Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных Национальной программы исследований и разработок Китая (973) под грант № 2012CB518101, 2011CB707702, Национальный фонд естественных наук Китая под гранты №. 81090272, 81090274, 81227901, инноваций команды Грант развития Кита отдела образования (2010CXTD01), 863 программы Китая (2012AA02A603) и Национальной программы поддержки ключевых технологий при грант № 2012BAI23B06. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:. Соавтор Xiaoyuan Чен служит редактором этого журнала. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.
MicroRNAs (миРНК) представляют собой новый класс эндогенных малых РНК некодирующих (19-23 нуклеотидов), которые отрицательно регулируют экспрессии генов в пост-транскрипционном уровне совершенной или несовершенной спаривания оснований с нетранслируемой области 3 '(УТР) целевых мРНК и тем самым вызывают деградацию мРНК или перевод репрессии [6]. В настоящее время, новые исследования показали существование и важность микроРНК в развитии резистентности противоопухолевого препарата и микроРНК выражение профилирования может коррелировать с развитием лекарственной устойчивости [7] - [10], что указывает, что микроРНК-опосредованной форма лекарственной устойчивости добавляет еще один механизм MDR. В нашем предыдущем исследовании было сообщено о том, что два микроРНК, микроРНК-15b и микроРНК-16, были дифференцированно выражены в множественной лекарственной устойчивостью желудка человека раковых клеток линии SGC7901 /VCR и ее родительской клеточной линией SGC7901 [11]. Тем не менее, оно было проведено только в в пробирке Последние достижения в методах молекулярной визуализации позволяет неинвазивно визуализации нормальных и аномальных клеточных процессов в живых организмах испытуемых на молекулярном уровне, а не на анатомическом уровне [12]. Несколько неинвазивные стратегии, такие как с использованием флуоресцентного белка, люциферазы гена-репортера, нуклеолина аптамеров или флуоресцентный молекулярный маяк, конъюгированный наночастицами, были разработаны для контроля паттерны экспрессии различных микроРНК во время канцерогенеза, нейрогенез или миогенезе в пробирке Материалы и методы исследования Животные желудочный культуры клеток рака и устойчивая генерация клеточная линия РНК олигонуклеотиды и трансфекция Вестерн-блот-анализ равных чисел (5 × 10 6 ячеек) NF пусто и NF-3xmir16 или NF-3xmir16 /VCR и клетки NF-3xmir16, были ксенотрансплантированной подкожно в левую и правую заднюю боковую сторону каждой голой мыши, как указано в результатах. Биолюминесцентный формирования изображения был приобретен один день после инъекции клеток. У всех мышей анестезировали 2,5% изофлуран газа в кислороде при расходе 1,5 л /мин. Добавили водный раствор D-люциферазы (150 мг /кг массы тела) вводили чрескожно 10 мин до обработки изображений. Изображения всего тела для сигналов Fluc были приобретены в течение 2 мин и Living программного обеспечения Image (Xenogen) был запущен для получения биолюминесцентного изображений. Рентабельность инвестиций была выбрана вручную по интенсивности сигнала. Биолюминесценции сигналы выражаются в виде фотонов в секунду на кубический сантиметр на стерадиан (р /сек /см 2 /стер) в пределах ROI. Результаты Создание желудочных линий раковых клеток, стабильно экспрессирующих hNIS и гены Fluc Для создания гена-репортера слияния (GV260- hNIS /Fluc, называемый NF-пусто), то hNIS кДНК клонировали в векторе лентивирусов (GV260-Fluc-Puro), кодирующий ген Fluc генерировать слитый белок, который был под контролем промотора убиквитина. Затем три копии комплементарных последовательностей против микроРНК-16 (3xmir16) были вставлены после стоп-кодона слитого гена hNIS /Fluc, чтобы создать другой конструкции (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, называемый NF-3xmir16) (Рис. 1А) Зашифрованная последовательность нуклеотидов аналогичной длины к 3xmir16 также вставляется в 3'UTR гена слитого hNIS /Fluc получить контрольную конструкцию (GV260-hNIS /Fluc-скремблирования, называют NF-засекречивания). В пробирке Для того, чтобы оценить трансгена деятельность Fluc и hNIS в клетках, мы провели в пробирке для того, чтобы проверить, является ли NF-3xmir16 вектор репортер, содержащий микроРНК-16 последовательностей-мишеней был репрессирован экзогенной микроРНК-16, мы исследовали Fluc и hNIS активность после введения микроРНК-16. По сравнению с клетками, трансфецированных олигонуклеотидами NC, сигнал биолюминесценции были снижены на 35% в клетках, трансфицированных микроРНК-16 (фиг.2А и 2В). А поглощение а йода 131I в микроРНК-16, трансфицированных клеток составляла примерно 70%, что в NC трансфицированных клетках количественно радиоактивным подсчетом (фиг.2с). А в зависимости от дозы (рис S1D-F) активность Fluc и hNIS уменьшались. Эти данные свидетельствуют о том, что NF-3xmir16 репортер конструкция может быть модулируется микроРНК-16. Для того, чтобы обнаружить эндогенный микроРНК-16 уровень экспрессии в клетках рака желудка в пробирке для того, чтобы определить, могут ли другие противоопухолевые препараты изменить профиль микроРНК-16 экспрессии, пять клинических препаратов для рака желудка были добавлены к NF-3xmir16 клеток с последующим в пробирке Увеличение микроРНК-16 выражений по VP-16 и 5-ФУ участвуют в р38 МАРК но NF-kB сигнальный путь по аналогии с модуляцией РНК-генов кодирующих белок, транскрипция генов микроРНК, как представляется, регулируется несколькими сигнальными путями. Активация сигнальных путей NF-kB или МАРК является общим ответом следующие химиотерапевтических препаратов [17], [18]. Поэтому мы предположили, что позитивная регуляция микроРНК-16 может быть результатом повышенной NF-kB или МАРК активации после того, как VP-16 или лечения 5-ФУ. Чтобы выяснить роль этих сигнальных путей в VP-16 и 5-ФУ-индуцированной трансактивации микроРНК-16, мы впервые была измерена интенсивность люминесценции в NF-3xmir16 клеток в ответ на VP-16 и 5-ФУ в присутствии или в отсутствие фармакологических ингибиторов NF-kB или р38 МАРК. Обработка клеток специфического ингибитора NF-kB, Bay 11-7082, не оказывает влияния на сигнал люминесценции по сравнению с необработанными клетками наркотиков без ингибиторов (Рисунок S2).
уровне и не может отражать в естественных условиях Информация о функциях микроРНК в сопротивлении противоопухолевого препарата.
и в естественных условиях
[13] - [16]. Настоящее исследование было ввести неинвазивный метод мониторинга микроРНК-16 в химиорезистентности рака желудка с помощью системы гена-репортера двойного изображения, в котором йодид человек натрия Симпортер (hNIS) и люциферазы светлячка (Fluc) генов были связаны с гибридным геном для биолюминесценции изображений и 99mTc-пертехнетата визуализации гамма-камера в естественных условиях
.
<р> конкретного патогена 8 недель -Старый самок мышей BALB /с голых мышей были получены из Шанхайского центра животных в Китае и выросший в животном центре Четвертый военный медицинский университет, Китай. Все экспериментальные животные были помещены под конкретного патогена условиях. Протоколы животного происхождения, используемые в настоящем исследовании, были одобрены Советом по рассмотрению этики Четвертый военно-медицинского университета. Все процедуры были выполнены в соответствии с четвертой Руководство Военно-медицинский университет по уходу и использованию лабораторных животных, сформулированными Национальным обществом медицинских исследований.
Реагенты и антитела
<р> Мышиные моноклональные антитела против hNIS (ab17795) был приобретен у Abcam. Кроличьи поликлональные антитела, специфичные к Bcl-2 был приобретен у фирмы Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (ингибитор NF-kB) и SB203580 (ингибитор МАРК р38) были получены из Beyotime Института биотехнологии (Шанхай, Китай). Препараты противораковые включая винкристина (VCR), этопозид (VP-16), митомицин C (MMC), цисплатин (CDDP), 5-фторурацил (5-ФУ) и адриамицин (ADR) были приобретены у Wolsen биотехнологии (г. Сиань, Китай). Плазмиду лентивирусов GV260-Fluc-Пуро была получена из Шанхай GeneChem Company (Шанхай, Китай). Все среды для культивирования клеток и сыворотки были приобретены у фирмы Gibco (Grand Island, NY).
Двойной плазмидой ген-репортер построить
<р> кодирующую последовательность гена hNIS амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды, любезно предоставленной Д-р Ян Вэйдун (Четвертый военный медицинский университет, Китай) с использованием следующих праймеров:
<р> hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '
<р> hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '
<р> Для построения вектора экспрессии двойственной кДНК гена hNIS был вставлен в BamH
I и Возраст
ограничение I ферментные участки лентивирусов вектора GV260 -Fluc-Пуро (Шанхай GeneChem, Китай), который кодирует ген Fluc под контролем промотора убиквитина. Полученный в результате двойного конструкция экспрессии GV260-hNIS /Fluc дополнительно используется для генерации GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 плазмиды. Три копии комплементарных последовательностей против микроРНК-16 (3xmir16) были введены после того, как стоп-кодон гибридного гена hNIS /Fluc генерировать GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (Рис. 1А) Зашифрованная последовательность нуклеотидов аналогичной длины к 3xmir16 также вставляется в 3'UTR гена слитого hNIS /Fluc, чтобы получить конструкцию управления (GV260-hNIS /Fluc-скремблирования. Последовательность 3xmir16 последовательность или скремблирования были получены путем отжига олигонуклеотидов :
<р> 3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '
<р> 3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'
<р> Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'
<р> Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA
<р> желудка человека линии клеток рака SGC7901 и ее с множественной лекарственной устойчивостью вариант SGC7901 /ВКМ (создан и поддерживается в нашей лаборатории, как описано ранее [11]), культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка и 100 единиц пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина (Invitrogen ). Для поддержания MDR фенотип, винкристин (с конечной концентрацией 1 мкг /мл) добавляли к культуральной среде для SGC7901 /VCR клеток. Для создания стабильной клеточной линии, лентивирусов вектор GV260-hNIS /Fluc или GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 был впервые котрансфицируют в клетки 293Т с плазмидами упаковки ( рвотный, Pol, VSV-G
). Среда роста была изменена на 6 ч после трансфекции и лентивирусов содержащих супернатант собирали через 48 ч после трансфекции. Заготовленные супернатанты центрифугировали при 4000 г в течение 10 мин, чтобы осадить клеточный дебрис. Концентрированный вирус титровали на клетках 293Т. SGC7901 клетки и SGC7901 /VCR клетки трансдуцированных с GV260-hNIS /Fluc и GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 вируса соответственно при множественности инфекции (MOI) 10. Затем клетки подвергали скринингу с пуромицин в течение 3-х недель и клеточные колонии собранные расширен на следующей стадии экспериментов
<р> микроРНК-16 и отрицательный контроль (NC) РНК олигонуклеотиды были синтезированы (Shanghai GenePharma, Китай), используя следующие последовательности.:
<р> микроРНК-16 смысл: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '
<р> микроРНК-16 антисмысловой: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'
<р> NC смысл: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'
<р> NC антисмысловой: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '
<р> Перед трансфекцией SGCC7901 клетки высевают в количестве 1 × 10 5 клеток на лунку в пластина 24-луночного и расти в течение 24 часов. Трансфекцию проводили с Липофектамин 2000 реагента (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Все трансфекции проводили в трех повторностях.
Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR), анализ
<р> Общую РНК выделяли из культивированных клеток с использованием Trizol (Invitrogen). RT проводили с PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Япония) и КПЦР проводили с Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) и ABI StepOne Plus в режиме реального времени система PCR (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя , ПЦР-продукты анализировали на 3% -ном агарозном геле. Относительное количество микроРНК-16 была нормирована на U6 мяРНК. И относительное количество Fluc нормализовалось к гену GAPDH. Складными изменения для микроРНК-16 или Fluc гена из экспериментальной группы по сравнению с контрольной группой была рассчитана с использованием -ΔΔCt метод, 2, где ΔΔCt = Δ CТ эксперимент - контроль и Δ CТ Δ CТ = Ct микроРНК - Ct U6 или Δ CТ = Ct Fluc - Ct GAPDH. ПЦР проводили в трех повторностях. Праймеры, используемые для стволовых петли RT-PCR для MIR-16 перечислены следующим образом:
<р> U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '
<р> U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '
<р> микроРНК-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'
<р> микроРНК-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '
<р> микроРНК-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'
<р> FLuc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '
<р> FLuc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'
<р> GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '
<р> GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'
<р> SGC7901 клетки промывали три раза ПБС, а затем лизируют в холодном буфере для лизиса (20 мМ NaCl, 200 мМ Трис-HCl [pH 7,4], 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 1% Тритон Х-100 и 1% апротинина) в течение 30 мин на льду. Клеточные лизаты центрифугировали при 12000 оборотах в минуту в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Супернатант собирали и идентичные количества белка были разрешены 8% SDS-PAGE, а затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны инкубировали в блокирующем растворе, содержащем 5% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем иммуноблоттинг с указанными антителами. Иммунореактивного полосы визуализируют с помощью усиленной хемилюминесценции набора (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).
МТТ
<р> Для определения темпов роста NF-пустой, NF-3xmir16 и NF-3xmir16 /VCR клетки, эти три типа клеток высевали в 96-луночные планшеты с одинаковыми номерами (5000 клеток на лунку). В разные моменты времени (24, 48, 72, 96 ч), 25 мкл 5,0 мг /мл стерильного профильтрованного 3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2, 5- дифенил тетразолия (МТТ, Sigma), был добавлен в каждую лунку. Непрореагировавший краситель удаляли через 4 ч инкубации, и нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Оптическую плотность при 570 нм (эталонная длина волны, 630 нм) измеряли с помощью многомодового Считыватель микропланшетов синергия II (BioTech Instruments, VT).
Радиоактивный поглощение йодида анализ
<р> Чтобы определить взаимосвязь между иодидом поглощение и подсчитывали число клеток, серии разведений клеток высевали в 24-луночные планшеты. После 12 часов инкубации, уровень поглощения 131I был рассмотрен. Поглощение йодид определяли путем инкубации клеток сбалансированным солевым раствором 500 мкл Хэнкса (HBSS), содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина с 37 кБк без носителя Na 131I и 10 мМ NaI в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали два раза быстрее, как это возможно с помощью 1 мл охлажденного льдом буфера HBSS. Клетки отделяли 200 мкл трипсина, и измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика (Perkin-Elmer). Для оценки функциональной экспрессии hNIS в системе гена-репортера, NF-3xmir16 клетки были высеяны в на 1 × 10 5 клеток на лунку в 24-луночный планшет за день до трансфекции, а затем микроРНК-16 и NC Олигонуклеотиды трансфицировали , Через 24 часа, поглощение йодида измеряли, как описано выше.
В пробирке
биолюминесценции изображений Анализ
<р> Для того, чтобы определить связь между люминесцентными сигналов и количества клеток, серия разбавления клеток высевали в 24-луночные планшеты. Через 12 ч инкубации в каждую лунку промывали фосфатно-солевым раствором beffered (PBS). Тогда D-Люциферин (Xenogen) при концентрации 0,5 ммоль /л был немедленно добавляют перед анализом. Биолюминесценция была измерена с помощью ИВИС 100 системы визуализации (Xenogen) и анализировали с использованием живой образ программного обеспечения версии 2.50 (Xenogen). Для оценки функциональной экспрессии Fluc в системе гена-репортера, NF-3xmir16 клетки были высеяны в на 1 × 10 5 клеток на лунку в 24-луночный планшет за день до трансфекции, а затем микроРНК-16 и NC Олигонуклеотиды трансфицировали , Через 24 часа, анализ биолюминесценции измеряли, как описано выше.
Биолюминесцентный и 99mTc-пертехнетата изображений в голых мышах
<Р> Для ядерной томографии опухоль мышам внутрибрюшинно вводили 18,5 МБк из 99mTc-пертехнетата в 2weeks после инъекции клеток. Через 30 мин после инъекции, животное помещали в разложенном положении лежа на спине на ложе ОФЭКТ сканера (Symbia T2, Siemens). Анестезия была выполнена с 1% -2% изофлуран в 100% O <суб> 2 во время инъекции и обработки изображений. Все изображения были реконструированы с 2-мерных упорядоченных подмножеств ожидания максимального алгоритма. Активность определяли количественно путем просмотра области интереса (ROI) в опухолях и области ROI поддерживалась постоянной для всех атомных и оптических изображений. После того, как БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ и 99mTc-пертехнетата визуализации, опухоли собирали и взвешивали.
Статистический анализ
<р> Результаты выражены в виде среднего значения ± SD. Данные, показывающие сравнение между двумя группами были оценены с использованием т-теста Стьюдента. Сравнения между более чем двумя группами оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с соответствующим тестированием posthoc. P значения &л;. 0,05 считались статистически значимыми
биолюминесценции томография показала, что Fluc активность генов от NF-пустых ячеек была аналогична от NF-скремблирования клеток (рис S1a). Таким образом, мы выбираем NF-пустой конструкции в дальнейшем изучении. Две клеточные линии, МДР желудка человека линии клеток рака SGC7901 /VCR и ее родительской клеточной линии SGC7901, были трансдуцированных с лентивирусов содержащей NF-пустой или ген NF-3xmir16 соответственно установить три стабильные клеточные линии NF-пустой /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 и NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (называемый NF-пустому, NF-3xmir16 и NF-3xmir16 /VCR). Сначала мы проводили МТТ для измерения темпов роста этих трех клеточных линий (рис s1b). Тогда мы проведенными КПЦР анализа для исследования интегрированных копий репортерных конструкций в трех клеточных линий (рис S1c). В пробирке
биолюминесценции визуализации (рис 1B) и вестерн-блоттинга (рис 1C) были дополнительно выполнены, чтобы продемонстрировать успешное экспрессию генов Fluc и hNIS в этих трех клеточных линий.
линейность корреляции Fluc и трансгенные деятельность hNIS с номерами клеток в пробирке
биолюминесценции визуализации и 131I а йода поглощение пробы в серии разведений клеточных линий NF-3xmir16. Как показано на рисунке 1D, в соответствии с увеличением числа клеток, накопление люминесценции также увеличилось. были обнаружены биолюминесценции сигналы, хорошо коррелируют с числами клеток (γ 2 = 0.9990) (рис 1E). В то же время, поглощение 131I также было увеличено с номерами ячеек (рис 1F). Поглощение а йода наблюдалась хорошо коррелировали (γ 2 = 0,9543) с номерами ячеек (рис 1G). Поскольку Fluc был слит с hNIS, корреляция также между интенсивностью биолюминесценции и 131I радиоактивность была отмечена в клетках в соответствии с линейным регрессионным анализом (γ 2 = 0,9339) (рис 1H).
Проверка микроРНК-16 деятельности с помощью системы
гена-репортера
Обнаружение эндогенных микроРНК-16 выражение в пробирке
и В естественных условиях
<бр>
, равное количество (1 × 10 6) NF пусто и клеток NF-3xmir16 были посеяны, а затем активность Fluc и hNIS были рассмотрены. Как показано на рис 2D и 2Е, активность Fluc в результате чего из клеток NF-3xmir16 была снижена примерно на 50% по эндогенной микроРНК-16 по сравнению с тем, от NF-пустых ячеек. И деятельность hNIS от NF-3xmir16 клеток также была снижена примерно на 40% в ответ на эндогенных микроРНК-16, в отличие от, что от NF-пустых ячеек (рис 2F). Отсутствие подавления деятельности Fluc или hNIS наблюдаемых в NF-пустых ячеек в отношении, что не было никаких микроРНК-16 целевых сайтов в NF-пустой конструкции.
<Р> двойного изображения система ген-репортер включен в естественных условиях
визуализации экспрессии эндогенного микроРНК-16 в клетках рака желудка. Равное число (1 × 10 7) NF-пустых и NF-3xmir16 клетки ксенотрансплантированной подкожно в левый и правый задние бока каждой голой мыши (n = 6), а затем биолюминесценции изображений и 99mTc-пертехнетата гамма-камера для передачи изображения были приобретены. Как показано на рисунке 2G, интенсивность люминесценции из имплантированных клеток NF-3xmir16 были примерно на 55% ниже, чем от NF-пустых ячеек, аналогично для разности люциферазы деятельности, измеренной в пробирке
(Рисунок 2D и 2E). После внутрибрюшинного введения 99mTc-пертехнетата на 18,5 МБк, визуализация гамма-камера была выполнена. В отличие от NF опорожнении опухолей, показавших заметное поглощение 99mTc-пертехнетата, NF-3xmir16 опухоли показали незначительное поглощение (рис 2H), что указывает эндогенный микроРНК-16 снижала экспрессию hNIS. Физиологические поглощение наблюдалось также в узлах щитовидной железы, желудка и мочевого пузыря, в котором hNIS обычно выражается. Интересующие регионы (ROI), анализ показал, что активность hNIS значительно снизилась в NF-3xmir16 ксенотрансплантатов сравнению с таковым в NF-пустых ксенотрансплантатов (рис 2H). После обработки изображений, мы собрали и взвесили NF-пустые и NF-3xmir16 опухоли (рис Т1П). Результаты показали, что они имели одинаковые веса, показали, что различия в интенсивности сигнала действительно из-за эндогенных микроРНК-16 функции, но не числа клеток.
Визуализация изменений экспрессии микроРНК-16 в MDR рака желудка клеток в пробирке
и в естественных условиях
<р> было обнаружено изменение экспрессии микроРНК-16 в резистентных клеток рака желудка наркотиков с помощью
деятельности Fluc и hNIS по биолюминесценции изображений и 131I поглощение. анализы а йода Оба Fluc активность (Фигура 3А и 3В) и hNIS активность (3С) увеличилась примерно в 1,5 раза в NF-3xmir16 видеомагнитофоном клеток /по сравнению с таковым в NF-3xmir16 клеток, которые предположили, что микроРНК-16 была подавлена в NF-3xmir16 /VCR клетки. Чтобы проверить результаты, полученные с помощью системы гена-репортера, количественный ОТ-ПЦР (Q-ПЦР) проводили для анализа дифференциальной экспрессии микроРНК-16 в этих двух клеточных линий. В соответствии с данными системы гена репортера, Q-ПЦР показал, снизился микроРНК-16 уровней в NF-3xmir16 /VCR по сравнению с его коллегой NF-3xmir16 клетки (рис 3D).
<Р> Для неинвазивного количественного мониторинга miRNA- 16 дифференциальное выражение в MDR рака желудка клеток в
естественных условиях, биолюминесценции визуализации и 99mTc-пертехнетата визуализации гамма-камеры были выполнены. Биолюминесценции томография показали, что люминесценция сигналы были примерно в 1,7 раза увеличивается в NF-3xmir16 /VCR ксенографтов против NF-3xmir16 ксенографтов (рис 3e), в соответствии с увеличением люциферазы активности измеренных в пробирке
(Рисунок 3A и 3B). Инъекция 99mTc-пертехнетата и приобретение изображений гамма-камеры показали, что значительно выше, накопление 99mTc-пертехнетата наблюдалась в ксенографтов NF-3xmir16 /VCR, чем в NF-3xmir16 ксенотрансплантатов. Физиологический 99mTc-пертехнетата скопления также наблюдались в щитовидной железе, мочевого пузыря и желудка (рис 3F). И NF-3xmir16 Н.Ф.-3xmir16 /опухоли VCR имели одинаковые веса (рис S1H).
VP-16 и 5-ФУ повышающая регуляция микроРНК-16 выражение неинвазивного изображаемого системой двойного гена-репортера <бр>
биолюминесценции визуализации и <поглощение вир а йода> 131I анализов. Результаты показали, что интенсивность люминесценции (рис 4А и 4Б) или поглощение сотовой йодид (рис 4E) были значительно снижается подверженность VP-16, 5-ФУ и CDDP, но не для MMC и лечения ADR по сравнению с теми необработанных клеток.
<р> причины пониженного сигнала, наблюдаемого в VP-16, 5-ФУ и лечения ЦДДП может быть, что препараты активированного эндогенного микроРНК-16 экспрессии или тормозится рост клеток даже вызвало гибель клеток. Чтобы исключить последнюю возможность, пять препаратов были добавлены к NF-пустые клетки, которые не содержат микроРНК-16 целевых сайтов в данной конструкции. В пробирке
результаты обработки изображений биолюминесценции показали, что VP-16 и 5-ФУ не было никакого ингибирующего эффекта на интенсивность люминесценции, тогда как до сих пор ЦДДП уменьшенный сигнала люминесценции (рис 4С и 4D), указывая, что ЦДДП может ингибировать клеточное рост, но не активирует эндогенный микроРНК-16 выражение. С другой стороны, MMC и ADR были обнаружены несколько увеличить интенсивность люминесценции в обоих NF-3xmir16 и NF-пустых ячеек (рис 4A-D), который может возникнуть в результате продвижения клеточной пролиферации.
<Р> Чтобы проверить, что микроРНК-16 активации участвовали в противоопухолевых эффектов от VP-16 и 5-ФУ, Q-ПЦР проводили с целью определения уровня микроРНК-16 в NF-3xmir16 облучения клеток к противоопухолевым препаратам, лечения. Соответственно, микроРНК-16 экспрессии значительно повышающей регуляции после лечения ВП-16 или 5-ФУ в SGC7901 клетках по сравнению с необработанными контрольными клетками, в то время как MMC, ADR и ЦДДП имели незначительное влияние на микроРНК-16 выражении (рис 4F).
<Р> В отличие от этого, лечение с помощью специфической р38 ингибитор МАРК, SB203850, заметно спасено снижение биолюминесценции (рис 5А и 5В) или йодистого поглощения (рис 5в) с помощью VP-16 и 5-ФУ по сравнению с обработанными контрольными клетками. Для подтверждения уровня экспрессии микроРНК-16 в присутствии SB203850, ПЦР в реальном времени проводили, и результаты показали, что ингибирующее р38 МАРК резко подавлена VP-16 и 5-ФУ-индуцированной микроРНК-16 повышающей регуляцией (рис 5D), что указывает на увеличение микроРНК-16 выражение В.П.-16 и 5-ФУ участвует в р38 МАРК сигнального пути.
<р> Наше предыдущее исследование показало, что Bcl-2 белок представляет собой прямой целевой ген микроРНК-16 в развитии МЛУ в SGC7901 клеток рака желудка [11]. Чтобы проверить, идет ли речь Bcl-2 в VP-16 и 5-ФУ стимуляции микроРНК-16 через
р38 МАРК пути, мы определили, Bcl-2 уровень белка с помощью Вестерн-блот-анализа. Как показано на рисунке 5Е и 5F, VP-16 и 5-FU значительно снижало уровень белка Bcl-2, примерно на 50% по сравнению с необработанными контрольными клетками при отсутствии SB203850. При обработке вместе с SB203850, снижение Bcl-2 белка резко ослабляется, что говорит о значении активации МАРК р38 в VP-16 и 5-ФУ-индуцированной понижающей регуляции Bcl-2 белка.
В естественных условиях
мониторинга усиления экспрессии микроРНК-16 по VP-16 и 5-ФУ
<р> Для неинвазивного мониторинга повышенной микроРНК-16 экспрессии, индуцированной VP-16 и 5-ФУ, NF-пусто и NF -3xmir16 клетки прививают на левой и правой задней конечности каждой мыши (N = 6), соответственно. Чтобы избежать сигнала биолюминесценции от NF-пустой вмешивалась, что из NF-3xmir16 в процессе лечения наркомании, различное число NF-пусто (1 × 10 5 клеток) и NF-3xmir16 (1 × 10 7 клеток) были привиты. Как показано на рисунке 6, значительно снижается интенсивность биолюминесценции наблюдалась в NF-3xmir16 ксенотрансплантатов после ВП-16 или лечения 5-ФУ по сравнению с нелечением. В частности, у мышей, получавших VP-16, сигнал биолюминесценции уменьшается примерно на 40% в NF-3xmir16 ксенотрансплантатов, тогда как слегка увеличилась в NF-пустых ксенотрансплантатов в сравнении с предлеченных изображений (фиг.6а и 6б), аналогично для разности интенсивности люминесценции, вызванной по VP-16 в пробирке
(Рисунок 4A-D).
Изменения микробиома кишечника при приготовлении растительной пищи,
Болезнь Крона
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Ученые разработали таблетку, напечатанную на 3D-принтере, с образцами бактерий, обнаруженных в кишечнике
Пептид паучьего яда может помочь снять боль при синдроме раздраженного кишечника
Бактериофаги могут лечить кишечную палочку, не повреждая кишечник,
Язвенный колит
Язвенный колит - это заболевание, поражающее толстую и прямую кишки. Это вызывает раздражение и воспаление и в конечном итоге приводит к развитию язв на слизистой оболочке толстой кишки. Язвенный коли
То, что вы едите, может изменить то, как антибиотики влияют на кишечник
Новое исследование, проведенное учеными из Университета Брауна в Род-Айленде, показало, что диета может влиять на то, как лечение антибиотиками влияет на микробиом кишечника. Ученые изучили, как антиб
Обычный грибок, обнаруженный на коже, может вызвать воспалительное заболевание кишечника.
Терапия, направленная на определенные комменсальные грибы, может предоставить новый способ лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), по мнению исследователей Лос-Анджелеса. Фон |