PLoS ONE: Noninvasiivinen visualisointi MicroRNA-16 Chemoresistance mahasyövän käyttäminen Dual Reporter Gene Imaging System

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat sekaantuneet olevan keskeinen rooli kehitettäessä lääkeresistenssin erilaisia ​​syöpäsairauksia. Kuitenkin monet tutkimukset tehtiin in vitro
tasolla eikä voinut toimittaa in vivo
tietoa toimintojen miRNA että syövän huumeiden vastarintaa. Täällä, otimme käyttöön kaksi reportterigeeni kuvantamisjärjestelmä noninvasiivisesti seurantaa kineettinen ilmaus miRNA-16 aikana chemoresistance mahasyövän sekä in vitro
ja in vivo
. Ihmisen natriumjodidia symporter (HNIs) ja tulikärpäsen lusiferaasi (Fluc) geenit liitettiin muodostamaan HNIs /Fluc kaksinkertainen fuusio reportterigeenin ja luo ihmisen mahasyövän solulinja NF-3xmir16 ja sen monilääkeaineresistenssin solulinja NF-3xmir16 /videonauhuri. Radiojodin otto ja Fluc luminesenssi signaaleja in vitro
korreloivat hyvin elinkelpoisten solujen määrä. Lusiferaasiaktiivisuudet ja radiojodidia ottoa NF-3xmir16 solut huomattavan tukahdutettu eksogeenisten tai endogeenisten miRNA-16. NF-3xmir16 /videonauhuri solut osoittivat merkittävää lisäystä ^{131I otto ja luminesenssi intensiteetti verrattuna NF-3xmir16 soluissa. Radioaktiivisuus in vivo
99m-perteknetaattia kuvantaminen ja intensiteettiä bioluminescence kuvantamisen lisääntyivät myös NF-3xmir16 /videonauhurin verrattuna NF-3xmir16 tuumoriksenograftien. Lisäksi tällä reportterigeeni järjestelmä, huomasimme, että etoposidi (VP-16) ja 5-fluorourasiilin (5-FU) aktivoitua miRNA-16 lauseke in vitro
ja in vivo
, ja ylössäätelyyn miRNA-16 on p38MAPK riippuvainen mutta NF-KB riippumaton. Tämä dual kuvantaminen reportterigeeni voidaan antaa tiedoksi uutena välineenä in vivo
kuvantamiseen MikroRNA vuonna chemoresistance syöpiä, sekä varhainen havaitseminen ja diagnoosi klinikalla.}

Citation: Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et ai. (2013) Noninvasiivinen visualisointi MicroRNA-16 Chemoresistance mahasyövän käyttäminen Dual Reporter Gene Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 21 marraskuu 2012; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2013; Julkaistu: 17 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Program National Basic tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (973) alle Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, National Natural Science Foundation of China alle Grant nro. 81090272, 81090274, 81227901, Innovation Team Development Grant Kiinan osasto of Education (2010CXTD01), 863-ohjelma Kiinassa (2012AA02A603) ja National Key tekniikkatuki ohjelmaansa Grant No. 2012BAI23B06. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Xiaoyuan Chen toimii editori tässä lehdessä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Mahasyöpää pysyy ensimmäinen johtava syy syövän kuolemaan Kiinassa ja neljänneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti huolimatta dramaattiseen laskuun sen kuolleisuuden ja sairastavuuden kolmen viime vuosikymmenen ajan [1]. Kemoterapia on laajalti käytetty hoitoon sekä kokoisen ja edennyt mahasyöpä, mikä johtaa parannuksiin kokonaiselossaoloaikaa sekä elämänlaatua potilailla [2], [3]. Kuitenkin, pitkän aikavälin kemoterapia ei usein poistaa kaikki kasvainsolut, koska luontaiset tai hankittu monilääkeresistenssiin (MDR), joka on kaikkein tärkein syy kasvaimen uusiutumisen [4]. Tällä hetkellä MDR on pidetty monitekijäinen ilmiö, johon liittyy useita tärkeimmät mekanismit, mukaan lukien lisääntynyt metabolia huumeita, väheni ottoa vesiliukoisten lääkeaineiden, muuttunut lääkekohteita, pienentää solunsisäisen lääkeainepitoisuuden effluksipumppujen, muuttaa solusyklin tarkastuspisteitä ja aiheuttama hätä muuniresponssigeeneinä heikentävän apoptoottisia reittejä, jne
[5]. Vaikka MDR mekanismit on laajasti tutkittu, avaintekijöitä ilmiön edelleen pääosin epäselvä.

MikroRNA (miRNA) ovat uusi luokka endogeenisiä pienten ei-koodaavaa RNA: iden (19-23 nukleotidia), joka säädellä negatiivisesti geeniekspressioiden at transkription jälkeisellä tasolla täydellinen tai epätäydellinen emäspariutumisessa kanssa 3'alue (UTR) kohde- mRNA: iden ja siten aiheuttaa mRNA: iden hajoaminen tai käännös tukahduttaminen [6]. Tällä hetkellä kehittyvien tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa ja merkitys miRNA evoluutiossa syövän huumeiden vastarintaa ja miRNA ilmentymisen profilointia voidaan korreloida lääkeresistenssin kehittymisen [7] - [10], mikä osoittaa, että miRNA-välitteinen muoto lääkeresistenssin lisää toinen mekanismi MDR. Edellisessä tutkimuksessa todettiin, että kaksi miRNA miRNA-15b ja miRNA-16, oli differentiaalisesti ilmaistaan ​​monilääkeresistenteistä ihmisen mahasyövän solulinja SGC7901 /VCR ja sen emosolulinjassa SGC7901 [11]. Kuitenkin tehtiin vain in vitro
tasolla eikä voinut heijastaa in vivo
tietoa toimintojen miRNA on syöpälääke vastus.

Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyyli- kuvantamismenetelmiä mahdollistaa invasiivisesti visualisoinnin normaalin ja epänormaalin solun prosesseja elävillä potilailla molekyylitasolla mieluummin kuin anatomiset tasolla [12]. Useat ei-invasiivisen strategioita, kuten käyttämällä fluoresoivaa proteiinia, lusiferaasireportterigeeniin, nukleoliinin aptameerin tai fluoresoivat molekyylimajakka- konjugoitu nanohiukkasten, on kehitetty seurata ilmentymisen kuviot eri miRNA aikana karsinogeneesin, neurogenesis tai myogeneesin in vitro
ja in vivo
[13] - [16]. Tässä tutkimuksessa oli esitellä noninvasiivinen tapa seurata miRNA-16 chemoresistance mahasyövän kautta dual kuvantaminen reportterigeeni järjestelmän, jossa ihmisen natriumjodidia symporter (HNIs) ja tulikärpäsen lusiferaasi (Fluc) geenit kytkettiin fuusio geenin bioluminesenssi kuvantaminen ja ^{99m-perteknetaatti gammakamerakuvauksella in vivo
.}

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

erityisiä patogeenittomassa 8 viikon -old BALB /c-nude-hiiret saatiin Shanghai animal center Kiinassa ja kasvatetut neljännen Military Medical University eläin keskus, Kiina. Kaikki koe-eläimiä oli pidetty erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Eläin protokollat ​​Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi neljännen Military Medical University Ethics Review Board. Kaikki menettelyt suoritettiin mukaisesti neljännen Military Medical University Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals muotoiltu National Society for Medical Research.

reagenssit ja vasta

Hiiren monoklonaalinen vasta HNIs (ab17795) hankittiin Abcam. Kanin polyklonaalinen vasta-aine, spesifinen Bcl-2 hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-KB: n estäjä) ja SB203580 (p38 MAPK estäjä) saatiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Shanghai, Kiina). Syövänvastainen huumeiden, kuten vinkristiini (VCR), etoposidi (VP-16), mitomysiini C: llä (MMC), sisplatiini (CDDP), 5-fluorourasiili (5-FU) ja adriamysiinin (ADR) ostettiin Wolsen Biotechnology (Xi'an, Kiina). GV260-Fluc-puro lentivirus plasmidi saatiin Shanghai GeneChem Company (Shanghai, Kiina). Kaikki Soluviljelyväliaineet ja seerumin hankittiin Gibco (Grand Island, NY).

Dual reportterigeenin plasmidirakenteen

koodaussekvenssi HNIs-geeni monistettiin PCR: llä plasmidi toimitti ystävällisesti Dr. Weidong Yang (neljäs Military Medical University, Kiina) käyttäen seuraavia alukkeita:

HNIs-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

HNIs-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 "

rakentamiseksi kahden ekspressiovektorin, cDNA: n HNIs geeni insertoitiin BamHI
I ja Ikä
I restriktioentsyymikohdat on lentivirusvektorin GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Kiina), joka koodaa Fluc säätelyn alaisena ubikitiinipromoottori. Saatu kahden ekspressiokonstrukti GV260-HNIs /Fluc edelleen käytetään tuottamaan GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 plasmidi. Kolme kopiota komplementaaristen sekvenssien vastaan ​​miRNA-16 (3xmir16) insertoitiin jälkeen lopetuskodonista HNIs /Fluc fuusiogeeni tuottaa GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 (kuvio 1A). Salatun nukleotidisekvenssi pituiset 3xmir16 myös insertoitiin 3'UTR HNIs /Fluc fuusio geenin saamiseksi ohjaus konstruktin (GV260-HNIs /Fluc-sekoituskoodin. 3xmir16 tai sekoitusmaski sekvenssi saatiin seuraavien oligonukleotidien anelloinnin :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

mahasyöpää soluviljelmissä ja vakaa solulinjasta sukupolven

Ihmisen mahalaukun syövän solulinja SGC7901 ja sen monilääkeresistenteistä variantti SGC7901 /VCR (luoda ja ylläpitää laboratoriossamme, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 100 yksikköä penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen ). Ylläpitää MDR-fenotyyppi, vinkristiini (lopullinen pitoisuus 1 ug /ml) lisättiin elatusaineeseen ja SGC7901 /VCR-soluja. Tuottamaan vakaa solulinjasta, lentivirus vector GV260-HNIs /Fluc tai GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 ensin kotransfektoitiin 293T-soluihin, joissa pakkaus plasmideilla ( gag, pol, VSV-G-
). Kasvualusta vaihdettiin 6 h transfektion jälkeen ja lentivirus sisältävä supernatantti otettiin talteen 48 h transfektion jälkeen. Korjattu supernatantit sentrifugoitiin 4000 g: ssä 10 min solujäänteisen pelletoimiseksi. Väkevä virus titrattiin 293T-soluihin. SGC7901 solut ja SGC7901 /VCR-solut transdusoitiin GV260-HNIs /Fluc ja GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 virus vastaavasti infektiokertoimella (MOI) 10. Sitten solut seulottiin puromysiiniä ja 3 viikkoa ja solujen pesäkkeet kerätään laajennettu ensi vaiheessa kokeita.

RNA oligoja ja transfektio

miRNA-16 ja negatiivinen kontrolli (NC) RNA oligot syntetisoitiin (Shanghai GenePharma, Kiina) käyttäen seuraavat sekvenssit:

miRNA-16 sense: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC sense: 5 "-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 '

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'

Ennen transfektiota, SGCC7901 soluja siirrostettiin 1 x 10 ^{5 solua per kuoppaa 24-kuoppalevylle ja kasvaa 24 tuntia. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kaikki transfektio tehtiin kolmena rinnakkaisena.}

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista käyttäen Trizol (Invitrogen). RT suoritettiin PrimerScript RT Regent (Takara, Japani) ja qPCR suoritettiin Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja ABI StepOne Plus Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) mukaan valmistajan protokollan . PCR-tuotteet analysoitiin 3% agaroosigeeleillä. Suhteellinen määrä miRNA-16 normalisoitiin U6 snRNA. Ja suhteellinen määrä Fluc normalisoitiin GAPDH-geenin. Kertamuutoksen varten miRNA-16 tai Fluc geeni kokeiluryhmässä verrattuna kontrolliryhmään laskettiin 2 ^{-ΔΔCt menetelmä, jossa ΔΔCt = ACt kokeilu - ACt ohjaus ja ACt = Ct miRNA - Ct U6 tai ACt = ct Fluc - ct GAPDH. PCR suoritettiin kolmena kappaleena. Alukkeet, joita käytetään varsi-silmukka RT-PCR miR-16 on lueteltu seuraavasti:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "

miR-16 RT 5'- GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 '

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

miR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

FLuc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

FLuc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot-analyysi

SGC7901 solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sitten hajotettiin kylmässä lyysipuskuria (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCI [pH 7,4], 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1% Triton X-100 ja 1% aprotiniini) 30 minuuttia jään päällä. Solulysaatit sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja identtiset määrät proteiinia erotettiin 8% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit inkuboitiin esto, joka sisälsi 5% BSA: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla. Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ).

MTT-määritys

määrittämiseksi kasvuvauhti NF-tyhjä, NF-3xmir16 ja NF-3xmir16 /VCR-soluja, näiden kolmen soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille, joissa samat numerot (5000 solua) kuoppaa kohti. Eri ajankohtina (24, 48, 72, 96 h), 25 ui 5,0 mg /ml steriiliä suodatettua 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5- difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Reagoimaton väriaine poistettiin sen jälkeen, kun 4 h inkubaation, ja liukenematon formatsaanikiteet liuotettiin 100 ul: aan dimetyylisulfoksidia (DMSO). Absorbanssi 570 nm (viite aallonpituus, 630 nm) mitattiin Synergy II multimode mikrolevylukijalla (BioTech Instruments, VT).

Radioaktiivinen jodidi oton määritystä

tunnistamiseksi suhdetta jodidi ottoa ja solujen määrä, laimennussarja soluja inokuloitiin 24-kuoppaisille levyille. 12 tunnin kuluttua inkuboinnin ^{131I ottoa tasolla tutkittiin. Jodidi sisäänotto määritettiin inkuboimalla soluja 500 pl Hanksin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS), joka sisälsi 0,5% naudan seerumin albumiinia 37 kBq kantaja-vapaa Na 131I ja 10 mM Nal 30 min. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kaksi kertaa niin nopeasti kuin mahdollista, 1 ml: lla jääkylmää HBSS-puskurissa. Solut irrotettiin 200 ui trypsiiniä, ja radioaktiivisuus mitattiin käyttäen γ-counter (Perkin-Elmer). Arvioida funktionaalisen ekspression HNIs reportterigeenin järjestelmä, NF-3xmir16-soluja siirrostettiin 1 x 10 5 solua kuoppaa kohti 24-kuoppalevyllä päivä ennen transfektiota, sitten miRNA-16 ja NC oligoja transfektoitiin . 24 tuntia myöhemmin, jodidi otto mitattiin kuten edellä on kuvattu.}

In vitro
bioluminenssin kuvantamiseen määrityksessä

määrittää yhteys luminesenssin signaaleja ja solujen määrä, laimennussarja soluja inokuloitiin 24-kuoppaisille levyille. 12 tunnin kuluttua inkuboinnin kukin kuoppa pestiin fosfaatti-beffered suolaliuosta (PBS). Sitten D-lusiferiini (Xenogen) pitoisuutena 0,5 mmol /l, lisättiin välittömästi ennen määritystä. Bioluminesenssi mitattiin IVIS 100 Imaging-järjestelmä (Xenogen) ja analysoitiin käyttäen Living Image ohjelmistoversio 2.50 (Xenogen). Arvioida funktionaalisen ekspression Fluc reportterigeenin järjestelmä, NF-3xmir16-soluja siirrostettiin 1 x 10 ^{5 solua kuoppaa kohti 24-kuoppalevyllä päivä ennen transfektiota, sitten miRNA-16 ja NC oligoja transfektoitiin . 24 tuntia myöhemmin, bioluminisenssimäärityksen mitattiin kuten edellä on kuvattu.}

Bioluminescent ja 99m-perteknetaattia kuvantamisen nude-hiirissä

Yhtä suuret määrät (5 x 10 ^{6 solua) NF-tyhjä ja NF-3xmir16 tai NF-3xmir16 /videonauhuri ja NF-3xmir16 soluja, olivat ksenosiirrettyjä subkutaanisesti vasempaan ja oikeaan takakyljelle kunkin paljaan hiiren kuten tuloksissa. Bioluminescent kuvantaminen oli hankittu yhden päivän kuluttua solujen injektion. Kaikki hiiret nukutettiin 2,5% isofluraanilla kaasun happea virtausnopeudella 1,5 l /min. Vesiliuosta D-lu- siferiiniä (150 mg /kg kehon paino) injektoitiin ihon läpi 10 minuutin ajan ennen kuvantamisen. Koko kehon kuvia Fluc signaaleja hankittiin 2 min ja Living Image ohjelmistot (Xenogen) oli käynnissä saamiseksi bioluminescent kuvia. ROI valittiin manuaalisesti signaalin voimakkuutta. Bioluminesenssi signaalit ilmaistaan ​​fotonien sekunnissa kuutiosenttimetriä kohden steradiaania (p /s /cm 2 /sr) sisällä ROI.}

isotooppikuvantamisen, kasvain kantavia hiiriä intraperitoneaalisesti 18,5 MBq on ^{99m-perteknetaatti at 2 viikkoa jälkeen solujen injektion. 30 min injektion jälkeen, eläin laitettiin haja- selälleen vuoteelle SPECT skannerin (Symbian T2, Siemens). Anestesia suoritettiin 1% -2% isofluraania 100% O _{2 aikana injektion ja kuvantamisen. Kaikki kuvat on rekonstruoitu 2-ulotteinen tilasi-osajoukkojen odotus maksimi algoritmia. Aktiivisuus kvantifioitiin tarkastelemalla kiinnostavat alueet (ROI) kasvaimissa ja alue ROI pidettiin vakiona kaikissa ydin- ja optiset kuvien. Jälkeen bioluminescent ja 99m-perteknetaattia kuvantaminen, kasvaimet kerättiin ja punnittiin.}}

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Data näytetään vertailu kahden ryhmän välillä arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Vertailut useamman kuin kahden ryhmän arvioitiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA) sopivalla posthoc testausta. P-arvot < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

perustaminen mahasyövän solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti HNIs ja Fluc geenit

Voit luoda fuusio reportterigeenin (GV260- HNIs /Fluc tarkoitetun NF-tyhjä), The HNIs cDNA kloonattiin lentiviruksesta vektoriin (GV260-Fluc-puro), joka koodaa Fluc geeni tuottaa fuusioproteiinin, joka oli valvonnassa ubikitiinipromoottori. Sitten kolme kopiota komplementaaristen sekvenssien vastaan ​​miRNA-16 (3xmir16) insertoitiin jälkeen lopetuskodonista HNIs /Fluc fuusiogeeni luoda uusi konstrukti (GV260-HNIs /Fluc-3xmir16 tarkoitettu NF-3xmir16) (kuvio 1A). Salatun nukleotidisekvenssi pituiset 3xmir16 myös insertoitiin 3'UTR HNIs /Fluc fuusio geenin saamiseksi ohjaus konstruktin (GV260-HNIs /Fluc-sekoituskoodin, tarkoitetun NF-scramble). In vitro
bioluminenssina kuvantaminen osoitti Fluc geeni aktiivisuutta NF-tyhjät solut oli samankaltaista kuin NF-scramble soluissa (kuvio S1A). Joten me valita NF-tyhjän konstruktin jatkotutkimuksia. Kaksi solulinjojen, MDR ihmisen mahasyövän solulinja SGC7901 /videonauhuri ja sen emosolulinjassa SGC7901, transdusoitiin kanssa lentivirus sisältävä NF-tyhjiä tai NF-3xmir16 geeni vastaavasti perustaa kolme stabiileja solulinjoja NF-tyhjä /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 ja NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (tarkoitetut NF-tyhjä, NF-3xmir16 ja NF-3xmir16 /VCR). Ensin suoritetaan MTT-analyysi mitata kasvuvauhdin näiden kolmen solulinjoista (kuvio S1B). Sitten perfomed qPCR määritys tutkimaan integroidun kopiot reportterirakenteet kolmessa solulinjoissa (kuvio S1C). In vitro
bioluminenssina kuvantaminen (kuvio 1 B) ja western-blottauksella (kuvio 1 C) on edelleen tehtävä sen osoittamiseksi onnistuneen ilmaus Fluc ja HNIs geenit näillä kolmella solulinjoissa.

lineaarisuus korrelaatiota Fluc ja HNIs siirtogeenin toimintaa solujen määrä in vitro

arvioimiseksi Fluc ja HNIs siirtogeeni toimintaa soluissa, suoritimme in vitro
bioluminenssina kuvantaminen ja ^{131l radiojodidia sisäänottoa määrityksissä laimennussarja NF-3xmir16 solulinjat. Kuten kuviossa 1D, mukaan määrän kasvuun solujen kertyminen luminesenssin myös lisääntynyt. Bioluminesenssi signaaleja havaittiin korreloivan hyvin solujen määrä (γ 2 = 0,9990) (kuvio 1 E). Samaan aikaan 131I otto lisääntyi myös solujen määrä (kuvio 1 F). Radiojodidi sisäänotto havaittiin hyvin korreloi (γ 2 = 0,9543), jossa solujen määrä (kuvio 1G). Koska Fluc fuusioitiin HNIs, hyvin korrelaatio bioluminenssin voimakkuuden ja 131I radioaktiivisuus havaittiin soluissa mukaan lineaarisen regressioanalyysin (γ 2 = 0,9339) (kuvio 1 H).}

validointi miRNA-16 toiminta kautta
reportterigeeni järjestelmä

jotta testata NF-3xmir16 toimittaja sisältävän vektorin miRNA-16 kohdesekvenssien tukahdutettiin eksogeeniset miRNA-16, selvitimme Fluc ja HNIs aktiivisuuden lisäyksen jälkeen miRNA-16. Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu NC-oligot, bioluminisenssimääri- signaali pieneni 35% soluissa, jotka oli transfektoitu miRNA-16 (kuvio 2A ja 2B). Ja ^{131I radiojodidia ottoa miRNA-16 transfektoiduissa soluissa oli noin 70%, että NC transfektoiduissa soluissa kvantitoitiin radioaktiivisen laskenta (kuvio 2C). Ja Fluc ja HNIs aktiivisuus pieneni annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio S1D-F). Nämä tiedot osoittivat, että NF-3xmir16 reportterikonstruktista voitaisiin moduloida miRNA-16.}

Detection endogeenisen miRNA-16 lauseke in vitro
ja in vivo

havaitsemiseksi endogeeninen miRNA-16 ekspressiotaso mahasyövässä soluissa in vitro
, yhtä paljon (1 x 10 ^{6) NF-tyhjiä ja NF-3xmir16 solut ympättiin ja sitten Fluc ja HNIs aktiivisuutta tutkittiin. Kuten kuviossa 2D ja 2E, Fluc aktiivisuus johtuvat NF-3xmir16 solujen laski noin 50% endogeeniset miRNA-16 verrattuna peräisin NF-tyhjät solut. Ja HNIs aktiivisuutta NF-3xmir16 solujen pienensi myös noin 40% vastauksena endogeenisen miRNA-16 toisin kuin mistä NF-tyhjät solut (kuvio 2F). Puute tukahduttaminen Fluc tai HNIs havaittua toimintaa NF-tyhjät solut on suhteen, ettei miRNA-16 kohdesivustot NF-tyhjä konstruktio.}

dual kuvantaminen reportterigeeni järjestelmän käytössä vuonna vivo
visualisointi endogeenisen miRNA-16 ilmentyminen mahalaukun syöpäsoluja. Yhtä suuret määrät (1 x 10 ^{7) NF-tyhjiä ja NF-3xmir16 solut ksenosiirrettyjä subkutaanisesti vasempaan ja oikeaan takajalan kyljissä kunkin paljaan hiiren (n = 6) ja sitten bioluminescent kuvantaminen ja 99mTc- perteknetaatti gammakamerakuvauksella hankittu. Kuten kuviossa 2G, luminesenssi intensiteettiä istutettu NF-3xmir16 solut olivat noin 55% pienempi kuin NF-tyhjiä soluja, samoin varten ero lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin in vitro
(kuvio 2D ja 2E). Kun vatsaonteloon 99m-perteknetaatti 18,5 MBq, gammakamerakuvauksella tehtiin. Toisin kuin NF-tyhjiä kasvaimia, jotka osoittivat näkyvä ottoa 99m-perteknetaatti, NF-3xmir16 kasvaimia osoitti vähäistä ottoa (kuvio 2 H), mikä osoittaa endogeenisen miRNA-16 vähensivät HNIs ilmaisua. Fysiologinen sisäänotto havaittiin myös toimipaikoilla kilpirauhasen, vatsan ja virtsarakon, jossa HNIs ilmoitetaan normaalisti. Kiinnostavat alueet (ROI) analyysi osoitti, että HNIs aktiivisuus väheni merkittävästi NF-3xmir16 ksenografteissa verrattuna NF-tyhjä ksenografteissa (kuvio 2 H). Sen jälkeen kuvantamisen, keräsimme ja punnitaan NF-tyhjä ja NF-3xmir16 kasvaimet (kuvio S1G). Tulokset osoittivat heillä oli samat painot, osoitti, että erot signaalin voimakkuus ovat todellakin johtuu endogeenisen miRNA-16-toiminto, mutta ei solujen määrä.}

Visualisointi ilmentymisen muutoksen miRNA-16 MDR mahasyövän solujen in vitro
ja in vivo

ilmaisu muutos miRNA-16 lääkkeille vastustuskykyiset mahalaukun syöpäsoluissa havaittiin kautta of the Fluc ja HNIs aktiivisuutta bioluminesenssi kuvantaminen ja ^{131I radiojodidia sisäänoton määrityksiä. Molemmat Fluc aktiivisuus (kuvio 3A ja 3B) ja HNIs aktiivisuus (kuvio 3C) kasvoi noin 1,5 kertaisesti NF-3xmir16 /videonauhuri soluja verrattuna, että NF-3xmir16 soluja, joiden mukaan miRNA-16 säädeltiin vähentävästi NF-3xmir16 /VCR-soluja. Tarkista tulokset on saatu reportterigeeni järjestelmä, kvantitatiivinen RT-PCR (Q-PCR) suorittaa analyysin ero ilmentymistä miRNA-16 näissä kahdessa solulinjassa. Mukaisesti reportterigeenin järjestelmän tiedot, Q-PCR: llä osoitti, väheni miRNA-16 tasoa NF-3xmir16 /VCR verrattuna sen vastine NF-3xmir16 soluissa (kuvio 3D).}

noninvasiivinen määrää seurataan miRNA- 16 ero ilmentyminen MDR mahasyövän solujen vivo
, bioluminescent kuvantaminen ja ^{99m-perteknetaatti gammakamerakuvauksella tehtiin. Bioluminescent kuvantaminen osoitti, että luminesenssi signaalit olivat noin 1,7-kertaisesta NF-3xmir16 /videonauhuri ksenografteissa versus NF-3xmir16 ksenografteissa (kuvio 3E), mukaisesti kasvaa Lusiferaasiaktiivisuuden mitattuna in vitro
(kuvio 3A ja 3B). Injektio 99m-perteknetaattia ja hankinta gammakamerakuvauksella osoitti, että merkittävästi suurempi kertyminen 99m-perteknetaattia havaittiin NF-3xmir16 /videonauhuri ksenograftien kuin NF-3xmir16 ksenografteissa. Fysiologinen 99m-perteknetaatti kertymät havaittiin myös kilpirauhasen, virtsarakon ja vatsa (kuvio 3F). Ja NF-3xmir16 ja NF-3xmir16 /videonauhuri kasvaimia oli sama painot (kuva S1H).}

VP-16 ja 5-FU ylössäätely miRNA-16 ilmentyminen invasiivisesti kuvannetusta dual reportterigeenin järjestelmä

Voit selvittää muiden syöpälääkkeiden voisi muuttaa miRNA-16 ilmentyminen profiilin, viisi kliinistä lääkkeitä mahasyövän lisättiin NF-3xmir16 solujen seurasi in vitro
bioluminenssina kuvantaminen ja ^{131l radiojodidia otto määrityksiä. Tuloksista ilmeni, että luminesenssi intensiteetti (kuvio 4A ja 4B) tai solun jodidia sisäänoton (kuvio 4E) oli suuresti vähentynyt altistuminen VP-16, 5-FU: n ja CDDP: n, mutta ei MMC ja ADR hoitoon verrattuna käsittelemätön soluihin.}

syyt laski signaali havaittu VP-16, 5-FU ja CDDP hoito voisi olla, että huumeet aktivoitu endogeeninen miRNA-16 ilmentyminen tai esti solun kasvua jopa aiheutti solukuolemaa. Jos haluat jättää jälkimmäinen mahdollisuus, viisi lääkkeitä lisättiin NF-tyhjät solut, jotka eivät sisällä miRNA-16 kohdesivustot konstruktissa. in vitro
bioluminenssina kuvantamisen tulokset osoittivat, että VP-16 ja 5-FU ei ollut estävää vaikutusta luminenssi intensiteetti, kun taas CDDP edelleen pienensi luminesenssi signaali (kuvio 4C ja 4D), mikä osoittaa, että CDDP saattaa estää solun kasvua, mutta ei aktivoi endogeenisiä miRNA-16 ilme. Toisaalta, MMC ja ADR havaittiin hieman lisätä luminesenssin intensiteetti sekä NF-3xmir16 ja NF-tyhjät solut (kuvio 4A-D), jotka voivat johtua edistää solujen lisääntymistä.

Jos haluat varmistaa, että miRNA-16 aktivointi osallistuivat osaksi syöpää ehkäisevistä vaikutuksista VP-16 ja 5-FU, Q-PCR suoritettiin määrittämään miRNA-16 tason NF-3xmir16 solujen altistuminen syöpälääkkeiden hoitoja. Siten miRNA-16 ilmentyminen säädeltiin merkitsevästi jälkeen VP-16 tai 5-FU hoidot SGC7901 soluissa verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin, kun taas MMC, ADR ja CDDP on vähäinen vaikutus miRNA-16 ilmentyminen (kuvio 4F).

Lisääntynyt miRNA-16 ilmaisuja VP-16 ja 5-FU osallistuvat p38 MAPK mutta NF-KB signalointireitistä

Samanlainen modulaatioon proteiinia koodaavan RNA geenejä, transkription miRNA geenien näyttää säännellään useiden signalointireittien. Aktivointi NF-KB tai MAPK signalointipolkujen on yleinen vastaus seuraavien kemoterapeuttisten [17], [18]. Siksi me arveltu, että ylössäätely miRNA-16 voisi olla lisääntyneen NF-KB: n tai MAPK aktivoitumisen jälkeen VP-16 tai 5-FU hoidossa. Selvittämiseksi rooli näiden signalointireiteissä VP-16 ja 5-FU-indusoidun transaktivaatiota miRNA-16, ensin mitattu luminesenssi intensiteetti NF-3xmir16 solut vasteena VP-16 ja 5-FU: n läsnä ollessa tai poissa farmakologisen estäjien NF-KB tai p38 MAPK. Solujen käsittely tietyn NF-KB: n estäjä, Bay 11-7082, ei ollut vaikutusta luminesenssin signaalin verrattuna lääkkeellä käsiteltyjen solujen ilman inhibiittorit (kuva S2).

Sitä vastoin hoito tietyn p38 MAPK-inhibiittori, SB203850, selvästi pelastettiin lasku bioluminenssin (kuvio 5A ja 5B) tai jodidi oton (kuvio 5C) VP-16 ja 5-FU verrattuna käsiteltyjen kontrollisolujen. Vahvista miRNA-16 ilmentymistaso läsnäollessa SB203850, reaaliaikainen PCR suoritettiin ja tulokset osoittivat, että estävää p38 MAPK rajusti tukahdutettu VP-16 ja 5-FU aiheuttama miRNA-16 säätelyä (kuvio 5D), mikä osoittaa, että lisääntynyt miRNA-16 ilmentyminen VP-16 ja 5-FU on mukana p38 MAPK -signalointireitistä.

edellinen tutkimus on osoittanut, että Bcl-2-proteiini on suora kohdegeeni miRNA-16 kehittämisessä MDR in SGC7901 mahasyövässä solujen [11]. Sen testaamiseksi Bcl-2 on mukana VP-16 ja 5-FU stimulaation miRNA-16 kautta
p38 MAPK-reitin, päätimme Bcl-2-proteiinin tason Western blot analyysi. Kuten kuviossa 5E ja 5F, VP-16 ja 5-FU merkittävästi vähentynyt Bcl-2-proteiinin tason noin 50% verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solujen puuttuessa SB203850. Kun hoito yhdessä SB203850 määrä pieneni Bcl-2-proteiinin rajusti heikennetty, mikä viittaa tärkeyttä p38 MAPK aktivaation VP-16 ja 5-FU aiheuttama downregulation Bcl-2-proteiinin.

in vivo
seuranta tehostetun miRNA-16 ilmentyminen VP-16 ja 5-FU

noninvasiivinen seuranta tehostetun miRNA-16 ilmentyminen indusoi VP-16 ja 5-FU, NF-tyhjä ja NF -3xmir16 solut oksastettu vasemman ja oikean takaraajan kunkin hiiren (n = 6), vastaavasti. Välttämiseksi bioluminisenssimääri- signaalin NF-tyhjä häiritsee, että vuodesta NF-3xmir16 aikana lääkehoidon, eri määrä NF-tyhjän (1 x 10 ^{5 solut) ja NF-3xmir16 (1 x 10 7-solut) oksastettu. Kuten kuviossa 6 on esitetty, merkittävästi vähentää bioluminesenssi-intensiteetti havaittiin NF-3xmir16 ksenografteissa jälkeen VP-16: n tai 5-FU hoidon verrattuna hoitamatta jättämisen. Erityisesti hiirillä, joita hoidettiin VP-16, bioluminisenssimääri- signaali väheni noin 40%: in NF-3xmir16 ksenografteissa taas lisääntyi hieman NF-tyhjä-ksenografteja vastaan ​​esikäsiteltyä kuvia (kuvio 6A ja 6B), vastaavasti eron luminesenssin intensiteetin aiheutti VP-16 in vitro
(kuva 4A-D).}

• PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p toiminnot tuumorisuppressorina mahasyövän ja säätelee DNA Metylointi
• PLoS ONE: Association between glutationi S-transferaasi T1 Tyhjä genotyypin ja mahasyövän riski: Meta-analyysi 48 tutkimukset