PLoS One: Nem invazív Látványterv mikroRNS-16 a kemorezisztenciájának gyomorrák használata Dual riporter gén képalkotó System

absztrakt katalógusa

A mikroRNS (miRNS) hozták összefüggésbe, hogy központi szerepet játszik a fejlesztés a gyógyszer-rezisztencia a különböző rosszindulatú daganatok. Azonban sok vizsgálatot végeztek a in vitro katalógusa szinten, és nem biztosítja a in vivo katalógusa információt funkcióit miRNS a rákellenes gyógyszer-rezisztencia. Itt bevezettük a kettős riporter gén képalkotó rendszer kíméletesen nyomon kinetikus kifejezése miRNS-16 alatt kemorezisztenciájának gyomorrákban mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Emberi nátrium-jodid szimporter (hNIS) és szentjánosbogárluciferáz (Fluc) géneket összekapcsolódva hNIS /Fluc kettős fúziós riporter gén és generál humán gyomorrák sejtvonal NF-3xmir16 és multidrog sejtvonal NF-3xmir16 /VCR. Radiojód felvételét és Fluc lumineszcens jel in vitro katalógusa jól korrelál életképes sejtek számát. A luciferáz tevékenységek és radiojód felvételét NF-3xmir16 sejteket feltűnően elnyomott exogén vagy endogén miRNS-16. Az NF-3xmir16 /VCR sejtek jelentős növekedést mutatott a ^{131I-felvétel és lumineszcenciaintenzitás képest NF-3xmir16 sejteket. A radioaktivitás in vivo katalógusa 99mTc-pertechnetát képalkotás és az intenzitás biolumineszcenciával képalkotó szintén emelkedett NF-3xmir16 /VCR képest, hogy az NF-3xmir16 xenograftok. Továbbá, ezt a riporter gén rendszer, azt találtuk, hogy az etopozid (VP-16) és az 5-fluorouracil (5-FU) aktivált miRNS-16 expressziós in vitro
és a in vivo katalógusa, és a túlszabályzását miRNS-16 p38MAPK függő, de az NF-kB független. Ez a kettős képalkotó riporter gén lehet kézbesíteni, mint új eszköz in vivo katalógusa képalkotó mikroRNS a kemorezisztenciájának rák, valamint a korai felismerés és diagnózis a klinikán. Katalógusa}

Citation: Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Noninvasive vizualizáció mikroRNS-16 a kemorezisztenciájának gyomorrák használata Dual riporter gén képalkotó rendszer. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792 katalógusa

Szerkesztő: Javier S. Castresana, Navarrai Egyetem, Spanyolország katalógusa

Beérkezett: november 21, 2012; Elfogadva: március 13, 2013; Megjelent: április 17, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Program a Nemzeti Alap Kutatási és Fejlesztési Program of China (973) alatt Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína szerint Grant sz. 81090272, 81090274, 81227901, innovációs csapat fejlesztési támogatás Kína Tanszék Oktatási (2010CXTD01), 863 Program of China (2012AA02A603) és a Nemzeti Key Technology Support Program keretében Grant No. 2012BAI23B06. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: Társszerző Xiaoyuan Chen szolgál szerkesztő a folyóirat. Ez nem változtat a szerzők betartása minden PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A gyomorrák továbbra is az első vezető daganatos halálok Kínában és a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat világszerte ellenére drámai csökkenést a halálozási és megbetegedési az elmúlt három évtizedben [1]. Kemoterápia már széles körben használják kezelésére egyaránt operálható és előrehaladott gyomorrák, ami javulást a teljes túlélés, valamint életminőségét betegeknél [2], [3]. Azonban a hosszú távú kemoterápiát gyakran nem, hogy megszüntesse tumorsejtekre, mivel az intrinsic vagy szerzett multidrog rezisztencia (MDR), amely a leginkább elsődleges oka a tumor kiújulásának [4]. Jelenleg, a MDR tartották, mint egy multifaktoriális jelenség magában foglaló több fő mechanizmusokat, beleértve a fokozott anyagcsere a drogok, csökkent felvételét vízoldható gyógyszerek, megváltozott gyógyszercélpontok, csökkentett intracelluláris hatóanyag-koncentráció efflux pumpák, megváltozott sejtciklus ellenőrző pontokat és indukált vészhelyzeti válasz gének csorbítaná apoptotikus utak, etc katalógusa [5]. Bár az MDR mechanizmusokat már széles körben feltárt, a legfontosabb tényezők a jelenség továbbra is nagyrészt tisztázatlan.

A mikroRNS (miRNS-ek) egy új osztályát endogén kis nem-kódoló RNS-ek (19-23 nukleotid), amely negatívan szabályozzák a gén kifejezést itt a poszt-transzkripciós szinten tökéletes vagy tökéletlen bázispárosodás a 3 'nem transzlálódó régiót (UTR) a megcélzott mRNS-ek, és ezáltal indukálják mRNS lebomlás vagy fordítás elnyomás [6]. Jelenleg feltörekvő vizsgálatok arra utaltak, létezését és fontosságát miRNS az evolúció rákellenes gyógyszer-rezisztencia és miRNS expressziós profil összefüggésbe lehet hozni a fejlődés a gyógyszer-rezisztencia [7] - [10], jelezve, hogy a miRNS-közvetített formában a gyógyszer-rezisztencia egy újabb mechanizmus MDR. A mi korábbi vizsgálatban azt jelentették, hogy két miRNS, miRNS-15b és miRNS-16, arra eltérően expresszált egy multidrog-rezisztens humán gyomorrák sejtvonal SGC7901 /VCR és a szülői sejtvonal SGC7901 [11]. Azonban végeztek csak a in vitro katalógusa szinten, és nem tükrözik az in vivo katalógusa információt funkcióit miRNS a rákellenes gyógyszer-rezisztencia. Katalógusa

Recent advances a molekuláris képalkotó eljárások segítségével a noninvazív megjelenítés a normális és abnormális sejtszintű folyamatokat élő alanyok molekuláris szinten, nem pedig anatómiai szinten [12]. Számos noninvazív stratégiákat, mint például egy fluoreszkáló fehérje, luciferáz riporter gén, nukleolin aptamer vagy fluoreszcens molekuláris beacon konjugált nanorészecske, dolgoztak ki, hogy figyelemmel kíséri a expressziós mintázatát különböző miRNS-ek alatt carcinogenesis, neurogenezis vagy izomképződés in vitro
és in vivo katalógusa [13] - [16]. A jelen tanulmány volt, hogy nem invazív módszer ellenőrzésére miRNS-16 a kemorezisztenciájának gyomorrák keresztül kettős képalkotó riporter gén rendszert, amelyben az emberi nátrium-jodid szimporter (hNIS) és szentjánosbogárluciferáz (Fluc) géneket kapcsolódik egy fúziós gént biolumineszcencia képalkotás és ^{99mTc-pertechnetát gamma kamera képalkotó in vivo katalógusa.}

anyagok és módszerek katalógusa

Állatok katalógusa

specifikus kórokozóktól mentes 8 hetes -old BALB /c csupasz egereket a Shanghai Animal Center Kínában és tenyésztették a negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem állati központ, Kína. Az összes kísérleti állatokat elhelyezték alatt specifikus patogénmentes körülmények között. Az állat protokollok ebben a tanulmányban alkalmazott hagyta jóvá negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem etikai bizottsága. Minden kísérleti eljárás szerint elvégzett negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem Útmutató a Care and Use of Laboratory Animals által megfogalmazott Nemzeti Társaság orvosi kutatás. Katalógusa

Reagensek és antitestek katalógusa

Egér monoklonális antitest ellen hNIS (ab17795) vásároltunk a ABCAM. Nyúl poliklonális antitest specifikus a Bcl-2-t vásárolt a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-kB inhibitor) és SB203580 (p38 MAPK-inhibitor) kaptuk Beyotime Intézet Biotechnology (Shanghai, Kína). A rákellenes gyógyszerek, beleértve a vinkrisztin (VCR), etoposid (VP-16), a mitomicin C (MMC), ciszplatin (CDDP), 5-fluor-uracil (5-FU) és az adriamicin (ADR) vásároltunk a Wolsen Biotechnology (Xi'an, Kína). A GV260-Fluc-Puro lentivírus plazmidot Sanghaj GeneChem Company (Sanghaj, Kína). Minden sejt táptalaj és a szérum vásároltuk a Gibco (Grand Island, NY).

Dual riporter gén plazmid konstrukció

A kódoló szekvenciáját hNIS gént amplifikáltunk PCR-rel egy plazmidból bocsátotta rendelkezésünkre Dr. Weidong Yang (negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem, Kína) az alábbi primerek használatával: katalógusa

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 'katalógusa

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 "katalógusa

az építési kettős expressziós vektor, a cDNS hNIS gén került be a BamHI katalógusa I és Age katalógusa I restrikciós helyek egy lentivirális vektor GV260 -Fluc-Puro (Shanghai GeneChem, Kína) kódoló Fluc gén szabályozása alatt ubiquitin promóter. Az így kapott két expressziós konstrukciót GV260-hNIS /Fluc tovább előállításához használt GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plazmid. Három példányban komplementer szekvenciák ellen miRNS-16 (3xmir16) ültettünk be, miután a stop kodonját a hNIS /Fluc fúziós gén létrehozásához GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (1a ábra). A rántotta nukleotid szekvenciáját hasonló hosszúságú 3xmir16 is beilleszteni 3'UTR a hNIS /Fluc fúziós gén, így a kontroll konstrukcióval (GV260-hNIS /Fluc-tülekedés. A 3xmir16 szekvencia vagy kódolt kaptuk izzítással a következő oligonukleotid

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 'katalógusa

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3' katalógusa

tülekedés-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

tülekedés-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

gyomorrák sejttenyészet és stabil sejtvonal generáció

emberi gyomorrák sejtvonalat SGC7901 és multidrog-rezisztens változata SGC7901 /VCR (létre és tartják fenn a laboratóriumunkban a korábban leírt [11]) RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjú szérummal és 100 egység penicillint és 100 ng /ml sztreptomicinnel (Invitrogen ). Ahhoz, hogy a MDR-fenotípus, vinkrisztin (a végső koncentráció 1 ng /ml) adtunk a táptalajhoz a SGC7901 /VCR sejtek. Generálni stabil sejtvonal, lentivírusvektor GV260-hNIS /Fluc vagy GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 először kotranszfektálunk 293T sejteket csomagolás plazmidok ( gag, pol, VSV-g katalógusa). Növekedési tápközeget lecseréltük a 6 órával a transzfekció és lentivírus-tartalmú felülúszót összegyűjtöttük 48 óra post-transzfekció. A begyűjtött felülúszót centrifugáltuk 4000 g-n 10 percig a sejttörmelék. A koncentrált vírust titráltuk 293T-sejtek. SGC7901 sejtek és SGC7901 /VCR sejtek transzdukált GV260-hNIS /Fluc és GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 vírus rendre fertőzési multiplicitással (MOI) 10. Ezután a sejteket szűrtünk puromicin 3 hét és sejtklónokat összegyűjtött bővült a következő lépésben kísérletet. katalógusa

RNS oligo és transzfekciós katalógusa

a miRNS-16 és a negatív kontroll (NC) RNS oligonukleotidokat szintetizált (Shanghai GenePharma, Kína) az alábbi szekvenciák:

miRNS-16 értelemben: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 'katalógusa

miRNS-16 anti-ész: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3' katalógusa

NC értelme: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

transzfekció előtt SGCC7901 sejteket ültettünk 1 × 10 ^{5 sejt lyukanként egy 24 mélyedéses lemezen, és növekedni 24 órán át. A transzfektálást végeztünk Lipofectamine 2000 reagenssel (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó protokollja. Minden transzfekció végeztünk három példányban.}

Kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR) elemzéssel

Teljes RNS-t izolálunk a tenyésztett sejtekből Trizol (Invitrogen). RT végeztük PrimerScript RT Regent reagenskészlet (Takara, Japán) és qPCR végeztük Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) és ABI StepOne plusz a valós idejű PCR System (Applied Biosystems) alkalmazásával a gyártó protokollja . A PCR-termékeket elemeztük 3% -os agaróz gélen. A relatív mennyisége miRNS-16 normalizáltuk U6 snRNS. És a relatív mennyisége Fluc normalizáltuk GAPDH-gén. A kihajtható változás miRNS-16 vagy Fluc gén kísérleti csoportban a kontrollcsoporthoz képest csoport kiszámítása a 2 ^{-ΔΔCt módszer, ahol ΔΔCt = ΔCt kísérlet - ΔCt szabályozás és ΔCt = Ct miRNS - Ct U6 vagy ΔCt = ct Fluc - ct GAPDH. A PCR-t három párhuzamosban végeztük. A használt primerek szár-hurok RT-PCR miR-16 szerepelnek a következők:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "katalógusa

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 'katalógusa

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3' katalógusa

miR-16 Rev: 5 "-TGCGTGTCGTGGAGTC-3 'katalógusa

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3' katalógusa

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3 'katalógusa

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western-blot-analízis

SGC7901 sejteket háromszor mostuk PBS-sel, majd lizáltuk hideg lízis-pufferben (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCI [pH 7,4], 1 mM fenil-metil-fluorid, 1% Triton X-100 és 1% aprotinin) 30 percig, jégen. A sejtlizátumokat majd centrifugáltuk 12.000 rpm-en 15 percen át 4 ° C hőmérsékleten. A felülúszót összegyűjtöttük, és azonos mennyiségű fehérje volt megoldani 8% SDS-PAGE, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A membránokat inkubáltuk blokkoló oldattal, ami 5% BSA-t 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a immunblottoltuk a jelzett antitestekkel. Az immunreaktív sávokat tettük láthatóvá egy kemilumineszcencia készlet (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ). Katalógusa

MTT assay katalógusa

Annak megállapításához, a növekedési ráta az NF-üres, az NF-3xmir16 és NF-3xmir16 /VCR sejtek, e három sejtet oltunk 96 mérőhelyes lemezeken az azonos számok (5000 sejt) lyukanként. Különböző időpontokban (24, 48, 72, 96 óra), 25 ul 5,0 mg /ml steril szűrt 3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazólium-bromidot (MTT; Sigma) adunk az egyes lyukakhoz. A reagálatlan színezéket eltávolítottuk 4 óra elteltével inkubálás és az oldhatatlan formazán kristályokat feloldjuk 100 ul dimetil-szulfoxidban (DMSO). Az abszorbanciát 570 nm-en (referencia hullámhossz 630 nm) mértük Synergy II multimódusú mikrotiterlemez-leolvasó (BioTech Instruments, VT).

Radioaktív jodid felvételi vizsgálatot

azonosítani közötti kapcsolat jodid felvétel és a sejtek számát, egy hígítási sort sejtet oltunk 24 mérőhelyes lemezekre. A 12 órás inkubálás a ^{131 felvétel szintjét vizsgálták. A jodid felvételét oly módon határoztuk meg a sejteket 500 ul Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldat (HBSS), amely 0,5% szarvasmarha szérum albumin 37 kBq hordozó-mentes Na 131I és 10 mM nátrium-jodidot, 30 percig. Az inkubálás után a sejteket kétszer mostuk a lehető leggyorsabban 1 ml jéghideg HBSS-pufferben. A sejteket leválasztottuk 200 pl tripszin, és a radioaktivitást mértük egy γ-számlálóval (Perkin-Elmer). Ahhoz, hogy értékelje a funkcionális expresszióját hNIS a riporter gén rendszerben, az NF-3xmir16 sejteket szélesztettünk 1 × 10 5 sejt lyukanként egy 24 lyukú lemezen a nap a transzfekció előtt, akkor miRNS-16 és az NC oligo transzfektáltunk . 24 órával később, a jodid felvételét mértük a fent leírtak szerint.}

In vitro
biolumineszcencia képalkotó vizsgálat

azonosítani közötti kapcsolat lumineszcencia jeleket és a sejtek számát, egy hígítási sorozat a sejtet oltunk 24 mérőhelyes lemezekre. 12 óra elteltével inkubálás mindegyik jól mossuk foszfáttal beffered sóoldattal (PBS). Ezután D-luciferint (Xenogen) koncentrációban 0,5 mmol /l adtunk közvetlenül a vizsgálat előtt. Biolumineszcens megmértük egy IVIS 100 Imaging rendszer (Xenogen), és vizsgáljuk a Living kép szoftververziót 2,50 (Xenogen). Ahhoz, hogy értékelje a funkcionális expresszióját Fluc a riporter gén rendszerben, az NF-3xmir16 sejteket szélesztettünk 1 × 10 ^{5 sejt lyukanként egy 24 lyukú lemezen a nap a transzfekció előtt, akkor miRNS-16 és az NC oligo transzfektáltunk . 24 órával később, a biolumineszcenciavizsgálat mértük a fent leírtak szerint.}

biolumineszcens és A 99mTc-pertechnetát képalkotó nude egerekben

Egyenlő számok (5 × 10 ^{6 sejt) NF-üres, és az NF-3xmir16, vagy az NF-3xmir16 /VCR és az NF-3xmir16 sejtek voltak-xenograftot hordozó, szubkután a bal és jobb hátsó horpaszában csupasz egerekbe feltüntetett eredményeket. Foszforeszkáló képalkotó szerezte egy nappal a sejtek befecskendezése után. Minden egereket elaltattuk 2,5% izoflurán gáz oxigén áramlási sebesség 1,5 l /min. Vizes oldatát a D-luciferine (150 mg /testtömeg-kg) injektáltunk perkután előtt 10 perccel képalkotás. Az egésztest-képek Fluc jelek szerezték 2 percig élő kép szoftver (Xenogen) futott, így bioluminescent képeket. A ROI-t a kiválasztott manuálisan a jel intenzitását. Biolumineszcens jeleket fejezzük fotonok másodpercenként köbcentiméter per szteradiánban (p /sec /cm 2 /sr) belül a ROI. Katalógusa}

A nukleáris képalkotás, a tumoros egerek intraperitoneálisan 18,5 MBq a ^{99mTc-pertechnetát a 2weeks sejtek befecskendezése után. Injekció után 30 percig, az állatot helyeztük egy szórt fekvő helyzetben az ágyon a SPECT szkenner (Symbia T2, Siemens). Altatás végeztük 1% -2% isoflurannak 100% O _{2 befecskendezés során és képalkotó. Minden kép rekonstruálható egy 2 dimenziós megrendelt-részhalmazok elvárás maximum algoritmus. Aktivitás mennyiségi megtekintésével régiók (ROI) a tumorok és a terület a ROI állandó értéken tartottuk valamennyi nukleáris és optikai képeket. Miután biolumineszcens és A 99mTc-pertechnetát képalkotás, a tumorokat gyűjtöttünk és lemérjük.}}

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SD. Mutató adatok összehasonlítására két csoport értékelte a Student-féle t-próba. Közötti összehasonlításokat több mint két csoport értékelni, varianciaanalízissel (ANOVA), a megfelelő posthoc tesztelés. P értékek < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Katalógusa

Eredmények katalógusa

létesítése gyomorrák stabilan expresszáló sejtvonalak hNIS és Fluc gének katalógusa

egy fúziós riporter gén (GV260- hNIS /Fluc említett, az NF-üres), a hNIS cDNS-t klónoztuk lentivírus vektorba (GV260-Fluc-Puro) kódoló Fluc gént, hogy létrehoz egy fúziós fehérje, amely ellenőrzése alatt ubiquitin promóter. Ezután három példányban komplementer szekvenciák ellen miRNS-16 (3xmir16) illesztettek stopkodon után a hNIS /Fluc fúziós gén létrehozásához egy másik konstrukciót (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 említett NF-3xmir16) (1A ábra). A rántotta nukleotid szekvenciáját hasonló hosszúságú 3xmir16 is beilleszteni 3'UTR a hNIS /Fluc fúziós gén, így a kontroll konstrukcióval (GV260-hNIS /Fluc-tülekedés említett NF-tülekedés). In vitro katalógusa biolumineszcenciával képalkotó azt mutatta, hogy Fluc gén tevékenységét NF-üres cellák hasonló volt származó NF-tülekedés sejtek (ábra S1A). Ezért úgy döntünk, az NF-üres konstrukció a további vizsgálat. Két sejtvonal egy MDR humán gyomorrák sejtvonal SGC7901 /VCR és a szülői sejtvonal SGC7901 voltak transzdukált a lentivírus tartalmazó NF-üres, vagy az NF-3xmir16 gén illetve létrehozni három stabil sejtvonalak NF-EMPTY /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 és NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (a NF-üres, az NF-3xmir16 és NF-3xmir16 /VCR). Először végeztünk MTT assay mérésére növekedési ráta a három sejtvonal (ábra S1B). Aztán perfomed qPCR vizsgálattal, hogy vizsgálja meg az integrált másolatait riporter-konstrukciók a három sejtvonal (ábra S1C). In vitro katalógusa biolumineszcenciával képalkotás (1B) és western blot (1C) tovább, hogy kimutatható a sikeres kifejezése Fluc és hNIS gének három sejtvonal. Katalógusa

A linearitás korrelációja Fluc és hNIS transzgén tevékenységek sejtszám in vitro Matton

értékelni Fluc és hNIS transzgén tevékenységek sejtekben végeztünk in vitro katalógusa biolumineszcencia képalkotás és ^{131 radiojód felvétel esszék egy hígítási sort az NF-3xmir16 sejtvonalakban. Amint az 1D ábra szerint növeli a sejtek számának, a felhalmozódása a lumineszcencia is növekedett. Biolumineszcens jeleket találtak jól korrelál a sejtek számát (γ 2 = 0,9990) (1 E. ábra). Eközben 131 felvételt is növekedett sejtszám (ábra 1F). A radiojód felvételét figyeltek jól korrelál (γ 2 = 0,9543) és a sejtek számát (ábra 1G). Mivel a Fluc fuzionáltuk hNIS, egy jól korreláció biolumineszcencia intenzitása és 131I radioaktivitás volt megfigyelhető szerinti sejtek a lineáris regressziós analízissel (γ 2 = 0,9339) (ábra 1H).}

érvényesítése miRNS-16 tevékenységeket keresztül katalógusa riporter gén rendszer katalógusa

Annak tesztelésére, hogy az NF-3xmir16 riporter vektort tartalmazó miRNS-16 target szekvenciák elfojtott exogén miRNS-16, megvizsgáltuk a Fluc és hNIS tevékenység bevezetése után miRNS-16. Összehasonlítva a transzfektált sejtek NC oligonukleotidok, a biolumineszcencia jel arra 35% -kal csökkentek, a transzfektált sejtek miRNS-16 (ábra a 2A és 2B). A ^{131I radiojód felvételének miRNS-16 transzfektált sejtek megközelítőleg 70% -a, hogy az NC transzfektált sejtekben mennyiségileg radioaktív számlálással (2C ábra). És a Fluc és hNIS aktivitás csökkent dózisfüggő módon (ábra S1D-F). Ezek az adatok azt mutatták, hogy az NF-3xmir16 riporter konstrukcióval szabályozni lehetne a miRNS-16. Katalógusa}

kimutatása endogén miRNS-16 expresszió in vitro katalógusa és in vivo katalógusa

detektálni az endogén miRNS-16 expressziós szintje a gyomorrák sejtek in vitro katalógusa, egyenlő számban (1 × 10 ^{6) NF-üres és NF-3xmir16 sejteket oltottunk, majd a Fluc és hNIS aktivitást vizsgáltuk. Ábrán látható módon a 2D és 2E, Fluc aktivitás származó NF-3xmir16 sejtek csökkent mintegy 50% -kal az endogén miRNS-16 összehasonlítják a NF-üres cellák. És a hNIS aktivitást NF-3xmir16 sejtek is csökkent mintegy 40% -kal, válaszul az endogén miRNS-16 Ezzel szemben a származó NF-üres sejtek (ábra 2F). A hiányzó elfojtása Fluc vagy hNIS tevékenységet észleltek NF üres sejtek tekintetében, hogy nem voltak miRNS-16 célzott helyek NF-üres konstrukció. Katalógusa}

A kettős képalkotó riporter gén rendszer lehetővé tette, vivo katalógusa megjelenítés endogén miRNS-16 expresszió gyomorrák sejtek. Egyenlő számok (1 × 10 ^{7) az NF-üres, és az NF-3xmir16 sejteket xenograftot hordozó szubkután a bal és jobb hátsó oldalában a csupasz egerekbe (n = 6), majd biolumineszcens képalkotás és A 99mTc-pertechnetát gamma kamera képalkotó szerezték. Ábrán látható 2G, lumineszcencia intenzitását beültetett NF-3xmir16 sejtek mintegy 55% -kal alacsonyabb, mint amelyet az NF-üres cellák, hasonlóképpen a különbség a luciferáz tevékenységek mért in vitro katalógusa (2D, ábra és 2E). Miután a intraperitoneá 99mTc-pertechnetát 18,5 MBq, gamma kamera képalkotó végeztünk. Ezzel szemben a NF-üres daganatok, ami azt mutatta, kiemelkedő felvétel 99mTc-pertechnetát, NF-3xmir16 daganatok elhanyagolható volt felvétel (2H ábra), jelezve az endogén miRNS-16 csökkentette a hNIS kifejezést. A fiziológiás felvétel is megfigyelhető volt, a helyszínek a pajzsmirigy, gyomor és hólyag, amelyben hNIS normálisan expresszálódik. Régiók (ROI) elemzése azt mutatta, hogy hNIS aktivitás jelentősen csökkent NF-3xmir16 xenograftok képest, hogy az NF-üres átültetést hordoznak (2H ábra). Miután képalkotó gyűjtöttünk, és megmérjük a NF-üres és NF-3xmir16 daganatok (ábra S1G). Az eredmények azt mutatták, hogy ugyanaz volt a súlyokat, jelezte, hogy a különbségek jel intenzitása valóban endogén miRNS-16 funkció, de nem a sejtek számát. Katalógusa}

Megjelenítés kifejezési változás a miRNS-16 MDR gyomorrák sejtek in vitro katalógusa és in vivo Matton

a kifejezés változás a miRNS-16 gyógyszer-rezisztens gyomorrák sejtek mutattunk keresztül katalógusa a Fluc és hNIS tevékenység biolumineszcencia képalkotás és ^{131 radiojód felvételét vizsgálatokban. Mindkét Fluc aktivitás (3A és 3B ábrák) és hNIS aktivitás (3C, ábra) nőtt mintegy 1,5-szeres az NF-3xmir16 /VCR sejtek képest, hogy az NF-3xmir16 sejtekben, amely azt sugallta, hogy a miRNS-16-ben downregulált az NF-3xmir16 /VCR sejtek. Annak ellenőrzésére, a kapott eredmények a riporter gén rendszer, kvantitatív RT-PCR (Q-PCR) végzett elemzés a differenciális expresszióját miRNS-16 ebben a két sejtvonal. Összhangban a riporter gén rendszer adatai, a Q-PCR kimutatta csökkent miRNS-16 szintek NF-3xmir16 /VCR képest a párja NF-3xmir16 sejtek (ábra 3D).}

nem invazív mennyiségi ellenőrzése miRNA- 16 differenciális expressziót MDR gyomorrák sejtek vivo katalógusa, biolumineszcens képalkotás és ^{99mTc-pertechnetát gamma kamera képalkotó végeztünk. A biolumineszcens képalkotás bizonyította, hogy lumineszcencia jelek mintegy 1,7-szeresére növeli az NF-3xmir16 /VCR xenograftok versus NF-3xmir16 átültetést hordoznak (ábra 3E), összhangban növekszik a luciferáz aktivitást in vitro katalógusa (3A és 3B ábrák). Az injekciót 99mTc-pertechnetát és a megszerzése gamma kamera képalkotó jelezte, hogy jelentősen magasabb felhalmozási 99mTc-pertechnetát figyeltek NF-3xmir16 /VCR xenograftokkal mint az NF-3xmir16 vizsgálatára. Fiziológiai 99mTc-pertechnetát felhalmozódást is megfigyelhetők voltak a pajzsmirigy, hólyag és gyomor (3F ábrán). És az NF-3xmir16 és az NF-3xmir16 /VCR daganatokat azonos súlyú (ábra S1H). Katalógusa}

VP-16 és az 5-FU túlszabályzását miRNS-16 expresszió kíméletesen képalkotása a kettős riporter gén rendszerben

Annak megállapításához, hogy más rákellenes gyógyszerek, amelyek megváltoztathatják miRNS-16 expressziós profillal, öt klinikai gyógyszerek gyomorrák adunk NF-3xmir16 sejtekbe, majd in vitro katalógusa biolumineszcencia képalkotás és ^{131 radiojód felvételét vizsgálatokban. Az eredmények azt mutatták, hogy a lumineszcencia intenzitás (4a ábra és a 4b), vagy a sejtek jodid felvétel (ábra 4E) nagymértékben csökkent kitettség VP-16, 5-FU és a CDDP, de nem MMC és az ADR kezelés képest, nem kezelt sejtekben.}

az okok a csökkent jel megfigyelhető VP-16, 5-FU és CDDP kezelés lehet, hogy a kábítószer-aktivált endogén miRNS-16 expresszió vagy gátolt sejtek növekedését sőt okozta sejthalál. Ahhoz, hogy kizárják az utóbbi lehetőség, az öt gyógyszereket adunk NF-üres sejtek, amelyek nem tartalmaznak miRNS-16 cél helyek a konstrukciót. A in vitro
biolumineszcencia képalkotó eredmények igazolták, hogy a VP-16 és az 5-FU nem volt gátló hatása a lumineszcencia intenzitás, mivel a CDDP még mindig csökkentette a lumineszcens jel (4C és 4D), jelezve, hogy a CDDP gátolhatják a sejt növekedés, de nem aktiválja az endogén miRNS-16 expresszió. Másrészt, az MMC és ADR találtak kis mértékben növelni a lumineszcencia intenzitás mind az NF-3xmir16 és NF-üres cellák (4a ábra-D), amely származhat elősegítő sejtproliferáció.

Annak ellenőrzésére, hogy miRNS-16 aktiváló részt be rákellenes hatások VP-16 és az 5-FU, Q-PCR végeztünk annak meghatározására, a miRNS-16 szint NF-3xmir16 sejtek expozíció rákellenes gyógyszerek kezelések. Ennek megfelelően a miRNS-16 expresszió túlszabályozott után jelentősen VP-16, vagy 5-FU kezelések SGC7901 sejtek összehasonlítva a nem kezelt kontroll sejtek, míg az MMC, ADR és a CDDP volt csekély hatással miRNS-16 expresszió (4F).

fokozott miRNS-16 kifejezések által VP-16 és az 5-FU részt vesznek a p38 MAPK de az NF-kB jelátviteli útvonal

Hasonló a moduláció a fehérje-kódoló RNS-génekben, transzkripcióját miRNS gének úgy tűnik, hogy szabályozza több jelátviteli utak. Aktiválása az NF-kB vagy MAPK jelátviteli gyakori válasz a következő kemoterápiás szerek [17], [18]. Ezért azt feltételeztük, hogy fokozza a miRNS-16 lehet a megnövekedett NF-kB vagy MAPK aktiválást követően VP-16, vagy 5-FU kezeléssel. Ahhoz, hogy vizsgálhassuk a szerepét ezekre a jeltovábbítási útvonalakra VP-16 és az 5-FU által kiváltott transzaktiváló miRNS-16, először mért lumineszcencia intenzitás NF-3xmir16 sejtek válasz VP-16 és az 5-FU a jelenlétében vagy távollétében farmakológiai inhibitorok NF-kB vagy p38 MAPK. A kezelést a sejtek egy specifikus NF-kB inhibitor, Bay 11-7082, nem volt hatása a lumineszcens jel, mint a hatóanyaggal kezelt sejtek nélkül inhibitorok (ábra S2).

Ezzel szemben, a kezelés egy adott p38 MAPK-inhibitor, SB203850, markánsan mentettek csökkenése biolumineszcencia (ábra 5A és 5B) vagy jodid felvétel (5C) által VP-16 és 5-FU összehasonlítva a kezelt kontroll sejtek. Hogy megerősítsék a miRNS-16 expressziós szint jelenlétében SB203850, valós idejű PCR-t végeztünk, és az eredmények azt mutatták, hogy a gátló p38 MAPK drasztikusan elnyomott VP-16 és az 5-FU által kiváltott miRNS-16 upreguláció (5D ábra), jelezve, hogy a megnövekedett miRNS-16 expresszió VP-16 és az 5-FU részt vesz a p38 MAPK jelátviteli útvonal.

korábbi tanulmány kimutatta, hogy a Bcl-2-protein közvetlen célgént miRNS-16 a fejlesztés az MDR a SGC7901 gyomorrák-sejtek [11]. Annak tesztelésére, hogy a Bcl-2 szerepet játszik a VP-16 és 5-FU-stimulációja miRNS-16 keresztül
p38 MAPK útvonal, meghatároztuk a Bcl-2-protein szintjének Western-blot-analízis. Ábrán látható módon 5E és 5F, VP-16 és az 5-FU szignifikánsan csökkentette a Bcl-2-protein szint mintegy 50%, szemben a kezeletlen kontroll sejtek hiányában SB203850. Upon kezelés együtt SB203850, a csökkenés a Bcl-2-protein drasztikusan csökkentette, ami arra utal, hogy fontos a p38 MAPK aktiváció VP-16 és az 5-FU által kiváltott alulszabályozása Bcl-2-protein.

in vivo
monitorozása fokozott miRNS-16 expresszió VP-16 és az 5-FU

nem invazív monitorozása fokozott miRNS-16 expresszió által indukált VP-16 és az 5-FU, az NF-üres és az NF -3xmir16 sejteket ojtott a bal és jobb hátsó végtagi minden egér (n = 6), ill. Annak elkerülése érdekében, a biolumineszcencia jelet NF-üres zavarja, hogy származó NF-3xmir16 során gyógyszeres kezelés, különböző számú NF-üres (1 × 10 ^{5 sejt), és az NF-3xmir16 (1 × 10 7 sejt) oltva. Amint a 6. ábrán látható, jelentősen csökkent biolumineszcencia intenzitás volt megfigyelhető az NF-3xmir16 xenograftok után VP-16, vagy 5-FU kezeléssel összehasonlítva a nontreatment. Különösen kezelt egerekben VP-16, a biolumineszcencia jel csökkent mintegy 40% -kal az NF-3xmir16 xenograftok mivel kissé nőtt az NF-üres xenograftok versus előkezelt képek (6a ábra és a 6B), hasonlóképpen a különbség lumineszcencia intenzitás okozott VP-16 in vitro katalógusa (4A-D).}

• PLoS One: a mikro-RNS-219-2-3p funkciók tumorszuppresszorként gyomorrákban, és szabályozza a DNS metiláció
• PLoS One: egyrészről a glutation S-transzferáz T1 Null genotípus és a gyomorrák kockázata: A meta-analízis 48 Tanulmányok