PLOS ONE: Visualisation des microARN-Noninvasive 16 dans la chimiorésistance du cancer gastrique L'utilisation d'un double Reporter Gene Imaging System

Résumé

microARN (miARN) ont été impliqués à jouer un rôle central dans le développement de la résistance aux médicaments dans une variété de tumeurs malignes. Cependant, de nombreuses études ont été menées à la in vitro
niveau et ne pouvait pas fournir le in vivo
informations sur les fonctions de miARN dans la résistance aux médicaments anticancéreux. Ici, nous avons introduit un système à double gène rapporteur d'imagerie pour surveiller de manière non invasive l'expression cinétique des miRNA-16 au cours de la chimiorésistance dans le cancer gastrique à la fois in vitro
et in vivo
. étaient liés humain symporteur d'iodure de sodium (HNIs) et la luciférase de luciole (Fluc) gènes pour former HNIs /gène à double Fluc fusion rapporteur, puis générer la lignée cellulaire de cancer gastrique humaine NF-3xmir16 et sa lignée cellulaire de multirésistance NF-3xmir16 /VCR. Iode radioactif absorption et signaux de luminescence Fluc in vitro
bien corrélé avec le nombre de cellules viables. Les activités de la luciférase et l'absorption dans l'iode radioactif NF-3xmir16 cellules ont été remarquablement réprimée par exogène ou endogène miRNA-16. Le NF-3xmir16 /cellules du magnétoscope a montré une augmentation significative de ^{131I absorption et de luminescence intensité par rapport à la norme NF-3xmir16 cellules. La radioactivité de in vivo
99mTc-pertechnétate imagerie et l'intensité de l'imagerie par bioluminescence ont été également augmentée dans la norme NF-3xmir16 /VCR par rapport à celle dans les xénogreffes tumorales NF-3xmir16. En outre, en utilisant ce système de gène rapporteur, nous avons constaté que l'étoposide (VP-16) et le 5-fluorouracile (5-FU) activé miRNA-16 expression in vitro
et in vivo
et la régulation positive de miARN-16 est p38MAPK dépendante mais NF-kB indépendant. Ce gène rapporteur d'imagerie double peut être servi comme un nouvel outil pour vivo
imagerie dans des microARN dans la chimiorésistance des cancers, ainsi que pour la détection précoce et le diagnostic clinique}

Citation:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Visualisation des microARN-Noninvasive 16 dans la chimiorésistance du cancer gastrique L'utilisation d'un système d'imagerie Gene double Reporter. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

Editeur: Javier S. Castresana, Université de Navarre, en Espagne

Reçu: 21 Novembre 2012; Accepté 13 Mars 2013; Publié: 17 Avril 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par le Programme du Programme national de recherche fondamentale et le développement de la Chine (973) sous Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, la national Natural science Foundation de la Chine sous Grant n. 81090272, 81090274, 81227901, équipe innovation Grant développement par le Département de la Chine de l'éducation (2010CXTD01), 863 Programme de Chine (2012AA02A603) et le Programme national de soutien Key Technology en vertu Grant No. 2012BAI23B06. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:. Co-auteur Xiaoyuan Chen sert un éditeur pour ce journal. Cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à tous les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

Le cancer gastrique Introduction reste la première cause de décès par cancer en Chine et le quatrième plus commun tumeur maligne dans le monde entier, malgré une diminution spectaculaire de la mortalité et de morbidité au cours des trois dernières décennies [1]. La chimiothérapie a été largement utilisé pour traiter à la fois le cancer gastrique résécable et avancé, ce qui conduit à des améliorations dans la survie globale, ainsi que la qualité de vie des patients [2], [3]. Cependant, une chimiothérapie à long terme ne parvient souvent à éliminer toutes les cellules tumorales en raison de la multirésistance intrinsèque ou acquise (MDR), qui est la principale cause principale de récurrence de la tumeur [4]. À l'heure actuelle, le MDR a été considéré comme un phénomène multifactoriel impliquant plusieurs mécanismes principaux, y compris l'augmentation du métabolisme des médicaments, l'absorption de médicaments solubles dans l'eau a diminué, des cibles de médicaments modifiés, réduit la concentration intracellulaire du médicament par des pompes à efflux, modifié les points de contrôle du cycle cellulaire et d'urgence induite gènes de réponse à altérer les voies apoptotiques, etc
[5]. Bien que les mécanismes du MDR ont été largement explorés, les principaux déterminants de ce phénomène restent largement incertaine.

Les microARN (miARN) sont une nouvelle classe de endogènes petits ARN non codantes (19-23 nucléotides) qui régulent négativement l'expression des gènes au le niveau post-transcriptionnel par appariement de bases parfaite ou imparfaite avec la région 3 'non traduite (UTR) des ARNm cibles et ainsi induire la dégradation des ARNm ou traduction répression [6]. À l'heure actuelle, les études émergentes ont suggéré l'existence et l'importance des miARN dans l'évolution de la résistance aux médicaments anticancéreux et miARN profilage de l'expression peut être corrélée avec le développement de la résistance aux médicaments [7] - [10], ce qui indique que la forme de la résistance aux médicaments miARN médiée ajoute un autre mécanisme de MDR. Dans notre étude précédente, il a été signalé que deux miARN, miRNA-15b et miARN-16, ont été exprimés de manière différentielle dans une ligne gastrique humaine multirésistante cellule cancéreuse SGC7901 /magnétoscope et sa lignée cellulaire parentale SGC7901 [11]. Cependant, elle a été menée uniquement à la in vitro
niveau et pourrait ne pas refléter les de l'information in vivo
sur les fonctions de miARN dans la résistance aux médicaments anticancéreux.

Les progrès récents dans les techniques d'imagerie moléculaire permet la visualisation non invasive des processus cellulaires normaux et anormaux chez les sujets vivant au niveau moléculaire plutôt que au niveau anatomique [12]. Plusieurs stratégies non invasives, telles que l'utilisation d'une protéine fluorescente, le gène rapporteur de la luciférase, aptamère nucléoline ou fluorescent balise moléculaire nanoparticule conjuguée, ont été développés pour surveiller les profils d'expression des différents miRNAs pendant la cancérogenèse, neurogenèse ou myogenesis in vitro
et in vivo
[13] - [16]. La présente étude a été d'introduire une méthode non invasive pour le suivi de miARN-16 dans la chimiorésistance du cancer gastrique par un système de gène rapporteur d'imagerie double dans laquelle l'iodure de sodium humaine symporteur (HNIs) et la luciférase de luciole étaient liées à un gène de fusion (USLC) gènes imagerie par bioluminescence et ^{gamma caméra imagerie 99mTc-pertechnétate in vivo
.}

Matériel et méthodes

Animaux

spécifique de 8 semaines sans pathogène -old souris femelles /c nude BALB ont été obtenus à partir du centre des animaux Shanghai en Chine et élevés dans le centre des animaux Université médicale quatrième militaire, la Chine. Tous les animaux de laboratoire ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Les protocoles d'animaux utilisés dans cette étude ont été approuvées par le Comité d'éthique Quatrième Université médicale militaire. Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la quatrième Guide Université médicale militaire pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire formulées par la Société nationale pour la recherche médicale.

Réactifs et anticorps

Souris anticorps monoclonal contre HNIs (ab17795) a été acheté auprès de Abcam. Anticorps polyclonal de lapin spécifique à la protéine Bcl-2 a été acheté chez Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (inhibiteur de NF-kB) et SB203580 (inhibiteur de la MAPK p38) ont été obtenus à partir de Beyotime Institut de biotechnologie (Shanghai, Chine). Les médicaments anticancéreux dont la vincristine (VCR), l'étoposide (VP-16), la mitomycine C (MMC), le cisplatine (CDDP), le 5-fluorouracile (5-FU) et l'Adriamycine (ADR) ont été achetés chez Wolsen Biotechnology (Xi'an, Chine). Le lentivirus plasmide GV260-Fluc-puro a été obtenu à partir de Shanghai GeneChem Company (Shanghai, Chine). Tous les milieux de culture cellulaire et le sérum ont été achetés chez Gibco (Grand Island, NY).

double gène plasmide rapporteur construire

La séquence codante du gène HNIs a été amplifié par PCR à partir d'un plasmide aimablement fourni par Dr. Weidong Yang (quatrième Université médicale militaire, Chine) en utilisant les amorces suivantes:

HNIs-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

HNIs-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

Pour la construction d'un vecteur d'expression double, l'ADNc du gène HNIs a été inséré dans le BamH
I et les sites Age
I d'enzyme de restriction d'un vecteur lentiviral GV260 -Fluc-puro (Shanghai Genechem Chine) qui code pour un gène Fluc sous le contrôle du promoteur de l'ubiquitine. La double construction d'expression GV260-HNIs /Fluc résultant a été en outre utilisé pour générer GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 plasmide. Trois copies de séquences complémentaires contre miRNA-16 (3xmir16) ont été insérés après le codon d'arrêt du gène de fusion HNIs /Fluc pour générer GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 (figure 1A). Une séquence nucléotidique brouillée d'une longueur similaire à 3xmir16 a également été inséré à la 3'UTR du gène de fusion HNIs /Fluc pour obtenir un produit d'assemblage de commande (GV260-HNIs /Fluc-bousculade. La séquence 3xmir16 de séquence ou bousculade ont été obtenus par hybridation des oligonucléotides suivants :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev:

culture de cellules de cancer gastrique et stable génération de la lignée cellulaire

lignée cellulaire de cancer gastrique humain
5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA SGC7901 et son multirésistante variante SGC7901 /VCR (établie et maintenue dans notre laboratoire comme décrit précédemment [11]) ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de sérum de veau foetal et 100 unités de pénicilline et 100 pg /ml de streptomycine (Invitrogen ). Pour maintenir le phénotype MDR, la vincristine (avec une concentration finale de 1 pg /ml) a été ajouté au milieu de culture pour les cellules SGC7901 /VCR. Pour générer une lignée cellulaire stable, vecteur lentivirus GV260-HNIs /Fluc ou GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 a été cotransfecté dans des cellules 293T avec emballage plasmides ( gag, pol, VSV-g
). Le milieu de croissance a été changé à 6 h post-transfection et surnageant contenant lentivirus a été récolté à 48 h post-transfection. Les surnageants récoltés sont centrifugés à 4000 g pendant 10 minutes pour sédimenter les débris cellulaires. virus concentré a été titré sur des cellules 293T. SGC7901 et les cellules SGC7901 /VCR ont été transduites avec GV260-HNIs /Fluc et le virus GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 respectivement à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Ensuite, les cellules ont été criblés avec la puromycine pendant 3 semaines et les colonies cellulaires étaient recueillies pour élargi en vue des prochaines expériences étape

oligos ARN et transfection

Le contrôle miRNA-16 et négatif (NC) oligos d'ARN ont été synthétisés (Shanghai GenePharma, Chine) en utilisant les séquences suivantes.:

miRNA-16 sens: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sens: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC sens: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sens: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Avant la transfection, SGCC7901 cellules ont été ensemencées à 1 × 10 ^{5 cellules par puits dans un plaque de 24 puits et de croître pendant 24 h. La transfection a été effectuée avec le réactif Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. Tout transfection ont été effectuées en triple.}

quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)

ARN total a été isolé à partir des cellules cultivées en utilisant du Trizol (Invitrogen). RT a été réalisée avec PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japon) et qPCR a été réalisée avec Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) et ABI StepOne De plus le système PCR en temps réel (Applied Biosystems) selon le protocole du fabricant . Les produits de PCR ont été analysés sur des gels à 3% d'agarose. La quantité relative de miARN-16 a été normalisé à U6 snRNA. Et la quantité relative de Fluc a été normalisée au gène GAPDH. Le facteur de variation pour les miARN-16 ou Fluc gène du groupe expérimental par rapport au groupe de contrôle a été calculé en utilisant la 2 ^{-ΔΔCt méthode, où ΔΔCt = ACt expérience - le contrôle ACt et ACt = Ct miRNA - Ct U6 ou ACt = Fluc CT - CT GAPDH. La PCR a été réalisée en triple. Les amorces utilisées pour tige-boucle RT-PCR pour miR-16 sont répertoriés comme suit:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '

miR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot analyse

SGC7901 cellules ont été lavées trois fois avec du PBS puis lysées dans un tampon de lyse froid (20 mM de NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1% de Triton X-100 et 1% aprotinine) pendant 30 min sur de la glace. Les lysats cellulaires ont ensuite été centrifugés à 12000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant a été recueilli et des quantités identiques de protéines ont été résolues par 8% de SDS-PAGE, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été incubées dans une solution de blocage contenant 5% de BSA pendant 1 h à température ambiante, puis un immunoblot avec des anticorps indiqués. Les bandes immunoréactives ont été visualisées en utilisant un kit de chimioluminescence amélioré (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

test MTT

Pour déterminer les taux de NF-vide croissance, NF-3xmir16 et NF-3xmir16 /cellules du magnétoscope, ces trois types de cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits avec les mêmes numéros (5.000 cellules) par puits. À des moments différents (24, 48, 72, 96 h), 25 pi de 5,0 mg /ml, filtré 3- (4, 5-diméthylthiazol-2-yl) stérile -2, 5- diphényl tétrazolium (MTT, Sigma) on a ajouté à chaque puits. Le colorant qui n'a pas réagi a été éliminé au bout de 4 heures d'incubation, et les cristaux de formazan insolubles ont été dissous dans 100 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). L'absorbance à 570 nm (longueur d'onde de référence, 630 nm) a été mesurée avec un Synergy II lecteur multimode de microplaques (BioTech Instruments, VT).

absorption d'iodure radioactif test

Pour identifier la relation entre l'iodure l'absorption et le numéro de cellule, une série de dilutions de cellules ont été inoculées dans des plaques à 24 puits. Après 12 heures d'incubation, le taux d'absorption ^{131I a été examinée. L'absorption d'iodure a été déterminée par incubation des cellules avec une solution saline équilibrée de 500 ul de Hanks (HBSS) contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin avec 37 kBq de Na sans support 131I mM et du Nal 10 pendant 30 min. Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois plus rapidement possible avec 1 ml de tampon HBSS glacée. Les cellules ont été décollées à la trypsine 200 ul, et la radioactivité a été mesurée en utilisant un compteur γ-(Perkin-Elmer). Pour évaluer l'expression fonctionnelle de HNIs dans le système de gène rapporteur, les cellules NF-3xmir16 ont été ensemencées dans à 1 × 10 5 cellules par puits dans une plaque de 24 puits le jour avant la transfection, puis miRNA-16 et NC oligos ont été transfectées . 24 h plus tard, l'absorption de l'iodure ont été mesurés comme décrit ci-dessus.}

in vitro
imagerie par bioluminescence dosage

Pour identifier la relation entre les signaux de luminescence et les nombres de cellules, une série de dilutions des cellules ont été inoculées dans des plaques à 24 puits. Après 12 h d'incubation, chaque puits a été lavé avec une solution saline au phosphate beffered (PBS). Ensuite, D-luciférine (Xenogen) à une concentration de 0,5 mmol /L a été ajouté immédiatement avant le dosage. La bioluminescence a été mesurée à l'aide d'un système IVIS 100 Imaging (Xenogen) et analysé à l'aide de la version du logiciel Living Image 2.50 (Xenogen). Pour évaluer l'expression fonctionnelle de Fluc dans le système de gène rapporteur, les cellules NF-3xmir16 ont été ensemencées dans à 1 × 10 ^{5 cellules par puits dans une plaque de 24 puits le jour avant la transfection, puis miRNA-16 et NC oligos ont été transfectées . 24 h plus tard, le dosage de bioluminescence a été mesurée comme décrit ci-dessus.}

Bioluminescent et imagerie 99mTc-pertechnétate dans

Des nombres égaux de souris nude (5 x 10 ^{6 cellules) de NF-vide et NF-3xmir16 ou NF-3xmir16 /VCR et NF-3xmir16 cellules, étaient xénogreffe sous-cutanée dans le flanc arrière gauche et à droite de chaque souris nude comme indiqué dans les résultats. imagerie bioluminescente a été acquise un jour après l'injection de cellules. Toutes les souris ont été anesthésiées avec 2,5% d'isoflurane dans de l'oxygène gazeux à un débit de 1,5 L /min. Une solution aqueuse de D-luciférine (150 mg /kg de poids corporel) a été injectée par voie percutanée 10 minutes avant l'imagerie. Les images du corps entier pour les signaux Fluc ont été acquises pendant 2 min et vivre un logiciel d'image (Xenogen) a été en cours d'exécution pour obtenir des images bioluminescentes. Un retour sur investissement a été sélectionnée manuellement sur l'intensité du signal. signaux de bioluminescence sont exprimés sous forme de photons par seconde par centimètre cube par stéradian (p /sec /cm 2 /sr) au sein d'un retour sur investissement.}

Pour l'imagerie nucléaire, la souris porteuses de tumeurs ont été injecté par voie intraperitoneale avec 18,5 MBq de ^{99mTc-pertechnétate à deux semaines après l'injection de cellules. 30 minutes après l'injection, l'animal a été placé dans une position déployée en position couchée sur le lit du scanner SPECT (Symbia T2, Siemens). L'anesthésie a été réalisée avec 1% -2% d'isoflurane dans 100% O _{2 lors de l'injection et de l'imagerie. Toutes les images ont été reconstruites avec une sous-ensembles ordonnés attente algorithme maximal 2 dimensions. L'activité a été quantifiée en visualisant les régions d'intérêt (ROI) dans les tumeurs et dans la région de la ROI est maintenu constant pour toutes les images nucléaires et optiques. Après bioluminescente et imagerie 99mTc-pertechnétate, les tumeurs ont été recueillies et pesées.}}

L'analyse statistique

Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type. Les données montrant des comparaisons entre les deux groupes ont été évalués à l'aide du test t de Student. Des comparaisons entre plus de deux groupes ont été évalués en utilisant une analyse de variance (ANOVA) avec le test posthoc approprié. valeurs <P;. 0,05 ont été considérées comme statistiquement significative

Résultats

Création de lignes gastriques de cellules cancéreuses exprimant de manière stable et HNIs gènes Fluc

Pour générer un gène rapporteur de fusion (GV260- HNIs /Fluc, appelée NF-vide), l'HNIs ADNc a été cloné dans un vecteur lentivirus (GV260-Fluc-puro) codant pour un gène Fluc pour générer une protéine de fusion, qui était sous le contrôle du promoteur de l'ubiquitine. Ensuite, trois copies de séquences complémentaires contre miRNA-16 (3xmir16) ont été insérés après le codon d'arrêt du gène de fusion HNIs /Fluc pour générer une autre construction (GV260-HNIs /Fluc-3xmir16, appelée NF-3xmir16) (figure 1A). Une séquence nucléotidique brouillée de longueur similaire à 3xmir16 a également été inséré à la 3'UTR du gène de fusion HNIs /Fluc pour obtenir une construction de commande (GV260-HNIs /Fluc-scramble, appelée NF-scramble). in vitro
bioluminescence imagerie a montré que l'activité du gène Fluc à partir de cellules de NF-vides était similaire à celle des cellules de NF-brouillage (figure S1A). Donc, nous choisissons la construction NF-vide dans une étude plus approfondie. Deux lignées cellulaires, une MDR gastrique humaine lignée cellulaire de cancer SGC7901 /magnétoscope et sa lignée cellulaire parentale SGC7901, ont été transduites avec le lentivirus contenant le NF-vide ou d'un gène NF-3xmir16 respectivement à établir trois lignées cellulaires stables NF-vide /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 et NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (appelée NF-vide, NF-3xmir16 et NF-3xmir16 /VCR). Tout d'abord nous avons effectué un test MTT pour mesurer les taux de ces trois lignées cellulaires (Figure S1B) de croissance. Ensuite, nous perfomed test qPCR pour enquêter sur les copies intégrées de constructions rapporteurs dans les trois lignées cellulaires (Figure S1C). In vitro
bioluminescence imagerie (figure 1B) et Western blot (figure 1C) ont encore été réalisées pour démontrer l'expression réussie de gènes Fluc et HNIs dans ces trois lignées cellulaires.

Linéarité corrélation Fluc et les activités de transgène HNIs avec le nombre de cellules in vitro

Pour évaluer les activités de transgène Fluc et HNIs dans les cellules, nous avons réalisé in vitro
imagerie par bioluminescence et ^{131I iode radioactif dosages absorption dans une série de dilutions des lignées cellulaires de NF-3xmir16. Comme cela est représenté sur la figure 1D, en fonction des augmentations des nombres de cellules, l'accumulation de luminescence a également augmenté. signaux de bioluminescence ont été trouvés en bonne corrélation avec le nombre de cellules (γ 2 = 0,9990) (figure 1E). Pendant ce temps, 131I absorption a également augmenté avec le nombre de cellules (figure 1F). L'absorption de l'iode radioactif a été observé une bonne corrélation (γ 2 = 0,9543) avec le nombre de cellules (figure 1G). Étant donné que le Fluc a été fusionné avec HNIs une corrélation de puits entre l'intensité de la bioluminescence et 131I radioactivité a été notée dans les cellules en fonction de l'analyse de régression linéaire (γ 2 = 0,9339) (figure 1H).}

validation des miRNA-16 activités via
le système de gène rapporteur

afin de tester si le vecteur rapporteur NF-3xmir16 contenant miRNA-16 séquences cibles a été réprimée par exogène miRNA-16, nous avons examiné la Fluc et HNIs activité après l'introduction de miARN-16. Par rapport aux cellules transfectées avec des oligos NC, le signal de bioluminescence ont été réduites de 35% dans les cellules transfectées avec les miARN 16 (figure 2A et 2B). Et ^{131I iode radioactif absorption dans les miARN 16 cellules transfectées était d'environ 70% de celle dans les cellules transfectées CN quantifiées par comptage radioactif (figure 2C). Et l'activité Fluc et HNIs ont diminué d'une manière dépendant de la dose (figure S1D-F). Ces données indiquent que le NF-3xmir16 construction rapporteur pourrait être modulée par miRNA-16.}

Détection endogène miRNA-16 expression in vitro
et in vivo

Pour détecter le miRNA-16 niveau d'expression endogène dans les cellules de cancer gastrique in vitro
, un nombre égal (1 × 10 ^{6) de NF-vide et les cellules NF-3xmir16 ont été ensemencées puis l'activité Fluc et HNIs ont été examinés. Comme on le voit sur la figure 2D et 2E, l'activité Fluc résultant de NF-3xmir16 cellules a été diminuée d'environ 50% en 16 miARN endogènes par rapport à celle des cellules de NF-vides. Et l'activité des cellules HNIs NF-3xmir16 a également été réduite d'environ 40% en réponse à miARN endogènes 16 contrairement à celle des cellules de NF-vides (figure 2F). L'absence de répression des activités Fluc ou HNIs observées dans les cellules NF-vides est en ce qui concerne qu'il n'y avait pas de sites cibles miARN-16 dans NF-vide construction
.}

Le système de gène rapporteur d'imagerie double activé visualisation vivo
endogène expression miRNA-16 dans les cellules de cancer gastrique. Des nombres égaux (1 × 10 ^{7) des flancs arrières NF-vides et NF-3xmir16 cellules étaient xénogreffe sous-cutanée dans la gauche et à droite de chaque souris nude (n = 6), puis l'imagerie bioluminescente et 99mTc-pertechnétate caméra gamma d'imagerie ont été acquises. Comme on le voit à la figure 2G, l'intensité de la luminescence provenant implantés NF-3xmir16 cellules étaient d'environ 55% inférieur à celui des cellules de NF-vide, de manière similaire à la différence des activités de luciférase mesurée in vitro
(Figure 2D et 2E). Après l'injection intra-péritonéale de 99mTc-pertechnétate à 18,5 MBq, l'imagerie par gamma-caméra a été effectuée. Contrairement à NF-vide tumeurs, qui ont montré l'absorption importante de 99mTc-pertechnétate, NF-3xmir16 tumeurs a montré l'absorption négligeable (Figure 2H), indiquant endogène miRNA-16 réduit l'expression HNIs. l'absorption physiologique a également été observée au niveau des sites de la thyroïde, de l'estomac et de la vessie, dans laquelle HNIs est normalement exprimée. Régions d'intérêt (ROI) analyse ont montré que l'activité HNIs diminué de manière significative dans les xénogreffes NF-3xmir16 par rapport à celui de xénogreffes NF-vides (figure 2H). Après l'imagerie, nous avons recueilli et pesé les tumeurs NF-vides et NF-3xmir16 (Figure S1G). Les résultats ont montré qu'ils avaient les mêmes poids, ont indiqué que les différences d'intensité du signal sont en effet en raison de endogène fonction miRNA-16 mais pas la cellule numéros.}

Visualisation du changement d'expression de miARN-16 dans les cellules cancéreuses gastriques MDR in vitro
et in vivo

le changement d'expression de miARN-16 dans les cellules cancéreuses gastriques résistantes aux médicaments a été détectée via
l'activité Fluc et HNIs par imagerie par bioluminescence et ^{131I tests d'absorption. iode radioactif Les deux activités Fluc (Figure 3A et 3B) et l'activité HNIs (figure 3C) a augmenté d'environ 1,5 fois dans les cellules NF-3xmir16 /magnétoscope par rapport à celui de NF-3xmir16 cellules, qui a suggéré que miRNA-16 a été downregulated dans NF-3xmir16 /cellules du magnétoscope. Pour vérifier que les résultats obtenus par le système de gène rapporteur, RT-PCR quantitative (Q-PCR) a été réalisée à l'analyse de l'expression différentielle de 16 miARN dans ces deux lignées cellulaires. En conformité avec les données du système de gène rapporteur, Q-PCR a montré une diminution de miARN-16 niveaux dans NF-3xmir16 /VCR par rapport à son homologue NF-3xmir16 cellules (Figure 3D).}

Pour la surveillance quantitative non invasive de miRNA- expression 16 différentielle dans MDR cellules cancéreuses gastriques dans vivo
, imagerie bioluminescente et ^{gamma caméra imagerie 99mTc-pertechnétate ont été réalisées. L'imagerie bioluminescente a démontré que les signaux de luminescence étaient environ 1,7 fois dans les augmentations xénogreffes NF-3xmir16 /VCR contre NF-3xmir16 xénogreffes (Figure 3E), en conformité avec les augmentations de l'activité luciférase mesurée in vitro
(figure 3A et 3B). L'injection de 99mTc-pertechnétate et l'acquisition d'imagerie par caméra gamma ont indiqué qu'une accumulation significativement plus élevée de 99mTc-pertechnétate a été observée dans les xénogreffes de NF-3xmir16 /VCR que celui du NF-3xmir16 xénogreffes. Physiological accumulations de 99mTc-pertechnétate ont également été observées dans la glande thyroïde, de la vessie et de l'estomac (figure 3F). Et le NF-3xmir16 et NF-3xmir16 /tumeurs du magnétoscope ont les mêmes poids (Figure S1H).}

VP-16 et 5-FU surexpression de miARN-16 expression noninvasively imagée par le système de gène double rapporteur

pour déterminer si d'autres médicaments anticancéreux pourraient modifier le profil miRNA-16 expression, cinq médicaments cliniques pour le cancer gastrique ont été ajoutés à NF-3xmir16 cellules suivies par in vitro
bioluminescence imagerie et ^{131I iode radioactif absorption dosages. Les résultats ont révélé que l'intensité de luminescence (Figure 4A et 4B) ou l'absorption de l'iodure cellulaire (figure 4E) ont été considérablement réduits l'exposition au VP-16, le 5-FU et le CDDP, mais pas à la MMC et le traitement ADR par rapport aux cellules non traitées.}

les raisons observées dans VP-16, 5-FU et de traitement du signal CDDP diminué pourrait être que les médicaments activés endogène miRNA-16 expression ou la croissance cellulaire inhibée même causé la mort cellulaire. Exclure cette dernière possibilité, les cinq médicaments ont été ajoutés à NF-vide, les cellules qui ne contiennent pas miARN 16 sites cibles dans la construction. in vitro
bioluminescence résultats dans l'imagerie démontré que VP-16 et le 5-FU n'a eu aucun effet inhibiteur sur l'intensité de luminescence, tandis que le CDDP réduit encore le signal de luminescence (figure 4C et 4D), indiquant que le CDDP peut inhiber cellulaire la croissance, mais pas activer endogène miRNA-16 expression. D'autre part, MMC et de l'ADR ont été trouvés à augmenter légèrement l'intensité de luminescence dans les deux cellules NF-3xmir16 et NF-vides (figure 4A-D), qui peut résulter de la promotion de la prolifération cellulaire.

Pour vérifier que miRNA-16 activation a participé à des effets anticancéreux de VP-16 et 5-FU, Q-PCR ont été réalisées pour déterminer le niveau miRNA-16 NF-3xmir16 cellules exposition aux médicaments anticancéreux traitements. En conséquence, miRNA-16 expression a été régulée à la hausse de manière significative après les traitements VP-16 ou 5-FU en SGC7901 cellules par rapport aux cellules témoins non traitées, alors que MMC, ADR et CDDP ont eu un effet mineur sur miRNA-16 expression (Figure 4F).

augmentation de miARN-16 expressions de VP-16 et le 5-FU sont impliqués dans la p38 de NF-kB, mais la voie de signalisation

similaire à la modulation des gènes de l'ARN codant pour une protéine, la transcription des gènes de miARN semble être régulé par de multiples voies de signalisation. L'activation des voies de signalisation NF-kB ou MAPK est une réponse commune suivante médicaments chimiothérapeutiques [17], [18]. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la régulation positive de 16 miARN peut être le résultat d'une activation accrue de NF-kB ou MAPK après VP-16 ou le traitement 5-FU. Pour élucider le rôle de ces voies de signalisation dans le VP-16 et de transactivation du 5-FU induite par miARN-16, nous avons mesuré l'intensité de la luminescence dans le NF-3xmir16 cellules en réponse au VP-16 et le 5-FU en présence ou en l'absence d'inhibiteurs pharmacologiques de NF-kB ou p38 MAPK. Le traitement des cellules avec un inhibiteur de NF-kB spécifique, la baie 11-7082, n'a eu aucun effet sur le signal de luminescence par rapport aux cellules traitées par le médicament, sans inhibiteurs (figure S2).

En revanche, le traitement avec une p38 spécifique l'inhibiteur de la MAPK, SB203850, nettement secouru la diminution de la bioluminescence (figure 5A et 5B) ou l'absorption de l'iodure (figure 5C) par VP-16 et le 5-FU par rapport aux cellules témoins traitées. Pour confirmer le niveau d'expression de miARN-16 en présence d'SB203850, PCR en temps réel a été réalisée et les résultats ont montré que les inhibiteurs de la p38 MAPK drastiquement supprimé VP-16 et le 5-FU induite par miARN 16 régulation à la hausse (figure 5D), ce qui indique que l'augmentation de miARN-16 expression par VP-16 et 5-FU est impliqué dans p38 MAPK voie de signalisation.

Notre étude précédente a démontré que la protéine Bcl-2 est un gène cible directe de miARN-16 dans le développement du MDR dans SGC7901 cellules de cancer gastrique [11]. Pour tester si la protéine Bcl-2 est impliquée dans le VP-16 et le 5-FU, la stimulation de miARN 16
via la voie de la MAPK p38, nous avons déterminé le niveau de Bcl-2 de protéines par analyse par transfert de Western. Comme cela est représenté sur la figure 5E et 5F, VP-16 et le 5-FU a diminué de manière significative le niveau de la protéine Bcl-2 d'environ 50% par rapport aux cellules témoins non traitées en l'absence de SB203850. Lors d'un traitement avec SB203850, la diminution de la protéine Bcl-2 a été considérablement atténuée, ce qui suggère l'importance de l'activation de la MAPK p38 dans la régulation négative de VP-16 et le 5-FU-induite de protéine Bcl-2.

Dans le suivi du renforcement de miARN-16 expression in vivo par
VP-16 et 5-FU

Pour la surveillance non invasive du renforcement de miARN-16 expression induite par VP-16 et 5-FU, NF-vide et NF -3xmir16 cellules ont été greffés sur la patte arrière gauche et à droite de chaque souris (n = 6), respectivement. Afin d'éviter le signal de bioluminescence à partir de NF-vide interférer avec celle de NF-3xmir16 au cours du traitement médicamenteux, des nombres différents de NF-vide (1 x 10 ^{5 cellules) et NF-3xmir16 (1 x 10 7 cellules) ont été greffées. Comme on le voit sur la figure 6, l'intensité de la bioluminescence significativement réduite a été observée dans le NF-3xmir16 xénogreffes après VP-16 ou le traitement 5-FU par rapport à la non-traitement. En particulier, chez les souris traitées avec le VP-16, le signal de bioluminescence réduite d'environ 40% en NF-3xmir16 xénogreffes alors légèrement augmenté dans les xénogreffes de NF-vides par rapport à des images prétraitées (Figure 6a et 6b), de manière similaire à la différence d'intensité de luminescence provoquée par VP-16 in vitro
(figure 4A-D).}

• PLoS ONE: Fonctions microARN-219-2-3p comme un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique et est régulée par méthylation de l'ADN
• PLOS ONE: Association entre glutathion S-transférase T1 Null Génotype et cancer gastrique risque: une méta-analyse de 48 études