PLoS ONE: Neinvazinė vizualizacija MicroRNA-16 skrandžio vėžiu Atsparumas cheminėms Naudojant Dvigubas Žurnalistė Genų vizualizavimo sistema

Abstract

mikro RNR (miRNAs) buvo susijęs su vaidina pagrindinį vaidmenį atsparumo vaistams vystymąsi nuo piktybinių navikų įvairovė. Tačiau daugelis tyrimai buvo atliekami in vitro pervežimas lygiu ir negalėjo pateikti vivo
informaciją apie miRNAs į atsparumo vėžio narkotikų funkcijas. Čia mes pristatė dvigubą reporteris genų vaizdavimo sistemą noninvasively stebėti kinetinę raišką Mirna-16 Atsparumas cheminėms metu skrandžio vėžio ir in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Žmogaus natrio jodidas symporter (hNIS) ir Firefly liuciferazė (Fluc) genai buvo susijęs su forma hNIS /Fluc dvigubo sintezės reporteris geną ir tada sukurti žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos NF-3xmir16 ir jos atsparumas daugeliui vaistų ląstelių linijos NF-3xmir16 /VCR. Radioiodide įsisavinimą ir Fluc liuminescensinės signalai in vitro
koreliuoja ir su gyvų ląstelių skaičių. Liuciferazės veikla ir radioiodide įsisavinimas NF-3xmir16 ląstelių buvo nepaprastai represinių veiksmų egzogeninės arba endogeninio Mirna-16. NF-3xmir16 /VCR ląstelės parodė reikšmingą padidėjimą ^{131I įsisavinimą ir liuminescencine intensyvumo, palyginti su NF-3xmir16 ląsteles. Radioaktyvumo iš vivo
99mTc-pertechnetatui vaizdo ir intensyvumas nuo Bioluminescence vaizdavimo taip pat buvo padidintas NF-3xmir16 /VCR palyginti su, kad NF-3xmir16 navikų audiniuose. Be to, naudojant šią reporteris genų sistemą, mes nustatėme, kad etopozido (tik VP-16) ir 5-fluorouracilu (5-FU) aktyvuota Mirna-16 išraiška in vitro parsisiųsti ir vivo
ir iš Mirna-16 ląstelę yra p38MAPK priklauso bet NF-κB nepriklausoma. Šis dvigubas vaizdo reporterio genas gali būti patiekiami kaip naują priemonę vivo
vaizdo ir mikro RNR į vėžio Atsparumas cheminėms, taip pat ankstyvojo aptikimo ir diagnostikos klinika}

Citation:. Wang F, Lyrinės X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, ir kt. (2013) Neinvazinė vizualizacija MicroRNA-16 skrandžio vėžiu Atsparumas cheminėms Naudojant Dvigubas Reportažai Gene vaizdo sistema. PLoS ONE 8 (4): e61792. Doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

redaktorius: Javier S. Castresana, Navaros universitetas, Ispanija

Įstojo: Lapkričio 21, 2012 m Priėmė: nuo 13 d, 2013 m Paskelbta: Balandžio 17, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės pagrindinio tyrimų ir technologinės plėtros programoje Kinijos (973) lėšomis pagal dotacijos Nr 2012CB518101, 2011CB707702, Nacionalinis gamtos mokslų fondas Kinijoje pagal dotacijos Nr. 81.090.272, 81.090.274, 81.227.901, inovacijų Komandos ugdymas dotaciją Kinija departamento programa švietimo (2010CXTD01), 863 programa Kinijoje (2012AA02A603) ir nacionalinių pagrindinių technologijų rėmimo programos lėšomis pagal dotacijos Nr 2012BAI23B06. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. Bendraautoris Xiaoyuan Chen tarnauja kaip šio žurnalo redaktorius. Tai nekeičia autorių laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Skrandžio vėžys išlieka pirmoji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties Kinijoje ir ketvirtoji dažniausia piktybinis navikas pasaulyje, nepaisant dramatiškos sumažėjo jų mirtingumas ir sergamumas per pastaruosius tris dešimtmečius [1]. Chemoterapija buvo plačiai vartojamas tiek rezektabilus ir išplitusiu skrandžio vėžiu, todėl pagerėjo bendras išgyvenamumas taip pat gyvenimo kokybę pacientams [2], [3]. Tačiau, ilgalaikis chemoterapija dažnai nepavyksta pašalinti visus auglio ląstelių, nes savojo ar įgytas naviko atsparumą daugeliui vaistų (MDR), kuri yra labiausiai pagrindinė priežastis naviko [4] pasikartojimo. Šiuo metu MDR buvo laikomas daugiaveiksnio reiškinys apima keletą pagrindinės mechanizmus, įskaitant padidėjusio metabolizmo narkotikų, sumažėjo įsisavinimą vandenyje tirpių vaistų, pakeistos narkotikų tikslus, sumažinti ląstelėje narkotikų koncentraciją emanacijos siurbliai, pakeistos ląstelės ciklo kontrolės punktuose ir sukeliama ekstremalią situaciją atsako genai pakenkti apoptozinių kelius, ir tt
[5]. Nors MDR mechanizmai buvo plačiai ištirta, pagrindiniai lemiantys šio reiškinio esmės tebėra neaiški.

mikro RNR (miRNAs) yra romanas klasė endogeninių mažų nekoduojamame RNR (19-23 nukleotidų), kad neigiamai reguliuoti genų išraiškos ne post-transkripcijos lygio tobulas ar netobulas bazinės sujungimo su 3 "neišverstas regione (UTR) tikslinių mRNR ir taip sukelti mRNR degradacija ar vertimo represijas [6]. Šiuo metu besiformuojančios tyrimai parodė, egzistavimą ir svarbą miRNAs atsparių vėžio narkotikų ir miRNAs ekspresijos evoliucija gali būti susijęs su atsparumo vaistams plėtros [7] - [10] rodo, kad miRNAs tarpininkaujant forma atsparumo vaistams prideda dar vieną MDR mechanizmą. Mūsų ankstesniame tyrime, buvo pranešta, kad du miRNAs, Mirna-15b ir Mirna-16, buvo skirtingai išreikšta daugiskaitos atsparios žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901 /VCR ir jo tėvų ląstelių linija SGC7901 [11]. Tačiau ji buvo atliktas tik in vitro pervežimas lygio ir gali neatspindėti in vivo
informacijos apie miRNAs į atsparumo vėžio narkotikų funkcijas.

naujausi molekulinės vaizdo technika leidžia noninvasively vizualizacija įprastomis ir neįprastomis korinio procesus gyvuose dalykų molekulinio lygio, o ne anatominė lygio [12]. Keli neinvaziniai PPM strategijos, pavyzdžiui, naudojant fluorescencinis baltymas, liuciferazės reporteris genų, nucleolin aptamer arba fluorescencinės molekulinės švyturys konjuguoto nanodalelių, buvo sukurta stebėti raiškos modelius įvairių miRNAs metu Kancerogeninis ir neurogenesis ar myogenesis in vitro parsisiųsti ir vivo
[13] - [16]. Šis tyrimas buvo pristatyti neinvazinis metodas stebėti Mirna-16 skrandžio vėžiu Atsparumas cheminėms per dvigubą vaizdo reporterio genų sistema, kurioje žmogaus natrio jodidas symporter (hNIS) ir Firefly liuciferazė (Fluc) genai buvo susijęs su branduolių sintezės geno už Bioluminescence vaizdo ir ^{99mTc-pertechnetatui gama kamera vaizdo vivo
.}

medžiagos ir metodai

Gyvūnai

Specifinis patogenais neužkrėstų 8 savaičių -old moterys BALB /c nude pelėms buvo gauta iš Šanchajaus gyvūnų centras Kinijoje ir veisiami Ketvirta Karo medicinos universiteto gyvūnų centras, Kinijoje. Visi eksperimentiniai gyvūnai buvo laikomi tam tikromis patogenais neužkrėstų sąlygomis. Gyvūnų protokolai, naudojami šiame tyrime buvo patvirtinta Ketvirta Karo medicinos universiteto Etikos aspektų vertinimo valdyba. Visos procedūros buvo atliktos laikantis ketvirtosios Karo medicinos universiteto vadovas už rūpestį ir naudojimo laboratorinių gyvūnų suformuluotus nacionalinio draugijos medicinos tyrimų.

Reagentai ir antikūnai

Pelės monokloniniai antikūnai prieš hNIS (ab17795) buvo įsigytas iš Abcam. Triušis polikloninis antikūnas būdingi BCL-2 buvo pirktas iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-κB inhibitorius) ir SB203580 (p38 MAPK inhibitorius) buvo gauti iš Beyotime Biotechnologijos institutas (Šanchajus, Kinija). Į priešvėžiniai vaistai, įskaitant vinkristino (VCR), etopozido (VP-16), mitomicino C (MMC), cisplatina (CDDP), 5-fluorouracilu (5-FU) ir adriamicino (AGS) buvo nupirkta iš Wolsen biotechnologijos (Sianas, Kinija). GV260-Fluc-Puro lentivirus plazmidės buvo gauta iš Šanchajaus GeneChem Company (Šanchajus, Kinija). Visi ląstelių kultūrų terpės ir serumas buvo įsigytas iš Gibco (Grand Island, NY).

Dvigubas reporteris genų plazmidės statyti

kodavimo seka hNIS geno sustiprino PGR iš plazmidės maloniai numatyta dr Weidong Yang (ketvirtoji Karo medicinos universitetas, Kinija), naudojant šiuos pradmenis: Rīga,

hNIS-FW: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 "

hNIS-REV: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 "

dėl dvigubos išraiškos vektoriaus konstrukcija, iš hNIS geno kDNR buvo įtraukta į BamH
I ir , Amžius
Aš apribojimas fermentų svetainėse lentiviruso vektoriaus GV260 -Fluc-Puro (Šanchajus GeneChem, Kinija), kad koduoja Fluc geną pagal ubikvitino promotoriaus kontrolę. Gautas dvigubos išraiška konstruktas GV260-hNIS /Fluc toliau buvo naudojamas generuoti GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plazmidės. Trys egzemplioriai papildomų sekų prieš Mirna-16 (3xmir16) buvo įdėta po stop kodono hNIS /Fluc sintezės geno generuoti GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (1a pav.) Plakta nukleotidų seka panašaus ilgio 3xmir16 taip pat buvo įterptas hNIS /Fluc sintezės geno 3'UTR srities gauti kontrolės konstruktą (GV260-hNIS /Fluc-peštynės. 3xmir16 seka ar peštynės seka buvo gautas atkaitinimo šiuos oligonukleotidai : Rīga,

3xmir16-FW: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 "

3xmir16-REV: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3"

peštynės-FW: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3 "

peštynės-REV: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

skrandžio vėžio ląstelių kultūros ir stabili ląstelių linija kartos

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija SGC7901 ir jos daugiskaitos atsparus variantas SGC7901 /VCR (užmegzti ir palaikyti mūsų laboratorijoje, kaip aprašyta anksčiau [11]) buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, papildytoje su 10% serumas iš veršiuko embriono ir 100 vienetų penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino (Invitrogen ). Išlaikyti MDR fenotipą, Vinkristinas (su galutinė koncentracija būtų 1 g /ml) buvo pridėta į kultūros terpę, SGC7901 /VCR ląstelių. Norėdami sukurti stabilią ląstelių liniją, lentivirus vektoriaus GV260-hNIS /Fluc arba GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 pirmą kartą buvo cotransfected į 293T ląstelių su pakuote plazmidžių ( gag, pol, VSV-G
). Augimo terpė buvo pakeista 6 val po transfekcija ir lentivirus, kurių sudėtyje yra paviršinis buvo paruošta ne 48 h po transfekciją. Nuimami supernatantų, buvo centrifuguojamas 4000 g 10 min į granulių ląstelių nuolaužų. Koncentruotas virusas buvo parenkama atsižvelgiant 293T ląstelių. SGC7901 ląstelės ir SGC7901 /VCR ląstelės buvo transdukuotus GV260-hNIS /Fluc ir GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 viruso atitinkamai esant infekcijos gausos (MOI) nuo 10. Tada ląstelės buvo tikrinami su puromicino 3 savaites ir ląstelių kolonijos buvo surinkta išsiplėtė už ateinančius eksperimentų žingsnis

RNR oligos ir transfekcija

Mirna-16 ir neigiamos kontrolės (NK) RNR oligos susintetinti (Šanchajus GenePharma, Kinija), naudojant šias sekas.:

Mirna-16 jausmą: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 "

Mirna-16 kovos su protu: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3"

NC jausmas: 5 "-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3"

NC kovos su protu: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 "

Prieš transfekciją, SGCC7901 ląstelės buvo pasėtos ne 1 × 10 ^{5 ląstelių viename gerai į 24-šulinėlių plokštelė ir augti 24 h. Transfekcijq buvo atliktas su Lipofectamine 2000 reagento (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. Visi transfekcija buvo atliekami tris kartus.}

Kiekybiniai realaus laiko PGR (KRL-PGR) analizė

Viso RNR buvo išskirta iš fermentuotų ląstelių naudojant Trizol (Invitrogen). RT buvo atliktas su PrimerScript RT Regent Kit (TAKARA, Japonija) ir qPCR buvo atliktas su greitu SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija) ir ABI StepOne Plius Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems) pagal gamintojo protokolą , PGR produktai buvo analizuojamos remiantis 3% agarozės gelyje. Santykinis dydis Mirna-16 buvo standartizuoti U6 snRNA. Ir santykinis dydis Fluc buvo normalizuotas GAPDH geno. Sulenktas-pasikeitimas Mirna-16 arba Fluc geno iš eksperimentas grupėje, palyginti su kontroline grupe, buvo apskaičiuotas naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodas, kai ΔΔCt = ΔCt eksperimentas - ΔCt kontrolės ir ΔCt = Ct Mirna - Ct U6 arba ΔCt = ct Fluc - ct GAPDH. PGR buvo pakartotas tris kartus. Naudojamos kamieninių kilpa RT-PCR Mir-16 gruntai yra išvardyti taip: Rīga,}

U6 FW: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 "

U6 Apr 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "

Pasaulis-16 AT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3"

Pasaulis-16 FW: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 "

Pasaulis-16 Apr: 5 "-TGCGTGTCGTGGAGTC-3"

FLuc-FW: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 "

FLuc-REV: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3"

GAPDH-FW: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot analizė

SGC7901 ląstelės buvo tris kartus plaunamos PBS ir tada lizuojamos šaltame lizės buferiniame tirpale (20 mM NaCl, 200 mmol Tris-HCl, [pH 7,4], 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 1% Triton X-100 ir 1% aprotinino) 30 min ant ledo. tada ląstelių fragmentai buvo centrifuguojamas 12000 apsisukimų per minutę 15 min, esant 4 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo surinkti ir įpilama po vienodą kiekį baltymų buvo išspręstas 8% SDS-PAGE ir tada perkelti ant nitroceliuliozės membranos. Membranos buvo inkubuojami blokuojančiu tirpalu, kuriame yra 5% BSA 1 val kambario temperatūroje, ir tada immunoblotted su nurodytų antikūnų. Imunoreaktyvių juostos buvo ryškinamos naudojant sustiprintą chemiliuminescencine komplektas (Amersham Pharmacia Corp ", Piskatavėjus NJ).

MTT

Norėdami nustatyti augimo tempus NF-tuščias, NF-3xmir16 ir NF-3xmir16 /VCR ląstelės, šių trijų tipų ląstelių buvo pasėta į 96 duobučių lėkštelėse su tais pačiais numeriais (5000 ląstelių) skaičius taip pat. Skirtingais laiko kiekis (24, 48, 72, 96 h), 25 pL 5,0 mg /ml sterilaus filtruojamas 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5- difenil tetrazolio bromidas (MTT; Sigma) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį. Nesureagavęs dažų buvo pašalintas po to 4 h inkubacijos, ir netirpių formazano kristalai buvo ištirpinta 100 pL dimetilsulfoksido (DMSO). Absorbcija esant 570 nm bangos ilgiui (nuoroda bangos, 630 nm) buvo matuojamas sinergija II daugiamodėmis mikroplokštelės skaitytojui (BioTech priemonių, VT).

Radioaktyviųjų jodidas įsisavinimas tyrimas

Jei nustatyti ryšį tarp jodido santykius įsisavinimas ir ląstelių skaičius, praskiedimo serijos ląstelių buvo pasėta į 24-duobučių lėkštelėse. Po 12 h inkubacijos ^{131I įsisavinimas lygis buvo nagrinėjama. Jodidas įsisavinimas lėmė inkubacijai ląsteles su 500 iL Hanks subalansuotą druskos tirpalo (HBSS), kuriame 0,5% galvijų serumo albumino 37 kBq nuo nešančiųjų be Na 131I ir 10 mm NaI 30 min. Po inkubacijos ląstelės buvo plaunamas du kartus taip greitai, kaip įmanoma su 1 ml ledinio HBSS buferio. Ląstelės buvo individualus su 200 pL tripsino, ir radioaktyvumas buvo matuojamas naudojant gama skaitiklis (Perkin-Elmer). Įvertinti funkcinę išraišką hNIS į reporteris genų sistema, NF-3xmir16 ląstelės buvo išsėjamos 1 × 10 5 ląstelių viename gerai 24 šulinėlių plokštelės dieną prieš transfekciją, tada Mirna-16 ir NC oligos buvo pernešta , 24 val vėliau, jodidas įsisavinimas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau.}

in vitro
Bioluminescence vaizdo tyrimas

Jei nustatyti ryšį tarp liuminescencinėmis signalų ir ląstelių skaičių santykius, praskiedimo serija ląstelių buvo inokuliuojamas į 24-duobučių lėkštelėse. Po to, kai 12 h inkubacijos, kiekvieną šulinėlį plautas su fosfato-beffered tirpalo (PBS). Tada D-Luciferin (Xenogen) po 0,5 mmol /L koncentracijos buvo įtraukta iš karto prieš tyrimą. Bioluminescence buvo matuojamas IVIS 100 vizualizavimo sistema (Xenogen) ir analizuojami naudojant gyvu programinės įrangos versija 2.50 (Xenogen). Įvertinti funkcinę išraišką Fluc į reporteris genų sistema, NF-3xmir16 ląstelės buvo išsėjamos 1 × 10 ^{5 ląstelių viename gerai 24 šulinėlių plokštelės dieną prieš transfekciją, tada Mirna-16 ir NC oligos buvo pernešta , 24 val vėliau, Bioluminescence tyrimas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau.}

Bioluminescent ir 99mTc-pertechnetatui vaizdo nuogas Pelės

lygių skaičių (5 × 10 ^{6 ląstelių), iš NF-tuščia ir NF-3xmir16 arba NF-3xmir16 /VCR ir NF-3xmir16 ląstelės, buvo xenografted po oda į kairę ir į dešinę užpakalinės šono kiekvieną nuogas pele kaip nurodyta rezultatus. Bioluminescent vaizdo įsigijo vieną dieną po to, kai ląstelių injekcija. Visos pelės buvo anestezuoti 2,5% izoflurano dujų deguonies, mažiausiai 1,5 L /min srauto. Vandeninis tirpalas D-luciferine (150 mg /kg kūno svorio) buvo suleista perkutaninės 10 min prieš atvaizdavimas. Visą kūną vaizdus Fluc signalų įsigijo 2 min ir gyvenimo Vaizdo programinė įranga (Xenogen) lakstė gauti Bioluminescent vaizdų. IG buvo pasirinktas rankiniu signalo intensyvumo. Bioluminescence signalai išreikštas fotonų per sekundę viename kubiniame centimetre steradianui (P /SEC /cm, 2 /sr) per IG.}

branduolinės vaizdavimo, naviko guolio pelėms buvo pilvaplėvės ertmę suleista su 18,5 MBq nuo ^{99mTc-pertechnetatui ne 2weeks po ląstelių injekcija. 30 min po injekcijos, gyvūnas buvo perkeltas į skaičiuoklę-gulint ant SPECT skaitytuvas (Symbia T2 "," Siemens) lova. Anestezija buvo atliktas su 1% -2% izofluranas 100% O _{2 įpurškimo ir vaizdavimo metu. Visos nuotraukos buvo rekonstruotas su 2-dimensional užsakytos-subpopuliacijomis lūkesčių didžiausią algoritmas. Aktyvumas buvo įvertintas peržiūrėję interesų (IG) į navikus ir ROI srityje regionus buvo išlaikoma pastovi visiems branduolinių ir optinių vaizdų. Po Bioluminescent ir 99mTc-pertechnetatui vaizdavimo, augliai buvo surinkti ir pasverti.}}

Statistinė analizė

Rezultatai pateikti kaip vidurkis ± SD. Duomenų, rodančių, palyginti tarp dviejų grupių buvo vertinami naudojant Stjudento t-testą. Palyginimai tarp daugiau nei dviejų grupių buvo vertinami naudojant dispersinės analizės (ANOVA) su atitinkamu posthoc bandymai. P vertes. ≪ 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

steigimas skrandžio vėžio ląstelių linijų stabiliai išreiškė hNIS ir Fluc genus

Jei generuoti sintezės reporteris geną (GV260- hNIS /Fluc, į NF-tuščias nurodyta), hNIS kDNR buvo klonuotas į lentiviruso vektoriaus (GV260-Fluc-puro), koduojančio Fluc geną generuoti sulietą baltymą, kuris buvo pagal ubikvitino promotoriaus kontrolės. Tada trys kopijos papildomų sekų prieš Mirna-16 (3xmir16) buvo įdėta po stop kodono hNIS /Fluc sintezės geno generuoti kitą konstruktą (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, nurodyta NF-3xmir16) (1a pav.) Plakta nukleotidų seka panašaus ilgio 3xmir16 taip pat buvo įterptas hNIS /Fluc sintezės geno 3'UTR srities gauti kontrolės konstruktą (GV260-hNIS /Fluc-peštynės, nurodyta NF-peštynės). in vitro
Bioluminescence vaizdo parodė, kad Fluc genų aktyvumas nuo NF-tuščių langelių buvo panašus į tą, nuo NF-plaktai ląstelių (S1A pav). Taigi, mes pasirinkti NF-tuščias konstruktą tolesnio tyrimo. Dvi ląstelių linijas, MDR žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija SGC7901 /VCR ir jo tėvų ląstelių linija SGC7901 buvo transdukuojamos su lentiviruso, kuriame NF-tuščia arba NF-3xmir16 geną atitinkamai nustatyti trys stabilios ląstelių linijos NF-tuščią /SGC7901 NF -3xmir16 /SGC7901 ir NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (prie NF-tuščią, NF-3xmir16 ir NF-3xmir16 /VCR nurodyta). Pirmiausia mes atliekame MTT išmatuoti augimo tempus šių trijų ląstelių linijas (S1B pav). Tada mes vykdomąjį qPCR tyrimą ištirti integruotas kopijas reporteris stato į tris ląstelių linijas (S1C pav). in vitro
Bioluminescence tomografijos (1B pav) ir Imunoblotingo (1c pav) buvo toliau atliekami siekiant įrodyti sėkmingą išraišką Fluc ir hNIS genų šių trijų ląstelių linijų.

Tiesinė koreliacija Fluc ir hNIS transgenui veikla su ląstelių skaičių in vitro pervežimas pervežimas

Norint įvertinti Fluc ir hNIS transgenui veikla ląsteles, mes atliekame in vitro pervežimas Bioluminescence vaizdo ir ^{131I radioiodide Panaudotų tyrimai skiedimo serijos NF-3xmir16 ląstelių linijų. Kaip parodyta 1D paveiksle, pagal padidinimo, ląstelių skaičiaus, liuminescencijos kaupimo taip pat padidėjo. buvo rasta Bioluminescence signalai gerai koreliuoja su ląstelių skaičių (γ 2 = 0.9990) (1E pav.) Tuo tarpu, 131I įsisavinimas taip pat buvo padidintas ląstelių skaičių (1f pav). Radioiodide įsisavinimas buvo pastebėta koreliacija (γ 2 = 0,9543) su ląstelių skaičių (1g pav). Kadangi Fluc buvo susilieję su hNIS, gerai koreliacija tarp Bioluminescence intensyvumo ir 131I radioaktyvumas buvo pažymėta ląstelių pagal tiesinės regresijos analizę (γ 2 = 0,9339) (1H pav.)}

patvirtinimas Mirna 16 veikla per
žurnalistė genų sistemos

siekiant patikrinti, ar NF-3xmir16 reporteris vektorius, kurių sudėtyje yra Mirna-16 tikslinės sekas buvo represuoti iki egzogeninės Mirna-16, mes išnagrinėjome Fluc ir hNIS veikla įvedus Mirna-16. Palyginti su ląstelių transfektuotose NC oligos, The Bioluminescence signalas sumažėjo 35% ląstelių transfektuotose Mirna-16 (2a pav ir 2B). Ir ^{131I radioiodide įsisavinimas Mirna-16 perkeltų ląstelių buvo maždaug 70%, kad NC perkeltų ląstelių kiekybiniai radioaktyviosiomis skaičiavimo (2C pav.) Ir Fluc ir hNIS veikla buvo sumažėjo priklausomai nuo dozės (pav S1D-F). Šie duomenys rodo, kad NF-3xmir16 reporteris konstruktas gali būti koreguojamos pagal Mirna-16.}

aptikimas endogeninio Mirna-16 išraiška in vitro parsisiųsti ir vivo

Jei aptikti vidinius Mirna-16 raiškos lygis skrandžio vėžio ląstelių in vitro
, lygios numeriai (1 × 10 ^{6) NF-tuščia, ir NF-3xmir16 ląstelės buvo sėklomis ir tada buvo išnagrinėtas Fluc ir hNIS veikla. Kaip parodyta 2D paveiksle 2E, Fluc veikla atsiranda NF-3xmir16 ląstelių sumažėjo apie 50% endogeninio Mirna-16, palyginti su iš NF-tuščių langelių. Ir hNIS veikla iš NF-3xmir16 ląstelių, taip pat buvo sumažintas maždaug 40%, reaguojant į endogeninio Mirna-16, priešingai, kad nuo NF-tuščių langelių (2f paveikslą). Iš represijų Fluc arba hNIS veiklą pastebėtas NF-tuščių ląstelių stoka yra pagarba, kad nėra Mirna-16 tikslinės svetainių NF tuščias konstruktą.}

dvigubas vaizdo reporterio genų sistema leido in vivo
vizualizacija endogeninio Mirna-16 raiškos skrandžio vėžio ląsteles. Lygios numeriai (1 × 10 ^{7) NF-tuščių ir NF-3xmir16 ląstelės buvo xenografted po oda į kairę ir į dešinę užpakalinių sparnų kiekvieno nuogas pele (n = 6) ir tada Bioluminescent vaizdo ir 99mTc-pertechnetatui gama kamera vaizdo įgijote. Kaip parodyta 2G figūra, liuminescencine intensyvumą nuo implantuotų NF-3xmir16 ląstelės buvo apie 55% mažesnė, nei NF-tuščių langelių, panašiai už liuciferazės veiklą skirtumas, matuojant in vitro
(2D pav ir 2E). Po injekciją į pilvą iš 99mTc-pertechnetato ne 18,5 MBq, gama kamera vaizdo buvo atliktas. Skirtingai NF-tuščias auglių, kurie parodė pastebimą įsisavinimą 99mTc-pertechnetatui NF-3xmir16 navikai parodė nežymų įsisavinimą (2H paveikslas) rodo, endogeninė Mirna-16 sumažino hNIS išraiška. Fiziologinis įsisavinimą taip pat buvo pastebėta skydliaukės, skrandžio ir šlapimo pūslės, kurioje hNIS yra paprastai išreiškiami vietų. Regionai objektai (IG) analizė parodė, kad hNIS veikla ženkliai sumažėjo NF-3xmir16 audiniuose, palyginti su, kad NF-tuščių audiniuose, (2H pav). Po vaizdo, mes surinkti ir pasverti NF-tušti ir NF-3xmir16 navikai (S1G pav.) Rezultatai parodė, jie turėjo tuos pačius svorius, nurodė, kad signalo intensyvumo skirtumai yra iš tikrųjų, nes endogeninio Mirna-16 funkciją, bet ne ląstelių skaičių.}

Vizualizacija iš Mirna-16 raiškos kaitos MDR skrandžio vėžio ląstelių in vitro parsisiųsti ir vivo

buvo aptikta Mirna-16 išraiška pokytis vaistų atsparių skrandžio vėžio ląsteles, per Viesbutis The Fluc ir hNIS veiklos pagal Bioluminescence vaizdo ir ^{131I radioiodide Panaudotų tyrimai. Tiek Fluc veikla (3A pav ir 3B) ir hNIS veikla (Fig.3C) padidėjo apie 1,5 karto didesnis, o NF-3xmir16 /VCR ląstelių, lyginant su kad NF-3xmir16 ląstelių, kurių matyti, kad Mirna-16 buvo downregulated į NF-3xmir16 /VCR ląstelės. Norėdami patikrinti gautus reporteris genų sistemos rezultatus, kiekybinė PGR (K-PGR) buvo atliktas analizuojant diferencialo išraišką Mirna-16 šių dviejų ląstelių linijų. Pagal reporteris genų sistemos duomenimis, "Q-PGR parodė sumažėjo Mirna-16 lygių NF-3xmir16 /VCR palyginti su jo kolega NF-3xmir16 ląstelės (3D pav.)}

neinvazinę kiekybinio stebėjimo miRNA- 16 skirtumas išraiška MDR skrandžio vėžio ląstelių vivo, pervežimas, Bioluminescent vaizdavimo ir ^{buvo atliekama 99mTc-pertechnetatui gama kamera vaizdo. Bioluminescent vaizdo parodė, kad liuminescensinės signalai buvo apie 1,7 kartus padidėja NF-3xmir16 /VCR audiniuose, palyginti su NF-3xmir16 audiniuose, (3e paveikslas), kad vadovaujantis liuciferazės veiklos didėja išmatuotų in vitro
(3A pav ir 3B). Iš 99mTc-pertechnetato įpurškimo ir gama kamera vaizdo įsigijimo nurodė, kad žymiai didesnis kaupimas 99mTc-pertechnetato buvo pastebėtas NF-3xmir16 /VCR audiniuose, negu NF-3xmir16 audiniuose,. Fiziologinis 99mTc-pertechnetatui sankaupos taip pat buvo pastebėta skydliaukės, šlapimo pūslės ir skrandžio (3f pav). Ir NF-3xmir16 ir NF-3xmir16 /VCR navikai turėjo tuos pačius svorius (S1H pav.)}

VP-16 ir 5-FU ląstelę Mirna-16 raiškos noninvasively įamžintas dvejopo reporteris genų sistemos

Norėdami nustatyti, ar kiti priešvėžiniai vaistai gali keisti Mirna-16 išraiška profilį, penki klinikiniai vaistai skrandžio vėžio buvo įtraukta į NF-3xmir16 ląstelių po in vitro pervežimas Bioluminescence vaizdo ir ^{131I radioiodide įsisavinimą tyrimai. Rezultatai parodė, kad liuminescencija intensyvumas (4A pav ir 4B) arba korinio ryšio jodidas įsisavinimas (4E pav) buvo žymiai sumažėja poveikį VP-16, 5-FU ir CDDP, bet ne MMC ir gydymo ADR, lyginant su tais nontreated ląstelių.}

dėl sumažėjusio signalas stebimas VP-16, 5-FU ir CDDP gydymo priežastys gali būti, kad narkotikai aktyvuotos endogeninė Mirna-16 išraiška ar slopino ląstelių augimą net sukelia ląstelių žūtį. Norėdami pašalinti pastarąją galimybę, penki vaistai buvo įtraukta į NF-tuščių langelių, kuriuose yra ne Mirna-16 tikslines svetaines konstrukto. in vitro
Bioluminescence vizualizavimo rezultatai parodė, kad tik VP-16 ir 5-FU neturėjo slopinamąjį poveikį liuminescencine intensyvumo, o CDDP dar sumažino liuminescensinės signalą (4c ir 4d pav), nurodant, kad CDDP gali slopinti ląstelių augimas, o ne aktyvinti vidinį Mirna-16 išraiška. Kita vertus, MMC ir ADR buvo nustatyta, kad šiek tiek padidinti liuminescencijos intensyvumas abiem NF-3xmir16 ir NF-tuščių langelių (pav 4A-D), kuris gali atsirasti skatinti ląstelių proliferaciją.

Norėdami patikrinti, ar Mirna-16 aktyvacijos dalyvavo į vėžio poveikį iš VP-16 ir 5-FU, Q-PGR buvo atliekama siekiant nustatyti Mirna-16 lygį NF-3xmir16 ląstelių poveikio vaistų nuo vėžio gydymas. Todėl Mirna-16 išraiška buvo žymiai aktyvinama po VP-16 arba 5-FU variantuose SGC7901 ląstelių, palyginti su neapdorotų kontrolinių ląstelių, o MMC, ADR ir CDDP turėjo nedidelį poveikį Mirna-16 raiškos (4F pav.)

Padidėjęs Mirna-16 užrašai VP-16 ir 5-FU dalyvauja p38 MAPK bet NF-κB signalizacijos kelią

panašus į baltymų kodavimo RNR genų moduliacijos, transkripcija Mirna genų, atrodo, reglamentuoja kelių signalizacijos būdus. Aktyvinimas NF-κB arba MAPK signalo perdavimo kelių yra dažna reakcija po chemoterapinių vaistų [17], [18]. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad ląstelę Mirna-16 gali būti padidėjusio NF-κB arba MAPK aktyvavimo rezultatas po VP-16 arba 5-FU gydymą. Norėdami išsiaiškinti šių signalų kelius vaidmenį VP-16 ir 5-FU sukeltas transactivation iš Mirna-16, mes pirmą kartą išmatavo liuminescencijos intensyvumas NF-3xmir16 ląstelių atsakas į VP-16 ir 5-FU buvimą ar nebuvimą Farmacijos pramonė inhibitoriais į NF-κB ar p38 MAPK. Gydymas ląstelių, turinčių tam tikrą NF-κB inhibitoriaus, Bay 11-7082, neturėjo įtakos liuminescencine signalo poveikį, palyginti su narkotikų paveiktų ląstelių be inhibitorių (S2 pav).

Priešingai, gydymas su konkrečiu p38 MAPK inhibitorius, SB203850, labai gelbėjo į švytėjimą (5a pav ir 5B) arba jodido įsisavinimą (5c pav) sumažėjimą VP-16 ir 5-FU, palyginti su gydytų kontrolinių ląstelių. Norėdami patvirtinti Mirna-16 išraiška lygį nuo SB203850 akivaizdoje, realaus laiko PGR buvo atliekama ir rezultatai parodė, kad slopinantis nuo p38 MAPK drastiškai slopino tik VP-16 ir 5-FU sukeltas Mirna-16 ląstelę (5D paveikslas) rodo, kad padidėjęs Mirna-16 išraiška VP-16 ir 5-FU dalyvauja p38 MAPK signalizacijos kelią.

Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad BCL-2 baltymai yra tiesioginis taikinys genas Mirna-16 plėtros MDR į SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių [11]. Norėdami patikrinti, ar BCL-2 dalyvauja VP-16 ir 5-FU stimuliacija Mirna-16 per pervežimas p38 MAPK keliu, nustatėme, BCL-2 baltymų lygį pagal Vakarų dėmė analizė. Kaip parodyta 5E pav ir 5F, VP-16 ir 5-FU žymiai sumažėjo Bcl-2 baltymų lygį, apie 50%, palyginti su kai nedengtų kontrolės ląsteles SB203850 nesant. Po gydymo kartu su SB203850, iš BCL-2 baltymų sumažėjimu buvo drastiškai susilpnintas, o tai rodo, kad p38 MAPK aktyvavimo svarbą VP-16 ir 5-FU sukeltas downregulation iš BCL-2 baltymų.

in vivo
stebėjimo sustiprinto Mirna-16 raiškos VP-16 ir 5-FU

neinvazinę stebėjimo sustiprinto Mirna-16 raiškos sukeltos VP-16 ir 5-FU, NF-tuščia ir NF -3xmir16 ląstelės buvo įskiepyta ant kairės ir dešinės hindlimb kiekvieno pelės (n = 6), atitinkamai. Siekiant išvengti Bioluminescence signalą iš NF-tuščias kištis, kad nuo NF-3xmir16 į narkotikų gydymo kursą, su skirtingais numeriais NF-tušti (1 × 10 ^{5 ląstelės) ir NF-3xmir16 (1 × 10 7 ląstelės), buvo skiepijami. Kaip parodyta 6 paveiksle, gerokai sumažintas Bioluminescence intensyvumas buvo stebimas NF-3xmir16 audiniuose, po VP-16 arba 5-FU gydymui, palyginus su nontreatment. Visų pirma, pelių, vartojusių VP-16 Bioluminescence signalas sumažinta maždaug 40% per NF-3xmir16 audiniuose, o šiek tiek padidėjo NF-tuščių audiniuose, palyginti gydytiems vaizdų (6a pav ir 6b), panašiai už liuminescencijos intensyvumo skirtumas sukelia VP-16 in vitro
(pav 4A-D).}

• PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p veikia kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio ir reglamentuoja DNR Methylation
• PLoS ONE: Asociacija tarp glutationas S-transferazės T1 Null genotipą ir skrandžio vėžio rizika: metaanalizė 48 Studies