PLoS ONE: Non-invasiv Visualisering af MicroRNA-16 i kemoresistens af Gastric Cancer Ved hjælp af en Dual Reporter Gene Imaging System

Abstrakt

MikroRNA'er (miRNA) har været impliceret at spille en central rolle i udviklingen af ​​resistens i en række forskellige maligniteter. Imidlertid blev mange undersøgelser udført på in vitro
niveau og kunne ikke give den in vivo
oplysninger om funktioner miRNA i anticancer resistens. Her har vi indført en dobbelt reportergen imaging system til ikke-invasiv overvågning af kinetiske udtryk for miRNA-16 under kemoresistens i mavekræft både in vitro
in vivo
. Menneskelig natriumjodid symporter (hNIS) og ildflue luciferase (Fluc) gener var forbundet til at danne hNIS /Fluc dobbelt fusion reporter gen og derefter generere human mavekræft cellelinje NF-3xmir16 og multiresistens cellelinje NF-3xmir16 /VCR. Radioiodide optagelse og Fluc luminescens signaler in vitro
korreleret godt med levedygtige tal celle. luciferaseaktiviteter og radioiodide optagelse i NF-3xmir16 celler Den blev bemærkelsesværdigt undertrykt af eksogene eller endogene miRNA-16. NF-3xmir16 /VCR celler viste en signifikant stigning i ^{131I optagelse og luminescens intensitet i forhold til NF-3xmir16 celler. Radioaktiviteten fra in vivo
99mTc-pertechnetat billedbehandling og intensiteten fra bioluminescens imaging blev også forøget i NF-3xmir16 /VCR sammenlignet med i NF-3xmir16 tumorxenoplantater. Desuden bruger denne reportergensystemet, fandt vi, at etoposid (VP-16) og 5-fluorouracil (5-FU) aktiverede miRNA-16-ekspression in vitro
in vivo
, og opregulering af miRNA-16 er p38MAPK afhængig men NF-KB uafhængig. Denne dobbelte billedbehandling reporter gen kan serveres som en ny værktøj til in vivo
billeddannelse af microRNA i kemoresistens af kræft, samt for tidlig opsporing og diagnosticering i klinikken}

Henvisning:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Non-invasiv Visualisering af MicroRNA-16 i kemoresistens af Gastric Cancer Ved hjælp af en Dual Reporter Gene Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: November 21, 2012; Accepteret: 13 Mar 2013; Udgivet: 17 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Program for National Basic Research and Development Program Kina (973) under Grant nr 2012CB518101, 2011CB707702, National Natural Science Foundation of China under Grant nr. 81.090.272, 81.090.274, 81.227.901, Innovation Team Development Grant af Kina Department Undervisningsministeriet (2010CXTD01), 863 Program Kina (2012AA02A603) og National Key Technology Support Program under Grant nr 2012BAI23B06. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Xiaoyuan Chen tjener som redaktør for dette tidsskrift. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

mavekræft stadig den første hyppigste årsag til kræft dødsfald i Kina og den fjerde mest almindelige malignitet verdensplan på trods af et dramatisk fald i dødelighed og sygelighed i de seneste tre årtier [1]. Kemoterapi har været meget anvendt til at behandle både resektabel og avanceret gastrisk kræft, hvilket fører til forbedringer i den samlede overlevelse samt livskvaliteten for patienter [2], [3]. Men langsigtet kemoterapi ofte undlader at fjerne alle tumorceller på grund af iboende eller erhvervet multilægemiddelresistens (MDR), som er den mest primære årsag til tumortilbagevenden [4]. På nuværende tidspunkt har MDR været betragtet som en multifaktoriel fænomen, der involverer flere store mekanismer, herunder øget metabolisme af lægemidler, nedsat optagelse af vandopløselige stoffer, ændrede lægemiddeltargets, nedsat intracellulær koncentration lægemiddel ved effluxpumper, ændret cellecykluskontrolpunkter og induceret akut respons gener til forringe apoptotiske veje, etc
[5]. Selv om MDR mekanismer er blevet grundigt undersøgt, de vigtigste determinanter for dette fænomen forbliver stort set uklar.

MikroRNA'er (miRNA) er en ny klasse af endogene små ikke-kodende RNA (19-23 nukleotider), der negativt regulerer gen udtryk på post-transkriptionel niveau ved perfekt eller ufuldkommen baseparring med den 3'-utranslaterede region (UTR) af target mRNA og derved inducere mRNA'er nedbrydning eller translation repression [6]. I øjeblikket har nye undersøgelser antydet eksistensen og betydningen af ​​miRNA i udviklingen af ​​anticancer lægemiddelresistens og miRNA ekspression profilering kan korreleres med udviklingen af ​​lægemiddelresistens [7] - [10], hvilket indikerer, at miRNA-medierede form af lægemiddelresistens tilføjer en anden mekanisme MDR. I vores tidligere undersøgelse blev det rapporteret, at to miRNA, miRNA-15b og miRNA-16, blev differentielt udtrykt i en multiresistent human gastrisk cancercellelinie SGC7901 /VCR og dets parentale cellelinje SGC7901 [11]. Det blev dog kun udføres på in vitro
niveau og kunne ikke afspejler de in vivo
oplysninger om funktioner miRNA i anticancer resistens.

Nylige fremskridt i molekylær billeddannelse teknikker tillader ikke-invasivt visualisering af normale og unormale cellulære processer i levende fag på det molekylære niveau snarere end på den anatomiske niveau [12]. Adskillige ikke-invasive strategier, såsom anvendelse af et fluorescerende protein, luciferase reportergen, nucleolin aptamer eller fluorescerende molekylære beacon konjugeret nanopartikel, er blevet udviklet til at overvåge ekspressionsmønstre for forskellige miRNA under carcinogenese, neurogenese eller myogenese in vitro
in vivo
[13] - [16]. Den foreliggende undersøgelse var at indføre en noninvasiv metode til overvågning miRNA-16 i kemoresistens af gastrisk cancer gennem en dobbelt billeddannelse reportergen, i hvilket human natriumiodid symporter (hNIS) og ildflue luciferase (Fluc) gener blev bundet til et fusionsgen for bioluminescens billedbehandling og ^{99mTc-pertechnetat gammakamera imaging in vivo
.}

Materialer og metoder

Dyr

specifik patogenfrie 8-ugers -Gamle BALB /c nøgne mus blev opnået fra Shanghai Animal center i Kina og opdrættet i den fjerde Military Medical University dyr center, Kina. Alle forsøgsdyr blev huset under specifikke patogenfrie betingelser. Dyret protokoller, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af den fjerde Military Medical University Board etisk vurdering. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den fjerde Military Medical University Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr formuleret af National Society for Medical Research.

Reagenser og antistoffer

Mus monoklonalt antistof mod hNIS (ab17795) blev købt fra Abcam. Kanin polyklonalt antistof specifikt for Bcl-2 blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-KB-inhibitor) og SB203580 (p38 MAPK hæmmer) blev opnået fra Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina). De anticancer lægemidler, herunder vincristin (VCR), etoposid (VP-16), mitomycin C (MMC), cisplatin (CDDP) blev 5-fluorouracil (5-FU) og Adriamycin (ADR) købt fra Wolsen Bioteknologi (Xi'an, Kina). Den GV260-Fluc-puro lentivirus plasmid blev opnået fra Shanghai GeneChem Company (Shanghai, Kina). Alle celledyrkningsmedier og serum blev indkøbt fra Gibco (Grand Island, NY).

Dual reportergen plasmidkonstruktion

Den kodende sekvens for hNIS genet blev amplificeret ved PCR fra et plasmid venligst leveret af Dr. Weidong Yang (fjerde Military Medical University, Kina) ved hjælp af følgende primere:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

til konstruktion af en dobbelt ekspressionsvektor, cDNA'et af hNIS genet blev indsat i BamH
i og Alder
i restriktionsenzymsteder af en lentiviral vektor GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Kina) der koder for et Fluc gen under kontrol af den ubiquitin-promotoren. Den resulterende dobbelte udtryk konstruktion GV260-hNIS /Fluc blev yderligere bruges til at generere GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plasmid. Tre eksemplarer af komplementære sekvenser mod miRNA-16 (3xmir16) blev indsat efter stopkodonet af hNIS /Fluc fusion gen til at generere GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (figur 1A). En forvrænget nukleotidsekvens af tilsvarende længde til 3xmir16 blev også indsat i 3'UTR af hNIS /Fluc fusion gen for at opnå en kontrol konstruktion (GV260-hNIS /Fluc-scramble. Den 3xmir16 sekvens eller scramble sekvens blev opnået ved annealing følgende oligonukleotider :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

mavekræft cellekultur og stabil cellelinie generation

Menneskelig mavekræft cellelinje SGC7901 og dens multiresistente variant SGC7901 /VCR (etableret og opretholdt i vort laboratorium som tidligere beskrevet [11]) blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og 100 enheder penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen ). For at opretholde den MDR-fænotype, vincristin (med slutkoncentration på 1 ug /ml) blev tilsat til dyrkningsmediet til SGC7901 /VCR-celler. For at generere en stabil cellelinie, lentivirus vektor GV260-hNIS /Fluc eller GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 blev først cotransficeret ind i 293T-celler med emballage plasmider ( gag, pol, VSV-g
). Vækstmediet blev ændret ved 6 timer efter transfektion og lentivirus-holdige supernatant blev høstet ved 48 timer post-transfektion. Høstede supernatanter blev centrifugeret ved 4.000 g i 10 minutter for at pelletere celledebris. Koncentreret virus titreredes på 293T-celler. SGC7901 celler og SGC7901 /VCR-celler blev transduceret med GV260-hNIS /Fluc og GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 virus henholdsvis ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10. Derefter blev cellerne screenes med puromycin i 3 uger og cellekolonier blev indsamlet til udvidet til næste trin eksperimenter

RNA oligoer og transfektion

miRNA-16 og negative kontrol (NC) RNA oligoer blev syntetiseret (Shanghai GenePharma, Kina) ved hjælp af følgende sekvenser.:

miRNA-16 forstand: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC forstand: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Før transfektion blev SGCC7901 celler podet ved 1 x 10 ^{5 celler per brønd i en plade med 24 brønde og vokser i 24 timer. Transfektion blev udført med lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Alle transfektion blev udført tre gange.}

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) analyse

Totalt RNA blev isoleret fra de dyrkede celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen). RT blev udført med PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japan) og qPCR blev udført med Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) og ABI StepOne Plus Real-time PCR-system (Applied Biosystems) ifølge producentens protokol . PCR-produkter blev analyseret på 3% agarosegeler. Den relative mængde af miRNA-16 blev normaliseret til U6 snRNA. Og den relative mængde af Fluc blev normaliseret til GAPDH-genet. Den fold-ændring for miRNA-16 eller Fluc gen fra eksperiment gruppe i forhold til kontrolgruppen blev beregnet ved hjælp af 2 ^{-ΔΔCt metode, hvor ΔΔCt = ACt eksperiment - ACt kontrol og ACt = Ct miRNA - Ct U6 eller ACt = ct Fluc - ct GAPDH. PCR blev udført tre gange. De anvendte primere til hårnåle-RT-PCR for miR-16 er som følger:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

mIR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

mIR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '

mIR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot-analyse

SGC7901 celler blev vasket tre gange med PBS og derefter lyseret i koldt lysepuffer (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCI [pH 7,4], 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1% Triton X-100 og 1% aprotinin) i 30 min på is. Cellelysater blev derefter centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet og identiske mængder protein blev opløst ved 8% SDS-PAGE og overført derefter til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev inkuberet i blokerende opløsning indeholdende 5% BSA i 1 time ved stuetemperatur, og derefter immunoblottedes med viste antistoffer. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af en forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

MTT assay

For at bestemme vækstrater NF-tom, NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR-celler, blev disse tre typer celler podet i 96-brønds plader med de samme numre (5000 celler) per brønd. På forskellige tidspunkter (24, 48, 72, 96 h), 25 pi 5,0 mg /ml sterilt filtreret 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5- diphenyl tetrazoliumbromid (MTT; Sigma) blev tilsat til hver brønd. Den ikke-omsatte farve blev fjernet efter 4 timers inkubation, og de uopløselige formazan krystaller blev opløst i 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO). Absorbansen ved 570 nm (referencebølgelængde, 630 nm) blev målt med en Synergy II multimode mikropladelæser (BioTech Instruments, VT).

Radioaktivt iodid optagelse assay

For at identificere forholdet mellem iodid optagelse og celleantal, en fortyndingsserie af cellerne blev podet i plader med 24 brønde. Efter 12 timers inkubation blev ^{131I optagelse niveau undersøgt. Iodidet optagelse blev bestemt ved at inkubere cellerne med 500 pi Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) indeholdende 0,5% bovint serumalbumin med 37 kBq af carrier-free Na 131I og 10 mM NaI i 30 minutter. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange så hurtigt som muligt med 1 ml iskold HBSS buffer. Celler blev løsnet med 200 pi trypsin, og radioaktiviteten blev målt med en γ-tæller (Perkin-Elmer). For at evaluere den funktionelle ekspression af hNIS i reportergensystemet blev NF-3xmir16 celler podet ind på 1 × 10 5 celler per brønd i en plade med 24 brønde dagen før transfektion, derefter miRNA-16 og NC-oligoer blev transficeret . 24 timer senere blev den iodid optagelsen målt som beskrevet ovenfor.}

In vitro
bioluminescens imaging assay

For at identificere forholdet mellem luminescens signaler og celletal, en fortyndingsrække af celler blev inokuleret i 24-brønds plader. Efter 12 timers inkubation blev hver brønd vasket med phosphat-beffered saltvand (PBS). Derefter D-Luciferin (Xenogen) i en koncentration på 0,5 mmol /l blev straks tilsat før assay. Bioluminescens blev målt med en IVIS 100 Imaging-system (Xenogen) og analyseret ved hjælp af Living billede softwareversion 2,50 (Xenogen). For at evaluere den funktionelle ekspression af Fluc i reportergensystemet blev NF-3xmir16 celler podet ind på 1 × 10 ^{5 celler per brønd i en plade med 24 brønde dagen før transfektion, derefter miRNA-16 og NC-oligoer blev transficeret . 24 timer senere blev bioluminscensassayet målt som beskrevet ovenfor.}

selvlysende og 99mTc-pertechnetat billeddannelse i nøgne mus

Lige numre (5 × 10 ^{6 celler) af NF-tom og NF-3xmir16, eller NF-3xmir16 /VCR og NF-3xmir16 celler, var xenotransplanteret subkutant i venstre og højre bagben flanke af hver nøgen mus som vist i resultaterne. Bioluminescent billeddannelse blev erhvervet en dag efter celle injektion. Alle mus blev bedøvet med 2,5% isofluran gas i oxygen ved en strømningshastighed på 1,5 l /min. En vandig opløsning af D-luciferin (150 mg /kg legemsvægt) blev injiceret perkutant 10 min før billeddannelse. De hele kroppen billeder for Fluc signaler blev erhvervet i 2 minutter og Living Billede software (Xenogen) kørte for at opnå selvlysende billeder. En ROI blev valgt manuelt over signalintensitet. Bioluminescens signaler udtrykkes som fotoner per sekund per kubikcentimeter pr steradian (p /sek /cm 2 /sr) inden for en ROI.}

For nuklear billeddannelse, tumoren bærende mus blev intraperitonealt injiceret med 18,5 MBq af ^{99mTc-pertechnetat ved 2 uger efter celleinjektion. 30 min efter injektion blev dyret anbragt i en spread rygleje på sengen af ​​SPECT scanner (Symbia T2, Siemens). Anæstesi blev udført med 1% -2% isofluran i 100% O _{2 under injektion og billeddannelse. Alle billeder blev rekonstrueret med en 2-dimensional bestilt-delmængder forventning maksimal algoritme. Aktiviteten blev kvantificeret ved at se på områder af interesse (ROI) i tumorerne og arealet af ROI blev holdt konstant for alle nukleare og optiske billeder. Efter bioluminescerende og 99mTc-pertechnetat billeddannelse, blev tumorerne opsamlet og vejet.}}

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middel ± SD. Data, der viser sammenligninger mellem to grupper blev vurderet ved anvendelse af t-test. Sammenligninger mellem mere end to grupper blev vurderet ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) med den passende posthoc test. P-værdier. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Etablering af gastrisk kræft cellelinjer stabilt udtrykker hNIS og Fluc gener

For at generere en fusion reporter gen (GV260- hNIS /Fluc, nævnt NF-tom), den hNIS cDNA blev klonet ind i en lentivirusvektor (GV260-Fluc-puro) kodende for et Fluc gen til at generere et fusionsprotein, som var under kontrol af ubiquitin-promotoren. Så tre kopier af komplementære sekvenser mod miRNA-16 (3xmir16) blev indsat efter stopkodonet af hNIS /Fluc fusion gen til at generere en anden konstruktion (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, henvist til NF-3xmir16) (figur 1A). En forvrænget nukleotidsekvens af tilsvarende længde til 3xmir16 blev også indsat i 3'UTR af hNIS /Fluc fusion gen for at opnå en kontrol konstruktion (GV260-hNIS /Fluc-kamp, ​​henvist til NF-scramble). In vitro
bioluminescens imaging viste, at Fluc gen aktivitet fra NF-tomme celler var den samme som fra NF-kapløbet celler (Figur S1A). Så vi vælger NF-tomme konstruktionen i yderligere undersøgelse. To cellelinjer, et MDR human gastrisk cancercellelinie SGC7901 /VCR og dets parentale cellelinje SGC7901, blev transduceret med lentivirus indeholdende NF-tomme eller NF-3xmir16 gen henholdsvis at etablere tre stabile cellelinjer NF-tom /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 og NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (henvist til NF-tom, NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR). Først udførte vi MTT-analysen til at måle vækst i disse tre cellelinier (Figur S1B). Så perfomed vi qPCR assay til at undersøge de integrerede kopier af reporterkonstruktioner i de tre cellelinier (Figur S1c). In vitro
bioluminescens imaging (figur 1B) og Western blotting (figur 1C) blev yderligere udført for at demonstrere den vellykkede udtryk for Fluc og hNIS gener i disse tre cellelinjer.

Linearitet korrelation af Fluc og hNIS transgene aktiviteter med celletal in vitro

for at evaluere de Fluc og hNIS transgene aktiviteter i celler, udførte vi in vitro
bioluminescens billedbehandling og ^{131I radioiodide uptake assays i en fortyndingsserie af NF-3xmir16 cellelinier. Som vist i figur 1 D, ifølge stigninger i antallet af celler, ophobning af luminescens også steget. Bioluminescens signaler blev fundet at korrelere godt med celleantal (γ 2 = 0,9990) (Figur 1E). I mellemtiden blev 131I optagelse også steget med celle tal (figur 1F). Den radioiodide optagelse blev observeret godt korreleret (γ 2 = 0,9543) med celletal (Figur 1G). Fordi Fluc blev fusioneret med hNIS, en brønd korrelation mellem bioluminescens intensitet og 131I radioaktivitet blev bemærket i celler ifølge den lineære regressionsanalyse (γ 2 = 0,9339) (figur 1 H).}

Validering af miRNA-16 aktiviteter via
reportergenet systemet

for at teste, om NF-3xmir16 reporter vektor, der indeholder miRNA-16 målsekvenser blev undertrykt af eksogen miRNA-16, vi undersøgte Fluc og hNIS aktivitet efter indføre miRNA-16. Sammenlignet med celler transficeret med NC oligoer blev den bioluminescens signal faldt med 35% i de celler transficeret med miRNA-16 (figur 2A og 2B). Og ^{131I radioiodide optagelse i miRNA-16 transficerede celler var ca. 70% af det i NC-transficerede celler kvantificeret ved radioaktiv tælling (Figur 2C). Og Fluc og hNIS aktivitet blev reduceret på en dosisafhængig måde (figur S1D-F). Disse data viste, at NF-3xmir16 reporter konstruktion kunne moduleres af miRNA-16.}

Påvisning af endogen miRNA-16-ekspression in vitro
in vivo

for at opdage den endogene miRNA-16 ekspressionsniveauet i gastriske kræftceller in vitro
, lige mange (1 × 10 ^{6) af NF-tom og NF-3xmir16 celler blev podet og derefter den Fluc og hNIS aktivitet blev undersøgt. Som vist i figur 2D og 2E, blev Fluc aktiviteten som følge af NF-3xmir16 celler faldt med omkring 50% af endogen miRNA-16 sammenlignet med det fra NF-tomme celler. Og hNIS aktivitet fra NF-3xmir16 celler blev også reduceret med ca. 40% som reaktion på endogent miRNA-16 i modsætning til, at der fra NF-tomme celler (figur 2F). Manglen på undertrykkelse af Fluc eller hNIS aktiviteter observeret i NF-tomme celler er i forbindelse, at der ikke var nogen miRNA-16 målområder i NF-tom konstruktion.}

Den dobbelte imaging reportergensystemet aktiveret i vivo
visualisering af endogen miRNA-16-ekspression i mavens kræftceller. Lige antal (1 x 10 ^{7) af NF-tomme og NF-3xmir16 celler blev xenotransplanteret subkutant i venstre og højre bagben flanker af hver nøgen mus (n = 6) og derefter bioluminescerende billeddannelse og 99mTc-pertechnetat gammakamera imaging blev erhvervet. Som vist i figur 2G, luminescens intensitet fra implanterede NF-3xmir16 celler var ca. 55% lavere end fra NF-tomme celler, på lignende måde som differens af luciferaseaktiviteter målt in vitro
(Figur 2D og 2E). Efter intraperitoneal injektion af 99mTc-pertechnetat på 18,5 MBq, blev gammakamera billeddannelse udført. I modsætning til NF-tomme tumorer, som viste fremtrædende optagelse af 99mTc-pertechnetat viste NF-3xmir16 tumorer ubetydelig optagelse (Figur 2H), hvilket indikerer endogene miRNA-16 reducerede hNIS udtryk. Fysiologisk optagelse blev også observeret på stederne for skjoldbruskkirtlen, maven og blære, hvori hNIS normalt udtrykkes. Regioner af interesse (ROI) analyse viste, at hNIS aktivitet faldt betydeligt i NF-3xmir16 xenografter sammenlignet med i NF-tomme xenografter (Figur 2H). Efter billeddannelse, vi samlet og afvejet NF-tomme og NF-3xmir16 tumorer (figur S1G). Resultaterne viste at de havde de samme vægte, viste, at forskellene i signal intensitet er faktisk skyldes endogen miRNA-16 funktion, men ikke celle tal.}

Visualisering af udtryk ændring af miRNA-16 i MDR gastrisk kræftceller In vitro
in vivo

blev opdaget udtrykket ændring af miRNA-16 i lægemiddelresistente gastriske kræftceller via
Fluc og hNIS aktivitet ved bioluminescens billedbehandling og ^{131I radioiodide uptake assays. Både Fluc aktivitet (figur 3A og 3B) og hNIS aktivitet (figur 3C) steg med ca. 1,5 gange i NF-3xmir16 /VCR-celler i sammenligning med den i NF-3xmir16 celler, som foreslået, at miRNA-16 blev nedreguleret i NF-3xmir16 /VCR celler. For at bekræfte resultaterne opnået ved reportergensystemet blev kvantitativ RT-PCR (Q-PCR) gennemføres med analyse den differentielle ekspression af miRNA-16 i disse to cellelinier. I overensstemmelse med systemdata reporter gen, viste Q-PCR faldt miRNA-16 niveauer i NF-3xmir16 /VCR i forhold til sin modpart NF-3xmir16 celler (figur 3D).}

For ikke-invasiv kvantitativ overvågning af miRNA- 16 differentiel ekspression i MDR gastrisk kræftceller i vivo
, bioluminescerende billeddannelse og ^{99mTc-pertechnetat gammakamera billeddannelse blev udført. Bioluminescerende billeddannelse viste, at luminescens signaler var omkring 1,7 gange stigninger i NF-3xmir16 /VCR implanteret versus NF-3xmir16 xenografter (figur 3E), i overensstemmelse med de stigninger i luciferaseaktivitet målt in vitro
(figur 3A og 3B). Injektionen af ​​ 99mTc-pertechnetat og erhvervelse af gammakamera imaging viste, at en signifikant højere ophobning af 99mTc-pertechnetat blev observeret i NF-3xmir16 /VCR xenografter end i NF-3xmir16 xenografter. Fysiologiske 99mTc-pertechnetat ophobninger blev også observeret i skjoldbruskkirtlen, blære og mave (figur 3F). Og NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR tumorer havde de samme vægte (fig S1H).}

VP-16 og 5-FU opregulering af miRNA-16-ekspression ikke-invasivt afbildet af dobbelte reportergensystemet

for at bestemme om andre lægemidler mod cancer kunne ændre miRNA-16 udtryk profil, fem kliniske medicin til mavekræft blev sat til NF-3xmir16 celler efterfulgt af in vitro
bioluminescens billedbehandling og ^{131I radioiodide optagelse assays. Resultaterne viste, at luminescensintensitet (figur 4A og 4B) eller det cellulære iodid optagelse (fig 4E) var stærkt reduceret eksponering for VP-16, 5-FU og CDDP, men ikke til MMC og ADR behandling sammenlignet med de ikke-behandlede celler.}

årsagerne til den faldende signal observeret i VP-16, 5-FU og CDDP behandling kunne være, at de lægemidler, aktiverede endogene miRNA-16 udtryk eller hæmmet cellulær vækst selv forårsagede celledød. For at udelukke sidstnævnte mulighed blev de fem lægemidler føjet til NF-tomme celler, som indeholder ingen miRNA-16 mål steder i konstruktionen. in vitro
bioluminescens imaging resultater viste, at VP-16 og 5-FU havde ingen inhibitorisk virkning på luminescensintensitet, hvorimod CDDP stadig reduceret luminescens signal (figur 4C og 4D), hvilket indikerer, at CDDP kan hæmme cellulær vækst, men ikke aktivere endogene miRNA-16-ekspression. På den anden side, MMC og ADR viste sig at stige lidt luminescens intensitet i både NF-3xmir16 og NF-tomme celler (figur 4A-D), hvilket kan skyldes at fremme celleproliferation.

For at kontrollere, at miRNA-16 aktivering deltog i anticancer effekter fra VP-16 og 5-FU, Q-PCR blev udført for at bestemme miRNA-16 niveau i NF-3xmir16 eksponering celler til anticancerlægemidler behandlinger. Derfor blev miRNA-16-ekspression opreguleret markant efter VP-16 eller 5-FU behandlinger i SGC7901 celler sammenlignet med de ubehandlede kontrol celler, mens MMC, ADR og CDDP havde mindre effekt på miRNA-16-ekspression (figur 4F).

Øget miRNA-16 udtryk fra VP-16 og 5-FU er involveret i p38 MAPK men NF-KB-signalvejen

Svarende til modulering af protein-kodende RNA-gener, transkription af miRNA gener synes at reguleres ved multiple signalveje. Aktivering af NF-KB eller MAPK signalveje er en fælles respons efter kemoterapeutiske lægemidler [17], [18]. Derfor fremsatte vi den hypotese, at opregulering af miRNA-16 kan være et resultat af øget NF-KB eller MAPK-aktivering efter VP-16 eller 5-FU-behandling. For at belyse den rolle, som disse signalveje i VP-16 og 5-FU-induceret transaktivering af miRNA-16, vi først målte luminescens intensitet i NF-3xmir16 celler som respons på VP-16 og 5-FU i nærvær eller fravær af farmakologiske hæmmere til NF-KB eller p38 MAPK. Behandling af celler med en specifik NF-KB inhibitor, Bay 11-7082, havde ingen virkning på den luminescens signal sammenlignet med lægemiddelbehandlede celler uden inhibitorer (fig S2).

I modsætning hertil behandling med et specifikt p38 MAPK inhibitor, SB203850, markant reddet faldet i bioluminescens (figur 5A og 5B) eller iodid optagelse (figur 5C) af VP-16 og 5-FU sammenlignet med de behandlede kontrolceller. For at bekræfte miRNA-16 ekspressionsniveau i nærvær af SB203850, real time PCR blev udført, og resultaterne viste, at inhiberende af p38 MAPK drastisk undertrykt VP-16 og 5-FU-induceret miRNA-16 opregulering (figur 5D), hvilket indikerer, at den øgede miRNA-16 ekspression af VP-16 og 5-FU er involveret i p38 MAPK-signalvejen.

Vores tidligere undersøgelse har vist, at Bcl-2-protein er en direkte målgen af ​​miRNA-16 i udviklingen af MDR i SGC7901 gastriske cancerceller [11]. For at teste om Bcl-2 er involveret i VP-16 og 5-FU stimulering af miRNA-16 via
p38 MAPK vej, vi bestemt Bcl-2 protein niveau ved western blot analyse. Som vist i figur 5E og 5F, VP-16 og 5-FU nedsatte signifikant Bcl-2-protein niveau med omkring 50% sammenlignet med den ubehandlede kontrol celler i fravær af SB203850. Ved behandling sammen med SB203850, faldt Bcl-2-protein blev drastisk svækket, hvilket antyder vigtigheden af ​​p38 MAPK-aktivering i VP-16 og 5-FU-induceret nedregulering af Bcl-2-protein.

In vivo
overvågning af forbedret miRNA-16-ekspression af VP-16 og 5-FU

for ikke-invasiv overvågning af forbedret miRNA-16-ekspression induceret af VP-16 og 5-FU, NF-tom og NF -3xmir16 celler blev podet på venstre og højre bagben på hver mus (n = 6), hhv. At undgå bioluminescens signal fra NF-tomme interfererende med det fra NF-3xmir16 i løbet af lægemiddelbehandling, forskellige antal NF-tomme (1 × 10 ^{5 celler) og NF-3xmir16 (1 × 10 7-celler) blev podet. Som vist i figur 6, blev signifikant reduceret bioluminescens intensitet observeret i NF-3xmir16 xenotransplantater efter VP-16 eller 5-FU behandling sammenlignet med nontreatment. Især i mus behandlet med VP-16, den bioluminescens signal reduceret med omkring 40% i NF-3xmir16 xenotransplantater mens steg en smule i NF-tomme xenografter versus forbehandlede billeder (figur 6a og 6b), på samme måde for forskellen af ​​luminescens intensitet forårsaget af VP-16 in vitro
(figur 4A-D).}

• PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p Fungerer som en tumorsuppressor i Gastric Cancer og reguleres af DNA-methylering
• PLoS ONE: associering mellem glutathion S-transferase T1 Null Genotype og Gastric Cancer Risk: En metaanalyse af 48 studier