PLOS NËMMEN: Noninvasive Visualization vun MicroRNA-16 an d'Chemoresistance vun Gastric Cancer engem Dual Reporter Gene Imaging System

Wat VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) goufen eng zentral Roll an der Entwécklung vun Drogenofhängeger Resistenz zu Leeschtung agebonne an enger Rei vu malignancies. vill Studien sech um kënschtlech VerfÜgung Niveau gehaal Allerdéngs, an konnt net wats de zu VIVO VerfÜgung Informatiounen iwwert d'Funktioun vun miRNAs an der anticancer Drogenofhängeger Resistenz. Hei, mir agefouert eng duebel reporter Gentherapie Imaging System fir noninvasively der kinetescher Ausdrock vun miRNA-16 Iwwerwachung während chemoresistance zu gastric Kriibs souwuel kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. Mënsch Natrium Kaliumiodid symporter (hNIS) an Liichtkäfer luciferase (Fluc) Genen huet Hausnummeren hNIS /Fluc duebel Fusioun reporter Gentherapie zu Form an dann Mënsch gastric Kriibs Zell Linn NF-3xmir16 a seng multidrug Resistenz Zell Linn NF-3xmir16 /VCR generéieren. Radioiodide Notzong an Fluc luminescence Signaler kënschtlech VerfÜgung soll gutt mat onerwaarden Zell Zuelen. D'luciferase Aktivitéiten an radioiodide Notzong vun NF-3xmir16 Zellen sech bemierkenswäert vun exogenous oder endogenous miRNA-16 repressed. D'NF-3xmir16 /VCR Zellen zougedréckt e wesentleche Erhéijung vun 131I Notzong an luminescence Intensitéit Verglach zu NF-3xmir16 Zellen. D'Radioaktivitéit aus zu VIVO VerfÜgung 99mTc-pertechnetate Imaging an d'Intensitéit vun bioluminescence Imaging sech och an NF-3xmir16 /VCR fräi Verglach mat deem vun NF-3xmir16 entholl xenografts. Doriwwer, dass de Rapporteur Gentherapie System benotzt, fonnt mir dass etoposide (VP-16) an 5-fluorouracil (5-FU) ausgeléist miRNA-16 Ausdrock kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung, an der upregulation vun miRNA-16 ass p38MAPK ofhängeg mä NF-κB onofhängeg. Dës duebel Imaging reporter Gentherapie vläicht fir zu VIVO VerfÜgung Imaging vun microRNAs an der chemoresistance vun Cancers, wéi och fir fréi ze erkennen an Diagnos an eng Ambulanz als Roman Outil zerwéiert ginn VerfÜgung

Fro:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Noninvasive Visualization vun MicroRNA-16 an d'Chemoresistance vun Gastric Cancer engem Dual Reporter Gene Imaging System benotzt. PLoS NËMMEN 8 (4): e61792. Doi: 10.1371 /journal.pone.0061792 VerfÜgung

Redakter: Javier S. Castresana, Universitéit vun Navarra, Spuenien VerfÜgung

Arnaque: 21. November 2012; Akzeptéiert: 13. Mäerz 2013; Publizéiert: April 17, 2013 VerfÜgung

Copyright: © 2013 Wang et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht der National Natural Science Foundation vu China ënnert Grant Nos war duerch de Programm vun der National Grondakommes Fuerschung an Entwécklung plangen vu China (973) ënnert Grant Nr 2012CB518101, 2011CB707702 ënnerstëtzt,. 81090272, 81090274, 81227901, Innovation Team Development Grant duerch China Pompjeeën vun der Education (2010CXTD01), 863 plangen vu China (2012AA02A603) an der National Key Technology Support plangen ënner Grant Nr 2012BAI23B06. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:. Co-Auteur Xiaoyuan Chen déngt als Redakter fir dës Zäitschrëft. Dëst heescht net de onvergläichleche 'Auteuren ofzeänneren un all déi Politiken PLOS NËMMEN op sharing Daten a Material. VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs bleift d'éischt Virwaat Ursaach vum Kriibs Doud an China an d'véiert stäerkste gemeinsam malignancy weltwäit trotz engem dramateschen geloss an hir veruerteelt an morbidity iwwer de leschten dräi Joerzéngte [1]. Chimiotherapie gouf souwuel resectable an fortgeschratt gastric Kriibs unzegesin oft benotzt, Spëtzekandidat fir Verbesserungen am Allgemengen Iwwerliewe souwéi Liewensqualitéit fir Patiente [2], [3]. Allerdéngs klappt langfristeg Chimiotherapie oft all entholl Zellen eliminéiert, well vun Ausriichtung oder Qualifikatiounen multidrug Resistenz (fir Premier), deen am meeschte Primärschoul Ursaach vun entholl Terrain ass [4]. Am Moment, huet de Premier als multifactorial Phänomen considéréiert ginn Noutfall puer Haaptgrond Mechanismen sensibiliséieren, dorënner fräi ukuerbelt vun Drogen, ofgeholl Notzong vum Waasser-soluble Drogen, verännert Drogenofhängeger Ziler, reduzéiert intracellular Drogenofhängeger Konzentratioun vun efflux Pompelen, verännert Zell Zyklus checkpoints an entschlof Äntwert Genen apoptotic Weeër ze leider, etc VerfÜgung [5]. Obwuel de Premier Mechanismen extensiv lant goufen, bleiwen der Schlëssel determinants vun dësem Phänomen gréisstendeels onkloer. VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) sinn eng Verfilmung Klass vun endogenous kleng noncoding RNAs (19-23 nucleotides) déi negativ op Gentherapie Ausstralung regléieren d'Post-transcriptional Niveau vun perfekt oder bruëcht huel Accord mat der untranslated Regioun 3 (UTR) vun Zil- mRNAs an domat mRNAs ofgeschnidden oder Iwwersetzung Repressioun [6] induce. Moment, hunn uginn Studien der Existenz a Bedeitung vun miRNAs an der Evolutioun vun anticancer Drogenofhängeger Resistenz an miRNAs Ausdrock profiling ugeholl ka mat der Entwécklung vun Drogenofhängeger Resistenz soll ginn [7] - [10] wat beweist, datt d'miRNAs-mediated Form vun Drogenofhängeger Resistenz Dësweidere anere Mechanismus vum Premier. An eiser leschter Etude, et gouf confirméiert, datt zwou miRNAs, miRNA-15B an miRNA-16, sech zu engem multidrug-resistent géint Mënscherechter gastric Kriibs Zell Linn SGC7901 /VCR a sengen Elteren Zell Linn SGC7901 [11] differentially ausgedréckt. Allerdéngs war et nëmmen op der kënschtlech VerfÜgung Niveau gehaal an hätt net d' zu VIVO VerfÜgung Informatiounen iwwert d'Funktioun vun miRNAs an der anticancer Drogenofhängeger Resistenz spigelen. VerfÜgung

rezenten Fortschrëtter zu molekulare Imaging Techniken erlaabt der noninvasively visualization vun normal an Manque bewosst Prozesser an liewege Sujeten am molekulare Nivo wéi um anatomic Niveau [12]. Puer noninvasive Strategien, wéi eng unisse FAQ, luciferase reporter Gentherapie, nucleolin aptamer oder unisse molekulare Punk conjugated nanoparticle benotzt, goufen während carcinogenesis, neurogenesis oder myogenesis kënschtlech VerfÜgung den Ausdrock Musteren vun verschiddenen miRNAs ze kontrolléieren entwéckelt an zu VIVO VerfÜgung [13] - [16]. Déi heiteg Etude war e noninvasive Method fir iwwerwaacht miRNA-16 am chemoresistance vun gastric Kriibs duerch eng duebel Imaging reporter Gentherapie System an déi mënschlech Natrium Kaliumiodid symporter (hNIS) an Liichtkäfer luciferase (Fluc) Genen zu enger Fusioun Gentherapie verbonne waren aféiere fir bioluminescence Imaging a 99mTc-pertechnetate ESO Kamera Imaging zu VIVO VerfÜgung. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Déieren VerfÜgung

Spezifësch pathogen-gratis 8-Woch -old weiblech BALB /c Sauna Mais sech aus der Shanghai Déieren Center zu China kritt an am véierten Military Medical University Déier Zentrum, China flegelhaft. All experimentell Déieren goufen ënner bestëmmten pathogen-gratis Konditiounen waren. D'Déier Ëmwelt- an dëser Etude benotzt goufen vun der véierter Military Medical University IFLA- Kritik Verwaltungsrot guttgeheescht. All Prozedure goufen am Aklang mat der véierter Military Medical University Guide fir d'Fleeg an Uwendung vun schafft Déieren formuléiert vun der National Society fir medezinesch Fuerschung gesuergt. VerfÜgung

Reagents an antibodies VerfÜgung

Mouse monoclonal antibody géint hNIS (ab17795) war vun Abcam kaaft. Kanéngchen polyclonal antibody spezifesch ze BCL-2 war vun Santa Cruz Déi (Santa Cruz, CA) kaaft. Bay11-7082 (NF-κB inhibitor) an SB203580 (p38 MAPK inhibitor) sech aus Beyotime Institut Déi (Shanghai, China) kritt. D'anticancer Drogen dorënner vincristine (VCR), etoposide (VP-16), mitomycin C (Britney), cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) an Adriamycin (ADR) huet sech aus Wolsen Déi (Xian kaaft, China). D'GV260-Fluc-Puro lentivirus plasmid war vun Shanghai GeneChem Company (Shanghai, China) kritt. All Zell Kultur Medien an serum sech aus Gibco (Grand Island, NY) kaaft. VerfÜgung

Dual reporter Gentherapie plasmid bauen VerfÜgung

D'coding Haaptrei vun hNIS Gentherapie war vun Hinnen alleguer aus engem plasmid Implikatioune Audit vun Dr. Weidong Yang (soll Military Medical University, China), andeems der folgende primers: VerfÜgung

hNIS-kascht: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 "VerfÜgung

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 "VerfÜgung

fir de Bau vun engem Ofwaassersystem Ausdrock Vecteure, war d'cDNA vun hNIS Gentherapie an der gesaat BamH VerfÜgung ech an Alter VerfÜgung ech Restriktioun Aktivitéit Siten vun engem lentiviral Vecteure GV260 -Fluc-Puro (Shanghai GeneChem, China), datt e Fluc Gentherapie ënnert der Kontroll vun der ubiquitin Promoteur encodes. Déi doraus resultéierend duebel Ausdrock bauen GV260-hNIS /Fluc war weider benotzt GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plasmid ze generéieren. Dräi Kopien vun ergänzen Message géint miRNA-16 (3xmir16) sech no der Paus codon vun der hNIS gesaat /Fluc Fusioun Gentherapie GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (Dorënner 1A) ze generéieren. A Jacquerie Nukleotid Haaptrei vun ähnlechen Längt ze 3xmir16 war och bei der 3'UTR vun hNIS /Fluc Fusioun Gentherapie hin eng Kontroll bauen (GV260-hNIS /Fluc-Match. D'3xmir16 Haaptrei oder Alaister Haaptrei vun annealing de folgenden oligonucleotides kritt ze kréien : VerfÜgung

3xmir16-kascht: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 "VerfÜgung

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3" VerfÜgung

Silessia-kascht: 5 "- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3" VerfÜgung

Silessia-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA VerfÜgung

gastric Kriibs Zell Kultur a stabil Zell Linn Generatioun VerfÜgung

Mënscherechter Linn gastric Zell Kriibs SGC7901 a seng multidrug-resistent Variant SGC7901 /VCR (gegrënnt an an eisem Labo haten wéi virdru beschriwwen [11]) waren cultured zu RPMI-1640 mëttelfristeg mat 10% an et Kallef serum nà an 100 Unitéiten penicillin an 100 μg /mL streptomycin (Invitrogen ). Fir de Premier phenotype, vincristine (mat Finale Konzentratioun vun 1 μg /ml) erhalen war fir SGC7901 /VCR Zellen zu der Kultur mëttelfristeg agefouert. Ze generéieren stabil Zell Linn, lentivirus Vecteure GV260-hNIS /Fluc oder GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 war brutal 293T Zellen cotransfected mat plasmids Verpakung ( Série, pol, VSV-g VerfÜgung). Wuesstem mëttelfristeg war um 6 h Post-transfection an lentivirus-haltege supernatant geännert um 48 h Post-transfection recoltéiert war. Recoltéiert supernatants sech op 4.000 g fir 10 min centrifuged Zell Stëps ze PELLET. Konzentratioun Virus gouf op 293T Zellen titrated. SGC7901 Zellen an SGC7901 /VCR Zellen sech mat GV260-hNIS /Fluc an GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 Virus transduced respektiv bei enger Zuel vun Wonn (MOI) vum 10. Dann huet d'Zellen mat puromycin fir 3 Wochen an Zell Kolonien opgefouert goufen gesammelt fir erweidert fir nächst Schrëtt Experimenter VerfÜgung

RNS oligos an transfection VerfÜgung

d'miRNA-16 an negativ Kontroll (NC) RNS oligos sech Wierderbuch (Shanghai GenePharma, China) vun de folgende Message mat.: VerfÜgung

miRNA-16 Sënn: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 "VerfÜgung

miRNA-16 anti-Sënn: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3" VerfÜgung

NC Sënn: 5 "-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3" VerfÜgung

NC anti-Sënn: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 "VerfÜgung

ier transfection, goufen SGCC7901 Zellen op 1 × 10 géint 5 Zellen pro och zu engem 24-gutt zappen an fir 24 h wuessen. Transfection war mat Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) standing no de Protokoll d'Hiersteller. All transfection sech zu triplicate duerchgefouert. VerfÜgung

Chemeschen real Zäit Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) Analyse VerfÜgung

Total RNS aus der cultured Zellen isoléiert war mat Trizol (Invitrogen). RT huet mat PrimerScript RT Regent Kit gesuergt (TaKaRa, Japan) an qPCR war mat Fast SYBR Green Master Mix (Obwuel Biosystems, Foster City, CA) an Abi StepOne Plus Real-Zäit Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystems) standing no de Protokoll d'Produktioun . Hinnen alleguer Produiten sech op 3% agarose gels analyséiert. Der relativer Montant vun miRNA-16 war bis U6 snRNA normalized. An der famill Montant vun Fluc war bis GAPDH Gentherapie normalized. Déi fantastesch-Ännerung fir miRNA-16 oder Fluc Gentherapie aus Experimenter Grupp relativ zu der Kontroll Grupp war den 2 berechent benotzt -ΔΔCt Method, wou ΔΔCt = ΔCt Experimenter - ΔCt Kontroll an ΔCt = CT miRNA - CT U6 oder ΔCt = CT Fluc - CT GAPDH. Hinnen alleguer war zu triplicate gesuergt. D'primers fir Desaccord-Glück RT-Hinnen alleguer fir Mir-16 benotzt ginn opgezielt wéi follegt: VerfÜgung

U6 kascht: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 "VerfÜgung

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "VerfÜgung

Mir-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3" VerfÜgung

Mir-16 kascht: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 "VerfÜgung

Mir-16 Rev: 5 "-TGCGTGTCGTGGAGTC-3" VerfÜgung

FLuc-kascht: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 "VerfÜgung

FLuc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3" VerfÜgung

GAPDH-kascht: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 "VerfÜgung

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3" VerfÜgung

Western blot Analyse VerfÜgung

SGC7901 Zellen sech dräimol mat PBS zou an dann lysed zu kal lysis Prellbock (20 mm NaCl, 200 mm Tris-HCl [pH 7.4], 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Triton X-100 an 1% aprotinin) fir 30 min op Äis. Zell lysates sech dann bei 12.000 Ziichter fir 15 min bei 4 ° C centrifuged. D'supernatant war gesammelt an derselwechter Héicht vun FAQ sech vun 8% SDS-PAGE geléist an duerno zu nitrocellulose Schläimhait transferéiert. D'Schläimhait sech zu ëmmer Léisung mat 5% BSA fir 1 h bei Raumtemperatur incubated, an dann mat uginn antibodies immunoblotted. Immunoreactive Bands sech mat enger verstäerkter chemiluminescence Kit (Amersham Pharmacia Verletzung, Piscataway, NJ) visualized. VerfÜgung

MTT assay VerfÜgung

Fir de Wuesstem Tariffer vun NF-eidel festzestellen, NF-3xmir16 an NF-3xmir16 /VCR Zellen, goufen dës dräi Zorte vun Zellen an 96-gutt Placke mat der selwechter Zuel (5000 Zellen) pro gutt inoculated. Op verschiddene Zäit Punkten (24, 48, 72, 96 h), 25 μl vun 5.0 mg /ml steril Filter 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Fläch) fir all gutt ugebaut. D'unreacted Hoerfaarw war no 4 h incubation ofgegruewen an der insoluble formazan Kristaller sech zu 100 μl vun dimethylsulfoxide (DMSO) opgeléist. D'absorbance bei 570 nm (Lokalzäit Wellelängt, 630 nm) war mat engem Synergy II multimode microplate Lieser (BioTech Instrumenter, Dofir) gemooss. VerfÜgung

radioaktiv Kaliumiodid Notzong assay VerfÜgung

Fir der Relatioun tëscht Kaliumiodid z'identifizéieren Notzong an Zell Zuel, sech e dilution Serie vun Zellen an 24-gutt Placke inoculated. No 12 h incubation, war den 131I Notzong Niveau iwwerpréift. D'Kaliumiodid Notzong vun incubating d'Zellen mat 500 μL Hanks "ausgeglachen Salz Léisung (HBSS) mat 0,5% Bovine serum albumin mat 37 kBq vun Ballgewënn-gratis Na 131I an 10 mm NaI fir 30 min alles war. No incubation, goufen d'Zellen duebel sou séier wéi méiglech mat 1 ml vun Äis-kal HBSS gefiermt gewäsch. Zellen sech mat 200 μL trypsin ugebauten, an d'Radioaktivitéit war mat engem γ-Konter (Perkin-Elmer) gemooss. Fir d'funktionell Ausdrock vun hNIS zu reporter Gentherapie System, NF-3xmir16 Zellen deeër sech bei 1 × 10 5 Zellen pro och zu engem 24-Meter zappen de Virowend transfection, dann miRNA-16 a NC oligos rakommen an huet transfected . 24 h méi spéit, huet de Kaliumiodid Notzong gemooss, wéi uewe beschriwwen. VerfÜgung

An kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging assay VerfÜgung

Fir der Relatioun tëscht luminescence Signaler a Zell Zuelen, e dilution Serie z'identifizéieren vun Zellen sech an 24-gutt Placke inoculated. No 12 h incubation, war all gutt mat phosphate-beffered Salins (PBS) gewäsch. Dunn D-Luciferin (Xenogen) op enger Konzentratioun vun 0,5 mmol /L war direkt virun assay notéiert. Bioluminescence war mat enger IVIS 100 Imaging System (Xenogen) gemooss an analyséiert d'Wunnen Image Software Versioun benotzt Kubikmeter op 2,50 (Xenogen). Fir d'funktionell Ausdrock vun Fluc zu reporter Gentherapie System, NF-3xmir16 Zellen deeër sech bei 1 × 10 5 Zellen pro och zu engem 24-Meter zappen de Virowend transfection, dann miRNA-16 a NC oligos rakommen an huet transfected . 24 h drop, war d'bioluminescence assay gemooss, wéi uewe beschriwwen. VerfÜgung

Bioluminescent a 99mTc-pertechnetate Imaging an Sauna Mais VerfÜgung

Gläich Zuelen (5 × 10 6 Zellen) vun NF-eidel an NF-3xmir16, oder NF-3xmir16 /VCR an NF-3xmir16 Zellen, goufen xenografted subcutaneously an déi lénks a riets hënnescht Säit vun all Sauna Maus wéi zu Resultater uginn. Bioluminescent Imaging war een Dag an der Zell Sprëtz chrétienne. All Mais sech mat 2,5% isoflurane Gas an Sauerstoff op engem Flux vun 1,5 L /min Nodeel. Meng Léisung vun D-luciferine (150 mg /kg Kierpergewiicht) war percutaneously 10 min ier Imaging heijen. De ganze-Kierper Biller fir Fluc Signaler ware fir 2 min Qualifikatiounen a Wunnen Image Software (Xenogen) war Lafen bioluminescent Biller ze kréien. A ROI war manuell iwwer d'Signal Intensitéit ausgewielt. Bioluminescence Signaler als photons pro Sekonn pro Kubikzentimeter bedréit (p /sec /cm 2 /SR) bannent enger ROI ausgedréckt. VerfÜgung

Fir nuklear Imaging, déi entholl Mais sech intraperitoneally heijen mat 18.5 MBq dotéiert vun 99mTc-pertechnetate um 2weeks der Zell Sprëtz. 30 min der Sprëtz, d'Déier zu enger Diffusioun-supine Positioun op d'Bett vun der SPECT Scanner (Symbia T2, Acda) gesat. Anästhesie war mat 1% -2% isoflurane zu 100% O _{2 beim Sprëtzen an Imaging gesuergt. All Biller waren mat engem 2-Dimensiounen bestallt-subsets Erwaardung maximal sind rekonstruéiert. Aktivitéit war vun ukuckt de Regioune vun interesséieren (ROI) an der erhéijen an der Géigend vun der ROI laachen war fir all nuklear an opteschen Biller konstant gehaalen. No bioluminescent a 99mTc-pertechnetate Imaging, goufen d'erhéijen gesammelt a gewien. VerfÜgung}

statistique Analyse VerfÜgung

Resultater sinn als mengen ± Fils ausgedréckt. Donnéeën weist Vergläicher tëschent zwou Gruppe mat évaluéieren d'T-Test vum Student. Vergläicher tëschent méi wéi zwou Gruppe sech mat der Analyse vun Varianz (ANOVA) mat de passenden posthoc Testen évaluéieren. P Wäerter &Si besteet;. 0,05 waren statistesch relevant als VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Grënnung vun gastric Zell Kriibs Linnen stably hNIS an Fluc Genen VerfÜgung

ausdrécken enger Fusioun reporter Gentherapie ze generéieren (GV260- hNIS /Fluc, Éieren NF-eidel), de hNIS cDNA war an engem lentivirus Vecteure gekloonten (GV260-Fluc-Puro) Zeechesaatz engem Fluc Gentherapie eng Fusioun FAQ ze generéieren, déi ënnert der Kontroll vun ubiquitin Promoteur war. Dann dräi Kopien vun ergänzen Message géint miRNA-16 (3xmir16) no der Paus codon vun der hNIS /Fluc Fusioun Gentherapie gesaat goufen aner bauen ze generéieren (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, Éieren NF-3xmir16) (Dorënner 1A). A Jacquerie Nukleotid Haaptrei vun ähnlechen Längt ze 3xmir16 och um 3'UTR vun hNIS /Fluc Fusioun Gentherapie gesaat gouf eng Kontroll bauen (fir NF-Alaister GV260-hNIS /Fluc-Match, bezeechent) ze kréien. An kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging zougedréckt datt Fluc Gentherapie Aktivitéit aus NF-eidel Zellen ähnlech war dat fir aus NF-Alaister Zellen (Dorënner S1A). Also wielen mir de NF-eidel bauen an weider studéieren. Zwee Zell Linnen, eng fir Premier Mënsch gastric Kriibs Zell Linn SGC7901 /VCR a sengen Elteren Zell Linn SGC7901, sech mat der lentivirus transduced bzw. der NF-eidel oder NF-3xmir16 Gentherapie wouvun dräi stabil Zell Linnen NF-eidel /SGC7901, NF ze etabléieren -3xmir16 /SGC7901 an NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (Éieren NF-eidel, NF-3xmir16 an NF-3xmir16 /VCR). Éischt opgeféiert mir MTT assay de Wuesstem Taux vun deenen dräi Zell Linnen (Dorënner S1B) ze moossen. Dunn perfomed mir qPCR assay der integréiert Exemplare vum Rapporteur gesond an der dräi Zell Linnen (Dorënner S1C) ze ermëttelen. An kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging (Dorënner 1B) a westlech blotting (Dorënner 1c) sech weider standing der erfollegräich Ausdrock vun Fluc an hNIS Genen vun dësen dräi Zell Linnen ze weisen. VerfÜgung

Linearity Korrelatioun vun Fluc an hNIS transgene Aktivitéiten mat Zell Zuelen kënschtlech

der Fluc an hNIS transgene Aktivitéite vun Zellen ze diskutéieren, mir standing kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging a 131I radioiodide Notzong assays zu engem dilution Serie vun den NF-3xmir16 Zell Linnen. Als zu Dorënner 1D gewisen, no Erhéijunge vun der Zuel vun Zellen, fräi Heefung vun luminescence och. Bioluminescence Signaler sech ze vergläichen gutt mat Zell Zuelen fonnt (γ 2 = 0,9990) (Dorënner 1E). Mëttlerweil, 131I Notzong war och mat Zell Zuelen (Dorënner 1F) fräi. D'radioiodide Notzong war observéiert gutt soll (γ 2 = 0.9543) mat Zell Zuelen (Dorënner 1G). Well d'Fluc mat hNIS, eng gutt Korrelatioun tëscht bioluminescence Intensitéit Äonen war an 131I Radioaktivitéit ass an Zellen no der linear Réckgang Analyse bemierken (γ 2 = 0.9339) (Dorënner 1H). VerfÜgung

Confirmatioun vun miRNA-16 Aktivitéiten via VerfÜgung de Rapporteur Gentherapie System VerfÜgung

fir ze testen ob NF-3xmir16 reporter Vecteure miRNA-16 Zil- Message mat vun exogenous miRNA-16 repressed war, mir iwwerpréift der Fluc an hNIS Aktivitéit no miRNA-16 anzeféieren. Am Verglach zu de mat NC oligos transfected Zellen, goufen d'bioluminescence Signal vun 35% vun den Zellen ofgeholl transfected mat miRNA-16 (Dorënner 2A an 2B). An der 131I radioiodide Notzong vun miRNA-16 transfected Zellen war ongeféier 70% vun deem vun NC transfected duerch radioaktiv Zielen laachen Zellen (Dorënner 2C). An der Fluc an hNIS Aktivitéit sech zu enger Portioun ofhängeg Manéier (Dorënner S1D-F) ofgeholl. Dës Donnéeë uginn, datt d'NF-3xmir16 reporter bauen vun miRNA-16 modulated ginn hätt. VerfÜgung

Detektioun vun endogenous miRNA-16 Ausdrock kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung

fir d'endogenous miRNA-16 Ausdrock Niveau vun gastric Kriibs Zellen entdecken kënschtlech VerfÜgung, gläichberechtegt Zuelen (1 × 10 6) vun NF-eidel an NF-3xmir16 Zellen sech rakommen an dann der Fluc an hNIS Aktivitéit goufen iwwerpréift. Als zu Dorënner 2D an 2E gewisen, war vun ongeféier 50% vun endogenous miRNA-16 Fluc Aktivitéit, déi aus NF-3xmir16 Zellen erofgaangen am Verglach mat deem vun NF-eidel Zellen. An der hNIS Aktivitéit aus NF-3xmir16 Zellen war och vun iwwer 40% an Äntwert ze endogenous miRNA-16 am Géigesaz zu deem vu NF-eidel Zellen (Dorënner 2F) reduzéiert. D'Feele vu Repressioun vun Aktivitéiten Fluc oder hNIS zu NF-eidel Zellen observéiert ass am Respekt dass et zu NF-eidel bauen kee miRNA-16 Zil- Siten huet. VerfÜgung

D'duebel Imaging reporter Gentherapie System erlaabt zu VIVO VerfÜgung visualization vun endogenous miRNA-16 Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen. Gläich Zuelen (1 × 10 7) vun NF-eidel an NF-3xmir16 Zellen sech xenografted subcutaneously an déi lénks a riets hënnescht Säite vun all Sauna Maus (n = 6) an dann bioluminescent Imaging a 99mTc-pertechnetate ESO Kamera Imaging sech chrétienne. Als zu Dorënner 2G gewisen, Intensitéit luminescence aus implanted NF-3xmir16 Zellen sech iwwer 55% manner wéi déi aus NF-eidel Zellen, ähnlech fir d'Differenz vun luciferase Aktivitéiten gemooss kënschtlech VerfÜgung (Dorënner 2D an 2E). No der intraperitoneal Sprëtz vun 99mTc-pertechnetate op 18.5 MBq, war ESO Kamera Imaging gesuergt. Am Géigesaz zu NF-eidel erhéijen, déi dichteg Notzong vun 99mTc-pertechnetate zougedréckt, NF-3xmir16 erhéijen zougedréckt negligible Notzong (Dorënner 2H), déi besot endogenous miRNA-16 der hNIS Ausdrock reduzéiert. Physiologic Notzong war och um Site vun der Schild, Moo an BBC observéiert, an déi hNIS ass normalerweis ausgedréckt. Regioune vun interesséieren (ROI) Analyse gewisen, datt hNIS Aktivitéit vill an NF-3xmir16 xenografts erofgaangen am Verglach mat deem vun NF-eidel xenografts (Dorënner 2H). No Imaging, mir gesammelt a gewien der NF-eidel an NF-3xmir16 erhéijen (Dorënner S1G). D'Resultat huet se d'selwecht Gewiichter haten, uginn, datt d'Differenzen an Signal Intensitéit sinn zwar wéinst endogenous miRNA-16 Funktioun awer net Zuelen Zell. VerfÜgung

Visualization vun Ausdrock Ännerung vun miRNA-16 zu fir Premier gastric Kriibs Zellen kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO

den Ausdrock Ännerung vun miRNA-16 zu Drogenofhängeger resistent Zellen gastric Kriibs festgestallt gouf via VerfÜgung der Fluc an hNIS Aktivitéit vun bioluminescence Imaging a 131I radioiodide Notzong assays. Béid Fluc Aktivitéit (Dorënner 3A an 3B) an hNIS Aktivitéit (Dorënner 3C) vun ongeféier 1,5 fantastesch an NF-3xmir16 /VCR Zellen fräi als Verglach mat deem vun NF-3xmir16 Zellen, déi proposéiert datt miRNA-16 zu NF-3xmir16 downregulated war /VCR Zellen. Fir d'Resultater vun reporter Gentherapie System, grouss RT-Hinnen alleguer (Q-Hinnen alleguer) war vun dësen zwou Zell Linnen d'Ënnerscheed Ausdrock vun miRNA-16 bis Analyse kritt hien higeriicht. Am Aklang mat de Rapporteur Gentherapie System Donnéeën, zougedréckt Q-Hinnen alleguer ofgeholl miRNA-16 Besatzungszäit NF-3xmir16 /VCR Verglach zu sengem Kolleg NF-3xmir16 Zellen (Dorënner 3D). VerfÜgung

Fir noninvasive grouss Iwwerwachung vun miRNA- 16 Ënnerscheed Ausdrock an fir Premier gastric Kriibs Zellen am VIVO VerfÜgung, bioluminescent Imaging a 99mTc-pertechnetate ESO Kamera Imaging waren gesuergt. D'bioluminescent Imaging bewisen, dass luminescence Signaler 1,7 fantastesch Erhéijunge vun de NF-3xmir16 /VCR xenografts versus NF-3xmir16 xenografts (Dorënner 3) goufen, am Aklang mat der Luucht vun luciferase Aktivitéit gemooss kënschtlech VerfÜgung (Dorënner 3A an 3B). D'Sprëtz vun 99mTc-pertechnetate an der Acquisitioun vun ESO Kamera Imaging uginn, dass eng méi héich Heefung vun 99mTc-pertechnetate war, datt an NF-3xmir16 /VCR xenografts observéiert wéi zu NF-3xmir16 xenografts. Gestallt 99mTc-pertechnetate accumulations sech och an der es of, BBC a Mo. (Dorënner 3F) observéiert. An der NF-3xmir16 an NF-3xmir16 /VCR erhéijen haten d'selwecht Gewiichter (Dorënner S1H). VerfÜgung

VP-16 a 5-FU upregulation vun miRNA-16 Ausdrock noninvasively duerch d'duebel reporter Gentherapie System Radioberäich

fir erauszefannen, ob aner anticancer Drogen miRNA-16 Ausdrock Profil ofzeänneren konnt, fënnef Medeziner Drogen fir sech gastric Kriibs ze NF-3xmir16 Zellen dobäi gefollegt vun kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging a 131I radioiodide Notzong assays. D'Resultater verroden, datt d'luminescence Intensitéit (Dorënner 4A an 4B) oder déi bewosst Kaliumiodid Notzong (Dorënner 4E) zu VP-16 immens stéiert reduzéiert goufen, 5-FU an CDDP, mä net zu MMC an ADR Behandlung Verglach zu deenen nontreated Zellen. VerfÜgung

d'Grënn fir d'Verréngerung Signal an VP-16 observéiert, 5-FU an CDDP Behandlung kéint sinn, dass d'Drogen endogenous miRNA-16 Ausdrock oder inhibited bewosst Wuesstem och ëmmer Zell Doud ausgeléist. Vir sech dësen Méiglechkeet, de fënnef Drogen derbäi ze NF-eidel Zellen, déi kee miRNA-16 Zil- Siten an der bauen enthalen. D' kënschtlech VerfÜgung bioluminescence Imaging Resultater bewisen, dass VP-16 a 5-FU kee inhibitory Effekt op d'luminescence Intensitéit haten hierkommen CDDP nach de luminescence Signal (Dorënner 4C an 4D) verkierzt, wat beweist, datt CDDP bewosst inhibit vläicht Wuesstem awer net endogenous miRNA-16 Ausdrock aktivéieren. Wéinst dem Britney an ADR sech ze liicht Erhéijung der luminescence Intensitéit vun béiden NF-3xmir16 an NF-eidel Zellen (Dorënner 4A-D) fonnt, deen aus der Promotioun bewosst Prolifératioun Resultat kann. VerfÜgung

Fir behaapt datt miRNA-16 Aktivéierung deelgeholl an anticancer Auswierkunge vun VP-16 a 5-FU, Q-Hinnen alleguer gesuergt huet de miRNA-16 Niveau vun NF-3xmir16 Zellen Belaaschtung ze bestëmmen Drogen Behandlungen ze anticancer. An anere Wierder, huet miRNA-16 Ausdrock vill no VP-16 oder 5-FU Behandlungen an SGC7901 Zellen am Verglach zu der onbehandelt Kontroll Zellen upregulated, iwwerdeems Britney, ADR a CDDP minor Effekt op miRNA-16 Ausdrock (Dorënner 4F) hat. VerfÜgung

erhéicht miRNA-16 Ausstralung vun VP-16 a 5-FU sinn an p38 MAPK Équipe mee NF-κB sécher Passerelle VerfÜgung

Ähnlech zu der modulation vun FAQ-coding RNS Genen, Transkriptiouns vun miRNA Genen schéngt duerch verschidde sécher Weeër reglementéiert gin. Aktivatioun vun der NF-κB oder MAPK sécher Weeër ass eng gemeinsam Äntwert folgenden chemotherapeutic Drogen [17], [18]. Dofir, Hypothes mir dass upregulation vun miRNA-16 vläicht e Resultat vun fräi NF-κB oder MAPK Aktivéierung der VP-16 oder 5-FU behandelt ginn. Fir d'Roll vun dësen sécher Weeër an VP-16 a 5-FU-entschlof transactivation vun miRNA-16 entschlësselen, gemooss mir éischter der luminescence Intensitéit an NF-3xmir16 Zellen an Äntwert op VP-16 a 5-FU an der Presenz oder Feele vun pharmacological inhibitors fir NF-κB oder p38 MAPK. Traitement vun Zellen mat engem spezifeschen NF-κB inhibitor, Bay 11-7082, hu keen Effet op d'luminescence Signal am Verglach zu der Drogenofhängeger behandelt Zellen ouni inhibitors (Dorënner S2). VerfÜgung

Am Géigesaz, Behandlung mat engem spezifeschen p38 MAPK inhibitor, SB203850, gerett Ofstand de Verloscht vun bioluminescence (Dorënner 5A an 5B) oder Kaliumiodid Notzong (Dorënner 5C) vun VP-16 a 5-FU Verglach mat der Behandlung Kontroll Zellen. Ze confirméieren war d'miRNA-16 Ausdrock Niveau vun der Präsenz vun SB203850, real Zäit Hinnen alleguer standing an d'Resultater weisen, datt inhibitory vun p38 MAPK drastesch Trupen VP-16 a 5-FU-entschlof miRNA-16 upregulation (Dorënner 5D), wat beweist, datt déi fräi miRNA-16 Ausdrock vun VP-16 a 5-FU zu MAPK sécher Passerelle p38 Équipe ass. VerfÜgung

Eis virdrun Etude huet bewisen, dass BCL-2 FAQ engem direkten Zil- Gentherapie vun miRNA-16 an d'Entwécklung ass vu fir Premier an SGC7901 gastric Kriibs Zellen [11]. Ze testen ob BCL-2 ass am VP-16 a 5-FU Stimulatioun vun miRNA-16 via VerfÜgung p38 MAPK Passerelle Équipe, mir alles BCL-2 FAQ Niveau vum südwestlechen blot Analyse. Als zu Dorënner 5E an 5F gewisen, VP-16 a 5-FU ofgeholl bedeitend der BCL-2 FAQ Niveau vun iwwer 50% am Verglach mat der onbehandelt Kontroll Zellen an d'Feele vun SB203850. Beim Traitement zesumme mat SB203850, gouf de Verloscht vun BCL-2 FAQ drastesch attenuated, proposéiert d'Wichtegkeet vun p38 MAPK Aktivatioun vun VP-16 a 5-FU-entschlof downregulation vun BCL-2 FAQ. VerfÜgung

an VIVO VerfÜgung Iwwerwachung vun verstäerkte miRNA-16 Ausdrock vun VP-16 a 5-FU VerfÜgung

fir noninvasive Iwwerwachung vun verstäerkte miRNA-16 Ausdrock entschlof zur VP-16 a 5-FU, NF-eidel an NF -3xmir16 Zellen sech op lénks a riets hindlimb vun all Maus näischt Bäigeprafftes (n = 6), bzw.. interfering zu der bioluminescence Signal aus NF-eidel verhënneren mat deem aus NF-3xmir16 am Laf vun Drogenofhängeger Behandlung, verschidden Zuelen vun NF-eidel (1 × 10 5 Zellen) an NF-3xmir16 (1 × 10 7 Zellen) huet näischt Bäigeprafftes. Als zu Dorënner 6 gewisen, huet bedeitend reduzéiert bioluminescence Intensitéit an NF-3xmir16 xenografts der VP-16 oder 5-FU Behandlung observéiert Verglach mat der nontreatment. Besonnesch, an Mais mat VP-16 behandelt, déi bioluminescence Signal vun iwwer 40% vun NF-3xmir16 xenografts reduzéiert hierkommen an NF-eidel xenografts versus pretreated Biller (Dorënner 6A an 6B) liicht geklommen, ähnlech fir d'Differenz vun luminescence Intensitéit ëmmer vun VP-16 kënschtlech VerfÜgung (Dorënner 4A-d).

• PLOS NËMMEN: MicroRNA-219-2-3p Virtrag als entholl Suppressor zu Gastric Cancer a reglementéiert duerch DNA Methylation
• PLOS NËMMEN: Association tëscht Glutathione S-Transferase T1 NULL Genotype an Gastric Cancer Risk: Eng Meta-Analys vun 48 Ënnersich