PLOS ONE: Visualização não invasiva de MicroRNA-16 na chemoresistance de câncer gástrico Usando um Dual Reporter Gene imagem System

Abstract

Os microRNAs (miRNAs) foram implicados a desempenhar um papel central no desenvolvimento de resistência aos medicamentos numa variedade de malignidades. No entanto, muitos estudos foram realizados no in vitro
nível e não poderia fornecer o in vivo
informações sobre as funções dos miRNAs na resistência droga anticâncer. Aqui, nós introduzimos um sistema duplo gene repórter de imagem para monitorar de forma não invasiva a expressão cinética de miRNA-16 durante chemoresistance no câncer gástrico ambos in vitro
e in vivo
. symporter humana iodeto de sódio (hNIS) e genes de luciferase de pirilampo (Fluc) foram ligados para formar Fluc gene repórter de fusão hNIS /casal e, em seguida, gerar linha de células de câncer gástrico humano NF-3xmir16 e sua linha de células de resistência a múltiplas drogas NF-3xmir16 /VCR. captação radioiodide e sinais de luminescência FLUC in vitro
correlacionados bem com o número de células viáveis. A captação de actividades de luciferase e radioiodide em células NF-3xmir16 foram extremamente reprimida por exógena ou endógena miRNA-16. A NF-3xmir16 /células VCR mostraram um aumento significativo de ^{captação de 131I e luminescência intensidade em comparação com células NF-3xmir16. A radioatividade de in vivo
99m-pertecnetato de imagem e a intensidade da imagem de bioluminescência foram também aumentadas em NF-3xmir16 /VCR em comparação com a de xenoenxertos de tumores NF-3xmir16. Além disso, utilizando este sistema de gene repórter, descobrimos que etoposido (VP-16) e 5-fluorouracil (5-FU) activado miRNA-16 expressão in vitro
e in vivo
e a regulação positiva de miRNA-16 é p38MAPK dependente, mas NF-kB independente. Este gene repórter de imagem de dupla pode ser servido como uma nova ferramenta para in vivo
imagem de microRNAs no chemoresistance de cânceres, bem como para a detecção precoce e diagnóstico na clínica}

Citation:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Visualization não invasiva de MicroRNA-16 na chemoresistance de câncer gástrico Usando um Gene Imaging System dupla Reporter. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 13 de março de 2013; Publicação: 17 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Programa Nacional de Pesquisa básica e Desenvolvimento da China (973), Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, o National Natural Science Foundation da China sob Grant Nos. 81090272, 81090274, 81227901, Inovação Equipe de Desenvolvimento Grant pelo Departamento China da Educação (2010CXTD01), Programa 863 da China (2012AA02A603) e do Programa de Apoio à Tecnologia Key Nacional, Grant No. 2012BAI23B06. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Xiaoyuan Chen serve como um editor da revista. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer gástrico continua a ser a primeira causa de morte por câncer na China e a quarta mais comum malignidade em todo o mundo, apesar de uma diminuição dramática em sua mortalidade e morbidade ao longo das últimas três décadas [1]. A quimioterapia tem sido amplamente utilizada para tratar tanto cancro gástrico operável e avançado, conduzindo a uma melhoria na sobrevivência global, bem como a qualidade de vida dos pacientes [2], [3]. No entanto, a quimioterapia de longo prazo, muitas vezes não consegue eliminar todas as células de tumor por causa da intrínseco ou adquirido de multirresistência (MDR), que é a causa mais primário da recorrência do tumor [4]. Actualmente, a MDR tem sido considerada como um fenómeno multifactorial envolvendo vários mecanismos principais, incluindo o aumento do metabolismo de drogas, diminuição da absorção de fármacos solúveis em água, os alvos de drogas alterados, reduzida concentração de droga intracelular por bombas de efluxo, alteradas pontos de verificação do ciclo celular e induzida emergência genes de resposta a prejudicar vias apoptóticas, etc
[5]. Embora os mecanismos de MDR foram amplamente exploradas, os principais determinantes desse fenômeno permanecem em grande parte obscura.

Os microRNAs (miRNAs) são uma nova classe de pequenos RNAs não-codificantes endógenos (19-23 nucleotídeos) que regulam negativamente a expressão dos genes em o nível pós-transcricional por base emparelhamento perfeito ou imperfeito com a região 3 'não traduzida (UTR) de mRNAs alvo e, assim, induzir mRNAs degradação ou tradução repressão [6]. Actualmente, os estudos emergentes sugerem a existência e a importância de miARNs na evolução da resistência de fármacos no tratamento e miARNs perfil de expressão podem ser correlacionados com o desenvolvimento de resistência ao fármaco [7] - [10], o que indica que a forma de resistência às drogas miARNs-mediadas acrescenta um outro mecanismo de MDR. No nosso estudo anterior, foi relatado que dois miARNs, miARN-15b e miARN-16, foram diferencialmente expressos em uma linha celular de cancro gástrico humano multirresistente SGC7901 /VCR e a linha celular parental SGC7901 [11]. No entanto, ele foi realizado apenas no in vitro
nível e não podia reflectir as em informações vivo
sobre as funções dos miRNAs na resistência droga anticâncer.

Os recentes avanços em técnicas de imagem molecular permite a visualização de forma não invasiva de processos celulares normais e anormais em indivíduos que vivem no nível molecular em vez de no nível anatômico [12]. Várias estratégias não invasivas, tais como a utilização de uma proteína fluorescente, gene repórter luciferase, aptâmero nucleolin ou fluorescente farol molecular nanopartículas conjugada, foram desenvolvidos para monitorar os padrões de expressão de vários miRNAs durante a carcinogênese, neurogenesis ou myogenesis in vitro Comprar e in vivo
[13] - [16]. O presente estudo foi a introdução de um método não invasivo para monitorar miRNA-16 na chemoresistance de câncer gástrico através de um sistema de gene repórter dupla imagem latente em que o iodeto humana de sódio symporter (hNIS) e luciferase de pirilampo (FLUC) genes foram ligados a um gene de fusão para bioluminescência imagem e ^{99m-pertecnetato imaging câmara gama in vivo
.}

Materiais e Métodos

Animais

Specific livre de patógenos de 8 semanas feminino -old ratinhos BALB /c nus foram obtidos a partir do centro de animal Shanghai na China e criado no centro de animais da Quarta Militar Medical University, China. Todos os animais experimentais foram alojados em condições específicas livres de patógenos. Os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pela Quarta Universidade Médica Militar Revisão Ética Board. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Médico da Universidade Militar da Quarta para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica.

Reagentes e anticorpos

anticorpo monoclonal de ratinho contra hNIS (ab17795) foi adquirido a partir de Abcam. anticorpo policlonal de coelho específico para Bcl-2 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (inibidor de NF-kB) e SB203580 (p38 MAPK inibidor) foram obtidos a partir de Beyotime Instituto de Biotecnologia (Xangai, China). Os fármacos anti-cancerígenos, incluindo a vincristina (VCR), etoposido (VP-16), mitomicina C (MMC), cisplatina (CDDP), 5-fluorouracilo (5-FU) e adriamicina (ADR) foram adquiridos a Wolsen Biotecnologia (Xian, China). O plasmídeo lentivírus GV260-Fluc-puro foi obtido a partir de Xangai GeneChem Company (Xangai, China). Todos os meios de cultura de células e soro foram adquiridos de Gibco (Grand Island, NY).

plasmídeo do gene repórter duplo construir

A sequência de codificação do gene hNIS foi amplificado por PCR a partir de um plasmídeo gentilmente fornecida por Dr. Weidong Yang (Quarta Universidade médica Militar, China) utilizando os seguintes iniciadores:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

Para a construção de um vector de expressão dupla, o cDNA do gene hNIS foi inserido no
BamH I e locais de enzimas de restrição Age I
de um vector lentiviral GV260 -Fluc-Puro (Xangai GeneChem, China) que codifica um gene de Fluc sob o controlo do promotor de ubiquitina. A construção de expressão dupla GV260-hNIS /Fluc resultante foi ainda utilizado para gerar GV260-hNIS plasmídeo /Fluc-3xmir16. foram inseridos três cópias de sequências complementares contra miARN-16 (3xmir16) após o codão de paragem do gene de fusão hNIS /Fluc para gerar GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (Figura 1A). Uma sequência de nucleótidos mexidos de comprimento semelhante ao 3xmir16 foi também inserido na 3'UTR do gene de fusão hNIS /Fluc obter uma construção de controlo (GV260-hNIS /Fluc-precipitação. Obtiveram-A sequência 3xmir16 sequência ou precipitação por recozimento das seguintes oligonucleótidos :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

cultura de células de câncer gástrico e geração de linha de células estável

linha de células de câncer gástrico humano SGC7901 e sua multirresistente variante SGC7901 /VCR (estabelecido e mantido no nosso laboratório, como descrito anteriormente [11]) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 100 unidades de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen ). Para manter o fenótipo MDR, vincristina (com concentração final de 1 ug /ml) foi adicionada ao meio de cultura para células SGC7901 /VCR. Para gerar linha de células estável, lentivírus vetor GV260-hNIS /Fluc ou GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 foi co-transfectado primeiro em células 293T com embalagens plasmídeos ( gag, pol, VSV-G
). O meio de crescimento foi alterado a 6 h após a transfecção e o sobrenadante contendo lentivírus foi colhidas às 48 h pós-transfecção. Os sobrenadantes colhidos foram centrifugadas a 4000 g durante 10 min para sedimentar os detritos celulares. concentrados de vírus foi titulada em células 293T. SGC7901 células e células SGC7901 /VCR foram transduzidas com GV260-hNIS /Fluc e vírus GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 respectivamente a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Em seguida, as células foram rastreadas com puromicina durante 3 semanas e eram colónias de células coletadas para expandida para experiências seguintes passos

oligos de ARN e transfecção

O controle de miRNA-16 e negativo (NC) oligos de ARN foram sintetizados (Shanghai GenePharma, China) usando as seguintes sequências.:

miRNA-16 sentido: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sentido: 5'- CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC sentido
: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sentido: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Antes da transfecção, as células foram semeadas SGCC7901 em 1 × 10 ^{5 células por poço numa placa de 24 poços e crescem durante 24 h. A transfecção foi realizada com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Todos transfecção foram realizadas em triplicado.}

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), análise

O ARN total foi isolado a partir das células cultivadas usando Trizol (Invitrogen). RT foi realizada com PrimerScript RT Regent kit (Takara, Japão) e qPCR foi realizado com o Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) e ABI sistema de PCR em tempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante . Os produtos de PCR foram analisados ​​em géis de agarose a 3%. A quantidade relativa de miARN-16 foi normalizada para U6 snRNA. E a quantidade relativa de Fluc foi normalizado para o gene de GAPDH. O fold-change para o gene miRNA-16 ou Fluc do grupo experimento em relação ao grupo de controlo foi calculada usando a 2 ^{-ΔΔCt método, onde ΔΔCt = ΔCt experimento - controle ΔCt e ΔCt = Ct miRNA - Ct U6 ou ΔCt = Ct Fluc - Ct GAPDH. A PCR foi realizada em triplicado. Os iniciadores utilizados para a haste-laço RT-PCR para miR-16 estão listados a seguir:}

U6 Fw:

U6 Rev '
5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

miR-16 Fw: '
5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3

miR-16 Rev: 5
'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

FLUC-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

FLUC-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot análise

SGC7901 células foram lavadas três vezes com PBS e depois lisadas em tampão de lise frio (20 mM de NaCl, Tris-HCl 200 [pH 7,4], fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 1% de Triton X-100 e 1% de aprotinina) durante 30 min em gelo. Os lisados ​​celulares foram depois centrifugados a 12000 rpm durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e quantidades idênticas de proteína foram separadas por 8% de SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas numa solução contendo 5% de BSA durante 1 h à temperatura ambiente o bloqueio, e, em seguida, coradas imunologicamente com anticorpos indicados. bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ).

Ensaio MTT

Para determinar as taxas de crescimento de NF-vazia, o NF-3xmir16 e NF-3xmir16 células /VCR, estes três tipos de células foram inoculadas em placas de 96 poços com os mesmos números (5000 células por poço). Em diferentes pontos de tempo (24, 48, 72, 96 h), 25 ul de 5,0 mg /ml estéril filtrada 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5- difenil-tetrazólio (MTT, Sigma) foi adicionado a cada poço. O corante que não reagiu foi removida após 4 h de incubação, os cristais de formazano e insolúveis foram dissolvidos em 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). A absorvância a 570 nm (comprimento de onda de referência, 630 nm) foi medida com um leitor de microplacas multimodo Synergy II (BioTech Instruments, VT).

captação de iodo radioativo ensaio

Para identificar a relação entre iodeto absorção e do número de células, uma série de diluições de células foram inoculadas em placas de 24 poços. Após 12 horas de incubação, foi examinado o nível de absorção ^{131I. A captação de iodeto foi determinada por incubação das células com solução salina equilibrada de 500 mL de Hanks (HBSS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino com 37 kBq de Na isento de transportador 131I e Nal 10 mM durante 30 min. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes tão rapidamente quanto possível, com 1 ml de tampão de HBSS arrefecido com gelo. As células foram descoladas com 200 ul de tripsina, e a radioactividade foi medida usando um contador-γ (Perkin-Elmer). Para avaliar a expressão funcional de hNIS no sistema de gene repórter, as células de NF-3xmir16 foram semeadas em em 1 × 10 5 células por poço numa placa de 24 poços um dia antes da transfecção, em seguida, miARN-16 e NC oligos foram transfectadas . 24 h mais tarde, a captação de iodeto foram medidos como descrito acima.}

In vitro
imagem de bioluminescência ensaio

Para identificar a relação entre os sinais de luminescência e os números de células, uma série de diluição de células foram inoculadas em placas de 24 poços. Após 12 h de incubação, cada poço foi lavado com solução salina beffered com fosfato (PBS). Em seguida, D-luciferina (Xenogen) a uma concentração de 0,5 mmol /L foi adicionado imediatamente antes do ensaio. Bioluminescência foi medida com um IVIS 100 sistema de tratamento de imagens (Xenogen) e analisados ​​utilizando o software Image estar versão 2.50 (Xenogen). Para avaliar a expressão funcional de Fluc no sistema de gene repórter, as células de NF-3xmir16 foram semeadas em em 1 × 10 ^{5 células por poço numa placa de 24 poços um dia antes da transfecção, em seguida, miARN-16 e NC oligos foram transfectadas . 24 horas depois, o ensaio de bioluminescência foi medida como descrito acima.}

Bioluminescent e imaging 99m-pertecnetato em ratinhos nus

Números iguais (5 × 10 ^{6 células) de NF-vazio e NF-3xmir16, ou NF-3xmir16 /VCR e células de NF-3xmir16, foram xenoenxertados subcutaneamente no flanco traseiro esquerdo e direito de cada ratinho nu, tal como indicado nos resultados. a imagem de bioluminescência foi adquirido um dia após a injeção de células. Todos os ratinhos foram anestesiados com isoflurano gás 2,5% em oxigénio a um caudal de 1,5 L /min. Uma solução aquosa de D-luciferina (150 mg /kg de peso corporal) foi injectado por via percutânea, 10 min antes de imagem. As imagens de corpo inteiro para sinais FLUC foram adquiridas por 2 min e Vivendo software de imagem (Xenogen) estava correndo para obter imagens bioluminescentes. A ROI foi selecionado manualmente sobre a intensidade do sinal. sinais de bioluminescência são expressos como fótons por segundo por centímetro cúbico por esterradiano (p /seg /cm 2 /sr) dentro de uma ROI.}

Para imagem nuclear, o tumor rolamento camundongos foram injetados intraperitonealmente com 18,5 MBq de ^{99m-pertecnetato em duas semanas após a injeção de células. 30 min após a injecção, o animal foi colocado numa posição supina de espalhamento sobre a cama do digitalizador SPECT (Symbia T2, Siemens). A anestesia foi efectuada com 1% -2% de isoflurano em 100% de O _{2 durante a injecção e de imagem. Todas as imagens foram reconstruídas com um-subconjuntos ordenados expectativa algoritmo máximo 2-dimensional. A actividade foi quantificada através da visualização das regiões de interesse (ROI) nos tumores e a área da ROI foi mantido constante para todas as imagens nucleares e ópticos. Após bioluminescente e imaging 99m-pertecnetato, os tumores foram colhidos e pesados.}}

A análise estatística

Os resultados são expressos como média ± SD. Dados mostrando comparações entre dois grupos foram avaliados utilizando o teste t de Student. As comparações entre mais de dois grupos foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) com o teste post hoc apropriada. P valores <. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

O estabelecimento de linhas celulares de cancro gástrico expressam de forma estável hNIS e genes FLUC

Para gerar um gene repórter de fusão (GV260- hNIS /Fluc, referido NF-vazio), o ADNc hNIS foi clonado num vector de lentivírus (GV260-Fluc-Puro) que codifica um gene de Fluc para gerar uma proteína de fusão, o qual estava sob o controlo do promotor de ubiquitina. Em seguida, três cópias de sequências complementares contra miARN-16 (3xmir16) foram inseridos a seguir ao codão de paragem do gene de fusão hNIS /Fluc para gerar outra construção (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, referido NF-3xmir16) (Figura 1A). Uma sequência de nucleótidos mexidos de comprimento semelhante ao 3xmir16 foi também inserido na 3'UTR do gene de fusão hNIS /Fluc obter uma construção de controlo (GV260-hNIS /Fluc-precipitação, referido NF-mistura). In vitro
bioluminescência de imagem mostraram que a atividade do gene Fluc a partir de células NF-vazias foi semelhante ao das células NF-Scramble (Figura S1A). Então, nós escolhemos a construção NF-vazia em um estudo mais aprofundado. Duas linhas celulares, um MDR humano gástrica linha celular de cancro SGC7901 /VCR e a linha celular parental SGC7901, foram transduzidas com o lentivírus contendo o NF-vazio ou o gene NF-3xmir16, respectivamente, para estabelecer três linhas celulares estáveis ​​de NF-vazio /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 e NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (referido NF-vazia, o NF-3xmir16 e NF-3xmir16 /VCR). Primeiro foi realizada ensaio de MTT para avaliar as taxas de crescimento destas três linhas celulares (Figura S1B). Em seguida, perfomed ensaio qPCR para investigar as cópias integradas de construções repórter nas três linhas celulares (Figura S1C). In vitro
bioluminescência imagiologia (Figura 1B) e Western blot (Figura 1C) foram ainda realizados para demonstrar a expressão bem sucedida de genes de Fluc e hNIS nestas três linhas de células.

correlação Linearidade de Fluc e as atividades de transgenes hNIS com o número de células in vitro

Para avaliar as atividades do transgene FLUC e hNIS em células, foi realizada in vitro
imagem de bioluminescência e ^{131I radioiodide ensaios de captação numa série de diluições das linhas celulares de NF-3xmir16. Tal como mostrado na Figura 1D, de acordo com o aumento do número de células, a acumulação de luminescência também aumentou. sinais de bioluminescência foram encontrados para correlacionar bem com o número de células (γ 2 = 0,9990) (Figura 1E). Enquanto isso, absorção 131I foi também aumentou com o número de células (Figura 1F). A captação radioiodide foi observada boa correlação (γ 2 = 0,9543) com o número de células (Figura 1G). Porque o Fluc foi fundido com hNIS, uma correlação bem entre a intensidade de bioluminescência e 131I radioatividade foi observado em células de acordo com a análise de regressão linear (γ 2 = 0,9339) (Figura 1H).}

validação de miRNA-16 atividades via
o sistema de gene repórter

a fim de testar se vector repórter NF-3xmir16 contendo miRNA-16 sequências alvo foi reprimida por miRNA-16 exógena, examinamos a atividade Fluc e hNIS após a introdução de miRNA-16. Em comparação com as células transfectadas com oligos de NC, o sinal de bioluminescência foram reduzidos em 35% nas culas transfectadas com miARN-16 (Figura 2A e 2B). E a absorção de iodeto radioactivo ^{131I em miARN-16 células transfectadas foi de aproximadamente 70% do que nas células transfectadas NC quantificada por contagem radioactiva (Figura 2C). E a actividade de Fluc e hNIS foram diminuídos de uma forma dependente da dose (Figura S1D-F). Estes dados indicam que a construção repórter NF-3xmir16 poderia ser modulada por miRNA-16.}

Detecção de endógena expressão miRNA-16 in vitro
e in vivo

Para detectar o nível de expressão endógena miRNA-16 em células cancerosas gástricas in vitro
, números iguais (1 × 10 ^{6) de NF-vazio e células NF-3xmir16 foram semeadas e, em seguida, a actividade de Fluc e hNIS foram examinados. Como mostrado na Figura 2D e 2E, actividade Fluc resultante a partir de células de NF-3xmir16 foi diminuída em cerca de 50% por endógeno miARN-16 em comparação com o que a partir de células de NF-vazias. E a actividade hNIS a partir de células de NF-3xmir16 também foi reduzida em cerca de 40% em resposta a miARN-16 endógeno em contraste com o que a partir de células de NF-vazias (Figura 2F). A falta de repressão de atividades FLUC ou hNIS observadas em células NF-vazias é no que diz respeito que não havia sítios-alvo de miRNA-16 em construção NF-vazio.}

O sistema de gene repórter de imagem de dupla habilitado em visualization vivo
de expressão miRNA-16 endógeno em células cancerosas gástricas. números iguais (1 × 10 ^{7) dos flancos traseiros NF-vazias e NF-3xmir16 células foram xenoenxertado por via subcutânea na esquerda e direita de cada ratinho nu (n = 6) e, em seguida, a imagem de bioluminescência e 99m-pertecnetato gamma imagens de câmera foram adquiridos. Como mostrado na Figura 2G, a intensidade da luminescência a partir de células de NF-3xmir16 implantados foram cerca de 55% mais baixa do que a partir de células de NF-vazia, de forma semelhante para a diferença de actividades de luciferase medido In vitro
(Figura 2D e 2E). Após a injecção intraperitoneal de 99mTc-pertecnetato em 18,5 MBq, foi realizada de imagens de câmara gama. Em contraste com a NF-vazia tumores, que mostrou absorção proeminente de 99m-pertecnetato, NF-3xmir16 tumores mostrou absorção desprezível (Figura 2H), indicando endógena miRNA-16 reduziu a expressão hNIS. absorção fisiológica também foi observado nos locais da tiróide, estômago e bexiga, em que hNIS é normalmente expresso. As regiões de interesse (ROI) análise mostrou que a actividade hNIS diminuiu significativamente em xenoenxertos de NF-3xmir16 comparada com a em xenoenxertos de NF-vazias (Figura 2H). Depois de imagem, foram coletadas e pesou os tumores NF-vazias e NF-3xmir16 (Figura S1G). Os resultados mostraram que eles tinham os mesmos pesos, indicou que as diferenças na intensidade do sinal são, de facto, devido à endógena função miRNA-16, mas não celular números.}

Visualização da mudança de expressão de miRNA-16 em células de câncer gástrico MDR in vitro
e in vivo

foi detectada a mudança expressão de miRNA-16 em células cancerosas gástricas resistentes aos medicamentos via
atividade Fluc e hNIS por imagem de bioluminescência e ^{131I ensaios de captação radioiodide. Tanto a actividade de Fluc (Figura 3A e 3B) e a actividade hNIS (Figura 3C) aumentou cerca de 1,5 vezes em células de NF-3xmir16 /VCR quando comparado com aquele em NF-3xmir16 células, o que sugeriu que miARN-16 foi regulada negativamente em NF-3xmir16 /células videocassete. Para verificar os resultados obtidos pelo sistema de gene repórter, RT-PCR quantitativa (Q-PCR) foi realizada a análise da expressão diferencial de miARN-16 nestas duas linhas celulares. De acordo com os dados do sistema de gene repórter, Q-PCR apresentaram diminuição miRNA-16 níveis em NF-3xmir16 /VCR em comparação com o seu homólogo NF-3xmir16 células (Figura 3D).}

Para o monitoramento quantitativo não invasivo de miRNA- expressão 16 diferencial de MDR células cancerosas gástricas em vivo
, a imagem de bioluminescência e ^{foram realizadas imagens câmara gama 99mTc-pertecnetato. A imagiologia bioluminescente demonstrado que os sinais de luminescência foram cerca de 1,7 vezes no aumento xenoenxertos de NF-3xmir16 /VCR contra xenoenxertos de NF-3xmir16 (Figura 3e), de acordo com os aumentos da actividade da luciferase medidos In vitro
(Figura 3A e 3B). A injeção de 99m-pertecnetato ea aquisição de imagens câmara gama indicou que uma significativamente maior acumulação de 99m-pertecnetato foi observado em xenotransplantes NF-3xmir16 /VCR do que na NF-3xmir16 xenotransplantes. Fisiológica acumulações 99mTc-pertecnetato também foram observadas na glândula da tiróide, da bexiga e do estômago (Figura 3F). E a NF-3xmir16 e NF-3xmir16 /tumores VCR tinha os mesmos pesos (Figura S1H).}

VP-16 e 5-FU regulação positiva de miRNA-16 expressão de forma não invasiva imaginada pelo sistema de duplo gene repórter

para determinar se outras drogas anticâncer poderiam alterar o perfil miRNA-16 expressão, cinco medicamentos clínicos para câncer gástrico foram adicionados a NF-3xmir16 células seguido de in vitro
bioluminescência imagem e captação radioiodide ^{131I ensaios. Os resultados revelaram que a intensidade de luminescência (Figura 4A e 4B) ou a captação de iodeto celular (Figura 4E) foram grandemente reduzida exposição ao VP-16, 5-FU e CDDP, mas não a MMC e o tratamento de ADR em comparação com as células não tratadas.}

as razões para o sinal de diminuição observado em VP-16, 5-FU e CDDP tratamento pode ser que as drogas activadas endógena miARN-16 de expressão ou o crescimento celular inibido ainda causou a morte celular. Para excluir a última possibilidade, os cinco medicamentos foram adicionados a células NF-vazia, que não contêm locais alvo miRNA-16 em construção. O in vitro
bioluminescência resultados de imagiologia demonstrado que a VP-16 e o ​​5-FU não tiveram nenhum efeito inibitório sobre a intensidade de luminescência, ao passo que a CDDP ainda reduziu o sinal de luminescência (Figura 4C e 4D), indicando que a CDDP pode inibir celular o crescimento, mas não activar endógena miARN-16 de expressão. Por outro lado, a MMC e ADR foram encontradas para aumentar ligeiramente a intensidade luminescente em ambas as células de NF-3xmir16 e NF-vazio (Figura 4A-D), que pode resultar de promoção da proliferação celular.

Para verificar se miARN-16 activação participou em efeitos anticancerígenos de VP-16 e o ​​5-FU, Q-PCR foram realizadas para determinar o nível de miARN-16 em NF-3xmir16 exposição células para tratamentos anticancerígenos drogas. Por conseguinte, miARN-16 de expressão foi significativamente regulada positivamente após tratamentos VP-16 ou 5-FU em SGC7901 células em comparação com as células de controlo não tratadas, enquanto MMC, ADR e CDDP teve efeito menor sobre miARN-16 expressão (Figura 4F).

Aumento de miARN-16 expressões por VP-16 e o ​​5-FU está envolvido em p38 MAPK mas NF-kB via de sinalização

similares para a modulação dos genes de ARN de codificação de proteínas, a transcrição de genes de miARN parece ser regulada por várias vias de sinalização. A activação das vias de sinalização de NF-kB ou MAPK é uma resposta comum seguintes fármacos quimioterapêuticos [17], [18]. Portanto, a hipótese de que a regulação positiva de miARN-16 pode ser um resultado do aumento de NF-kB ou a activação de MAPK após VP-16 ou tratamento com 5-FU. Para elucidar o papel destas vias de sinalização na VP-16 e a transactivação induzida por 5-FU de miARN-16, primeiro medida a intensidade de luminescência em NF-3xmir16 células em resposta a VP-16 e o ​​5-FU, na presença ou ausência de inibidores farmacológicos de NF-kB ou a p38 MAPK. O tratamento de células com um inibidor específico de NF-kB, Bay 11-7082, não teve efeito sobre o sinal de luminescência em comparação com as células tratadas com droga, sem inibidores (Figura S2).

Em contraste, o tratamento com um p38 específico inibidor de MAPK, SB203850, salvado marcadamente a diminuição de bioluminescência (Figura 5A e 5B) ou iodeto de absorção (Figura 5C) por VP-16 e o ​​5-FU em comparação com as células de controlo tratadas. Para confirmar o nível de expressão de miARN-16 na presença de SB203850, PCR em tempo real foi realizado e os resultados mostraram que o inibidor de p38 MAPK drasticamente suprimido VP-16 e 5-induzido-FU miARN-16 supra-regulação (Figura 5D), o que indica que o aumento da expressão de miARN-16 por VP-16 e o ​​5-FU está envolvido na via de sinalização de p38 MAPK.

o nosso estudo anterior demonstrou que a proteína Bcl-2 é um gene alvo directo de miARN-16 no desenvolvimento de MDR em SGC7901 células cancerosas gástricas [11]. Para testar se a proteína Bcl-2 está envolvido na VP-16 e o ​​5-FU estimulação de miARN-16 através
via MAPK p38, determinou-se o nível de proteína Bcl-2 por análise de Western blot. Como mostrado na Figura 5E e 5F, VP-16 e o ​​5-FU diminuiu significativamente o nível de proteína Bcl-2 em cerca de 50% em comparação com as células de controlo não tratadas, na ausência de SB203850. Após tratamento com SB203850, a redução de proteína Bcl-2 foi drasticamente atenuado, sugerindo a importância da activação de p38 MAPK na regulação negativa induzida pelo 5-FU VP-16 e de proteína Bcl-2.

no monitoramento vivo
de reforçada miRNA-16 expressão pela VP-16 e 5-FU

Para o monitoramento não invasivo de reforçada miRNA-16 expressão induzida pela VP-16 e 5-FU, NF-vazio e NF -3xmir16 células foram enxertadas sobre o membro posterior esquerdo e direito de cada rato (n = 6), respectivamente. Para evitar o sinal de bioluminescência de NF-vazio interferindo com que a partir de NF-3xmir16 no decurso do tratamento com fármaco, diferentes números de NF-vazio (1 × 10 ^{5 células) e NF-3xmir16 (1 × 10 7 células) foram enxertados. Como mostrado na Figura 6, significativamente reduzida intensidade de bioluminescência foi observada em NF-3xmir16 xenoenxertos após o VP-16 ou tratamento com 5-FU em comparação com o não-tratamento. Em particular, em ratinhos tratados com VP-16, o sinal de bioluminescência reduzida em cerca de 40% no NF-3xmir16 xenoenxertos enquanto que aumentou ligeiramente em xenoenxertos de NF-vazias contra imagens pré-tratados (Figura 6A e 6B), de modo semelhante para a diferença da intensidade da luminescência provocada pela VP-16 in vitro
(Figura 4A-D).}

• PLoS ONE: Funções MicroRNA-219-2-3p como um supressor tumoral no câncer gástrico e é regulado pelo DNA metilação
• PLOS ONE: Associação entre glutationa S-transferase T1 Null Genótipo e câncer gástrico Risco: Uma meta-análise de 48 estudos