas celulares (Figura S1c). In vitro
bioluminiscencia de imágenes (Figura 1B) y transferencia Western (Figura 1C) se realizaron para demostrar aún más la expresión exitosa de genes Fluc y HNIs en estas tres líneas celulares.

correlación Linealidad de Fluc y las actividades de transgenes HNIs con el número de células in vitro

Para evaluar las actividades de transgenes Fluc y HNIs en las células, se realizó in vitro
imágenes de bioluminiscencia y ^{131I en radio yoduro ensayos de absorción en una serie de diluciones de las líneas celulares de NF-3xmir16. Como se muestra en la Figura 1D, de acuerdo con los aumentos en el número de células, la acumulación de luminiscencia también aumentó. Se encontraron señales de bioluminiscencia que se correlaciona bien con el número de células (γ 2 = 0,9990) (Figura 1E). Mientras tanto, captación de 131I también se incrementó con el número de células (Figura 1F). La captación de yodo radioactivo se observó una buena correlación (γ 2 = 0,9543) con el número de células (Figura 1G). Debido a que el Fluc se fusionó con hNIS, una correlación entre la intensidad así bioluminiscencia y radioactividad 131I se observó en células de acuerdo con el análisis de regresión lineal (γ 2 = 0,9339) (Figura 1H).}

la validación de los genes miARN-16 actividades a través de Francia el sistema de gen indicador

con el fin de probar si vector indicador de NF-3xmir16 que contiene los genes miARN-16 secuencias diana fue reprimida por los genes miARN-16 exógena, se analizó la actividad Fluc y hNIS después de la introducción de los genes miARN-16. En comparación con las células transfectadas con oligos NC, la señal de bioluminiscencia se redujo en 35% en las células transfectadas con los genes miARN-16 (Figura 2A y 2B). Y la absorción de radio yoduro ^{131I en los genes miARN-16 células transfectadas fue de aproximadamente 70% de la de las células transfectadas NC cuantificó contando radiactivo (Figura 2C). Y la actividad Fluc y hNIS se redujeron de una manera dependiente de la dosis (Figura S1D-F). Estos datos indicaron que el reportero construir NF-3xmir16 podría ser modulada por los genes miARN-16.}

Detección de la expresión endógena de los genes miARN-16 in vitro
y in vivo

Para detectar los genes miARN-16 nivel de expresión endógena en células de cáncer gástrico in vitro
, igual número (1 × 10 ^{6) de las células NF-vacío y NF-3xmir16 fueron sembradas y luego se examinó la actividad Fluc y hNIS. Como se muestra en la Figura 2D y 2E, la actividad Fluc resultante de células NF-3xmir16 se redujo en aproximadamente 50% en endógena miRNA-16 en comparación con la de las células NF-vacíos. Y la actividad de las células hNIS NF-3xmir16 también se redujo en aproximadamente un 40% en respuesta a los genes miARN-16 endógena en contraste con la de células NF-vacíos (Figura 2F). La falta de represión de las actividades Fluc o HNIs observados en las células NF-vacío es con respecto a que no había sitios miARN-16 en construcción NF-vacía.}

El sistema de gen indicador de imagen dual habilitado In vivo
la visualización de la expresión de los genes miARN-16 endógena en células de cáncer gástrico. Números iguales (1 × 10 ^{7) de flancos traseras NF-vacíos y NF-3xmir16 células se xenoinjertado por vía subcutánea en la izquierda y derecha de cada ratón desnudo (n = 6) y luego bioluminiscente de imágenes y 99mTc-pertecnetato imagen de la cámara gamma fueron adquiridos. Como se muestra en la Figura 2G, la intensidad de luminiscencia a partir de células NF-3xmir16 implantados fueron aproximadamente 55% más bajo que el de las células NF-vacío, de manera similar para la diferencia de las actividades de luciferasa medida in vitro
(Figura 2D y 2E). Después de la inyección intraperitoneal de 99m Tc-pertecnetato al 18,5 MBq, se llevó a cabo imagen de la cámara gamma. En contraste con los tumores de la NF-vacío, que mostró captación prominente de 99m Tc-pertecnetato, NF-3xmir16 tumores mostró absorción insignificante (Figura 2H), lo que indica endógena miARN-16 redujo la expresión hNIS. absorción fisiológica también se observó en los sitios de la tiroides, estómago y vejiga, en el que hNIS se expresa normalmente. Las regiones de interés (ROI) análisis mostraron que la actividad hNIS disminuyó significativamente en xenoinjertos de NF-3xmir16 comparación con la de NF-vacíos xenoinjertos (Figura 2H). Después de la impresión, se recogieron y se pesaron los NF-vacíos y NF-3xmir16 tumores (Figura S1G). Los resultados mostraron que tenían los mismos pesos, indicaron que las diferencias en la intensidad de la señal son, en efecto, debido a la función endógena miARN-16, pero no teléfonos números.}

Visualización de los cambios de expresión de los genes miARN-16 en células de cáncer gástrico MDR in vitro
y in vivo

se detectó el cambio de expresión de los genes miARN-16 en células de cáncer gástrico resistentes a los medicamentos a través de la actividad
Fluc y por hNIS imágenes de bioluminiscencia y ^{131I ensayos de captación de yodo radioactivo. Tanto la actividad Fluc (Figura 3A y 3B) y la actividad hNIS (Figura 3C) aumentó alrededor de 1,5 veces en las células NF-3xmir16 /VCR en comparación con la de NF-3xmir16 células, que sugiere que los genes miARN-16 se downregulated en NF-3xmir16 /células VCR. Para verificar los resultados obtenidos por el sistema de gen indicador, RT-PCR cuantitativa (Q-PCR) se llevó a cabo el análisis de la expresión diferencial de los genes miARN-16 en estas dos líneas celulares. De acuerdo con los datos del sistema de gen indicador, Q-PCR mostró una disminución miARN-16 niveles de NF-3xmir16 /VCR en comparación con su contraparte células NF-3xmir16 (Figura 3D).}

Para el seguimiento cuantitativo no invasivo de miRNA- la expresión diferencial de 16 MDR células de cáncer gástrico en in vivo
, bioluminiscente de imágenes y ^{se realizaron imágenes de cámara gamma-pertecnetato 99mTc. El bioluminiscente de imágenes demostró que las señales de luminiscencia fueron aproximadamente 1,7 veces los aumentos en los xenoinjertos de NF-3xmir16 /VCR frente a NF-3xmir16 xenoinjertos (Figura 3E), de acuerdo con los aumentos de la actividad de luciferasa medidos in vitro
(Figura 3A y 3B). La inyección de 99m Tc-pertecnetato y la adquisición de imágenes de cámara gamma indicaron que se observó una acumulación significativamente mayor de 99m Tc-pertecnetato en xenoinjertos de NF-3xmir16 /VCR que la de NF-3xmir16 xenoinjertos. Physiological acumulaciones 99mTc-pertecnetato se observaron también en la glándula tiroides, la vejiga y el estómago (Figura 3F). Y el NF-3xmir16 y NF-3xmir16 /VCR tumores tenían los mismos pesos (Figura S1H).}

VP-16 y 5-FU regulación positiva de la expresión de los genes miARN-16 de forma no invasiva fotografiada por el sistema de doble gen reportero

para determinar si otros medicamentos contra el cáncer podrían alterar el perfil miARN-16 expresión, se añadieron cinco fármacos clínicos para el cáncer gástrico a las células NF-3xmir16 seguido de in vitro
bioluminiscencia de imágenes y 131I ensayos. Los resultados revelaron que la intensidad de luminiscencia (Figura 4A y 4B) o la captación de yoduro celular (Figura 4E) se redujeron en gran medida la exposición a VP-16, 5-FU y CDDP, pero no a MMC y tratamiento ADR en comparación con las células no tratadas.

las razones de la disminución de la señal observada en VP-16, 5-FU y el tratamiento CDDP podría ser que las drogas activadas endógeno miARN-16 expresión o inhibe el crecimiento celular incluso causaron la muerte celular. Para excluir esta última posibilidad, se añadieron los cinco fármacos a las células NF-vacío, que no contienen sitios de destino miARN-16 en el constructo. La in vitro
bioluminiscencia resultados de las imágenes en demostrado que VP-16 y 5-FU no tuvo ningún efecto inhibidor sobre la intensidad de la luminiscencia, mientras que todavía CDDP reduce la señal de luminiscencia (Figura 4C y 4D), indicando que CDDP puede inhibir celular crecimiento, pero no activar endógeno expresión de los genes miARN-16. Por otro lado, MMC y ADR fueron encontrados para aumentar ligeramente la intensidad de luminiscencia tanto en células NF-3xmir16 y NF-vacíos (Figura 4A-D), que puede resultar de la promoción de la proliferación celular.

Para verificar que la activación de los genes miARN-16 participó en efectos anticancerígenos de VP-16 y 5-FU, Q-PCR se llevaron a cabo para determinar el nivel de los genes miARN-16 en NF-3xmir16 la exposición a las células contra el cáncer tratamientos de drogas. En consecuencia, los genes miARN-16 expresión fue significativamente upregulated después de los tratamientos VP-16 o 5-FU en SGC7901 células en comparación con las células control no tratadas, mientras que MMC, ADR y CDDP tuvieron efecto menor en los genes miARN-16 expresión (Figura 4F).

el aumento de miARN-16 expresiones de VP-16 y 5-FU están involucrados en la p38 MAPK, pero NF-kB vía de señalización

al igual que en la modulación de los genes de ARN que codifican proteínas, transcripción de los genes miARN parece ser regulada por múltiples vías de señalización. La activación de las vías de señalización NF-kB o MAPK es una respuesta común después de los fármacos quimioterapéuticos [17], [18]. Por lo tanto, la hipótesis de que la regulación al alza de los genes miARN-16 podría ser una consecuencia del aumento de la activación de NF-kB o MAPK después de VP-16 o el tratamiento con 5-FU. Para dilucidar el papel de estas vías de señalización en la VP-16 y la transactivación inducida por 5-FU de miARN-16, primero mide la intensidad de la luminiscencia en las células NF-3xmir16 en respuesta a VP-16 y 5-FU en la presencia o ausencia de inhibidores farmacológicos a NF-kB o p38 MAPK. El tratamiento de las células con un inhibidor de NF-kappa B específica, Bay 11-7082, no tuvo efecto sobre la señal de luminiscencia en comparación con las células tratadas con fármaco sin inhibidores (Figura S2).

En contraste, el tratamiento con un p38 específica inhibidor de MAPK, SB203850, notablemente rescató a la disminución de la bioluminiscencia (Figura 5A y 5B) o captación de yoduro (Figura 5C) por VP-16 y 5-FU en comparación con las células de control tratadas. Para confirmar el nivel de expresión de los genes miARN-16 en presencia de SB203850, PCR en tiempo real se llevó a cabo y los resultados mostraron que inhibidor de MAPK p38 suprimida drásticamente VP-16 y 5 inducida-FU miRNA-16 upregulation (Figura 5D), indicando que el aumento de la expresión de los genes miARN-16 por VP-16 y 5-FU está involucrado en la p38 MAPK vía de señalización
.

Nuestro estudio anterior ha demostrado que la proteína Bcl-2 es un gen diana directa de los genes miARN-16 en el desarrollo de la MDR en SGC7901 células de cáncer gástrico [11]. Para probar si Bcl-2 está implicada en la VP-16 y 5-FU estimulación de los genes miARN-16 a través de la vía de p38 MAPK
, determinamos Bcl-2 nivel de proteína por Western blot. Como se muestra en la figura 5E y 5F, VP-16 y 5-FU disminuyó significativamente el nivel de la proteína Bcl-2 en aproximadamente un 50% en comparación con las células de control sin tratar en ausencia de SB203850. Tras el tratamiento, junto con SB203850, la disminución de la proteína Bcl-2 se atenuó de manera drástica, lo que sugiere la importancia de la activación de p38 MAPK en la regulación negativa inducida por 5-FU VP-16 y de la proteína Bcl-2.

en el seguimiento in vivo Red de una mayor expresión de los genes miARN-16 por VP-16 y 5-FU

Para la monitorización no invasiva de una mayor expresión de los genes miARN-16 inducida por VP-16 y 5-FU, NF-vacío y NF -3xmir16 células se injertan en la extremidad posterior izquierda y derecha de cada ratón (n = 6), respectivamente. Para evitar la señal de bioluminiscencia de NF-vacío interferir con la de NF-3xmir16 en el curso de tratamiento de drogas, diferentes números de NF-vacío (1 × 10 ^{5 células) y NF-3xmir16 (1 × 10 se injertaron 7 células). Como se muestra en la Figura 6, se observó la intensidad de la bioluminiscencia reducido significativamente en NF-3xmir16 xenoinjertos después de VP-16 o el tratamiento 5-FU en comparación con el no tratamiento. En particular, en ratones tratados con VP-16, la señal de bioluminiscencia redujo en alrededor de 40% en el NF-3xmir16 xenoinjertos mientras que aumentó ligeramente en xenoinjertos de NF-vacíos frente a imágenes pretratados (Figura 6A y 6B), de manera similar para la diferencia de intensidad de luminiscencia causada por VP-16 in vitro gratis (Figura 4A-D).}

• PLoS ONE: Funciones microARN-219-2-3p como un supresor tumoral en el cáncer gástrico y está regulado por el ADN Methylation
• PLOS ONE: Asociación entre la glutatión S-transferasa T1 nulo genotipo y el riesgo de cáncer gástrico: Un meta-análisis de 48 estudios