PLoS ONE: neinvazivna Vizualizacija mikrornk-16 u kemijska otpornost rak želuca Koristeći sustav Dual Reporter Gene Imaging

Sažetak pregled

mikroRNA (miRNAs) uključeni su da igraju središnju ulogu u razvoju rezistencije na lijekove kod različitih malignih bolesti. Međutim, mnoge studije su provedena na in vitro
razini i nije mogao pružiti in vivo
informacije o funkcijama miRNAs u otporu protiv raka droga je. Evo, uveli smo dual reporter gena imaging sustav za neinvazivno praćenje kinetičke izraz Mirna-16 tijekom kemijska otpornost na rak želuca i In vitro
i in vivo pregled. Ljudski natrijevog jodida symporter (hNIS) i luciferaza krijesnice (oscilacije) geni su povezani tako da tvore hNIS /oscilacije dupli gen fuzija reporter, a potom generirati ljudski rak želuca stanične linije NF-3xmir16 i njegovu stanične linije višestruka otpornost na lijekove NF-3xmir16 /VCR. Radioiodide unos i oscilacije luminiscencije signali In vitro pregled dobro korelira s izvediv stanica brojeve. Aktivnosti luciferaze i radioiodide unos u NF-3xmir16 stanica izuzetno potisnuta egzogenog i endogenog Mirna-16. NF-3xmir16 /VCR stanice su pokazali značajno povećanje ^{131I unosa i luminiscencije intenzitetom u usporedbi s NF-3xmir16 stanica. Radioaktivnost iz In vivo pregled 99mTc-pertehnetata slike i intenzitet iz bioluminiscencija slike su također povećana u NF-3xmir16 /VCR usporedbi s onim u NF-3xmir16 tumorskih ksenografta. Nadalje, koristeći ovaj sustav reporter gena, utvrdili smo da je etopozid (VP-16) i 5-fluorouracil (5-FU) aktivira Mirna-16 ekspresiju In vitro pregled i in vivo pregled i doreguliranje Mirna-16 je p38MAPK ovisna, ali NF-kB neovisna. Ova dvostruka slike reporter gen može poslužiti kao novi alat za in vivo pregled oslikavanje mikroRNA u kemijska otpornost karcinoma, kao i za rano otkrivanje i dijagnostiku u klinici pregled}

Citation. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) neinvazivna Vizualizacija mikrornk-16 u kemijska otpornost rak želuca Korištenje Dual reporter gena sustava snimanja. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792 pregled

Urednik: Javier S. Castresana, Sveučilište Navarra, Španjolska pregled

Primljeno: 21. studeni 2012; Prihvaćeno: 13. ožujak 2013; Objavljeno: 17. travanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Wang et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane programa Nacionalnog Osnovnog programa istraživanja i razvoja Kine (973) pod Grant br 2012CB518101, 2011CB707702, Nacionalni Natural Science Foundation of China pod Grant br. 81090272, 81090274, 81227901, inovacije Team Development Grant Kina Odjela obrazovanja (2010CXTD01), 863 programa Kine (2012AA02A603) i Nacionalnog programa ključ tehničko pod Grant br 2012BAI23B06. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

suprotstavljenih interesa. Koautor Xiaoyuan Chen služi kao urednik ovog časopisa. To ništa ne mijenja pridržavanje autorovih svim PLoS ONE politika na razmjenu podataka i materijala. Pregled

Uvod pregled

rak želuca ostaje prvi vodeći uzrok smrti od raka u Kini, a četvrti najčešći maligne bolesti u svijetu, unatoč dramatičnom smanjenju njegove smrtnosti i pobola u proteklih tri desetljeća [1]. Kemoterapija je naširoko koristi za liječenje oba resekcijom i uznapredovalog raka želuca, što dovodi do poboljšanja u ukupnom preživljavanju, kao i kvalitete života pacijenata [2], [3]. Međutim, dugoročno kemoterapija često ne uspijeva eliminirati sve tumorske stanice zbog intrinzična ili stečena otpornost na mnoge lijekove (MDR), što je najveći primarni uzrok tumora recidiva [4]. Trenutno, MDR se smatra kao više uzroka koji uključuje nekoliko glavnih mehanizama, uključujući povećan metabolizam lijekova, smanjen unos vodi topljivih lijekova, izmijenjenih ciljeve droge, smanjuje intracelularne koncentracije lijeka crpka za istjecanje, izmijenjen ciklusa punktove stanica i inducirani hitne geni odgovor na narušavaju apoptoze, i sl pregled [5]. Iako su mehanizmi MDR su opsežno istražili, ključne odrednice ovog fenomena u velikoj mjeri ostaju nejasni.

mikroRNA (miRNAs) su nova klasa endogenih malih nekodirajuće RNA (19-23 nukleotida) koji negativno reguliraju gena izraza na post-razini transkripcije savršenom ili nesavršenog sparivanja baza s 3 'netranslatirane regiji (UTR) ciljnih mRNA i na taj način izazivaju mRNA degradacije ili prevođenja represiju [6]. Trenutno, u nastajanju su studije pokazale postojanje i važnost miRNAs u razvoju otpornosti lijekom protiv raka i miRNAs izražavanja profiliranje može dovesti u vezu s razvojem rezistencije na lijek [7] - [10], što znači da je oblik miRNAs posredovana otpornost na lijek dodaje još jedan mehanizam MDR. U našem prethodnom istraživanju, to je izvijestio da su dva miRNAs, Mirna-15b i Mirna-16, bili su različito izražena u višestruko otpornim na ljudska stanična linija karcinoma želuca SGC7901 /VCR i njegova roditeljska stanična linija SGC7901 [11]. Međutim, to je provedeno samo na in vitro
razini i ne može odražavati In Vivo pregled informacija o funkcijama miRNAs u otporu lijekom protiv raka.

Nedavni napredak u tehnikama molekularne imaging omogućuje neinvazivno vizualizaciju normalnih i abnormalnih staničnih procesa u živim subjekata na molekularnoj razini, a ne na anatomskoj razini [12]. Nekoliko neinvazivna strategije, kao što je korištenje fluorescentni protein, luciferaza reporter gena, nucleolin aptamer ili fluorescentnih molekularna far konjugirana nanočesticama, razvijeni su za praćenje izraz uzoraka raznih miRNAs tijekom karcinogeneze, neurogeneza ili miogenezu In vitro pregled i In vivo pregled [13] - [16]. Ova studija je uvesti neinvazivna metoda za praćenje Mirna-16 u kemijska otpornost raka želuca kroz sustav reporter gena dvostrukom slike u kojima ljudski natrijevog jodida symporter (hNIS) i luciferaza krijesnice (oscilacije) gena su povezani s fuzijskog gena za bioluminiscencija slike i ^{99mTc-pertehnetata gama kamera snimanje in vivo pregled. pregled}

materijali i postupci

Životinje pregled

Posebni patogena 8 tjedana -old BALB /c golih miševa dobivene su iz Šangaja Animal centar u Kini i uzgojeni u životinjskom centru Četvrta Military Medical University, Kina. Sve životinje korištene u eksperimentu uzgajani u specifičnim uvjetima bez patogena. Životinjske protokoli koji se koriste u ovom istraživanju su odobreni od strane Četvrta Military Medical University etika pregled odbor. Svi postupci provedeni su u skladu s Četvrte Military Medical University Vodič za odgajanje i korištenje laboratorijskih životinja formulirana od strane Nacionalnog društva za medicinska istraživanja. Pregled

Reagensi i antitijela pregled

Miš monoklonalno antitijelo protiv hNIS (ab17795) je kupljen od Abcam. Zečje poliklonalno protutijelo specifično za Bcl-2 je kupljen od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (inhibitor NF-kB) i SB203580 (MAPK inhibitor p38) dobiveni su od Beyotime Instituta za biotehnologiju (Shanghai, Kina). Citotoksični lijekovi, uključujući vinkristin (VCR), etopozid (VP-16), mitomicin C (MMC), cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), i adriamicin (ADR) nabavljeni su od Wolsen Biotechnology (Xi'an, Kina). GV260-oscilacije-puro lentivirus plazmid dobiven iz Šangaja GeneChem Company (Shanghai, Kina). Svi mediji za kulturu stanica i serum nabavljeni su od Gibco (Grand Island, NY). Pregled

Dual Plazmid reporter gena konstrukta pregled

Kodna sekvenca hNIS gena je amplificiran PCR-om iz plazmida dobiveno od Dr. Weidong Yang (Četvrti Military Medical University, Kina) uporabom slijedećih primera:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 'pregled

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 'pregled

Za izgradnju dvojnog vektoru ekspresije, cDNA od hNIS gena je umetnut u BamH pregled i i Godine pregled sam restrikcije enzima nalazišta lentivirusnim vektora GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Kina) koja kodira oscilacije gen pod kontrolom ubikvitinski promotor. Dobiveni dual ekspresijski konstrukt GV260-hNIS /oscilacije je korišten za generiranje GV260-hNIS /oscilacije-3xmir16 plazmid. Tri primjerka komplementarne sekvence protiv Mirne-16 (3xmir16) su umetnuta nakon stop kodona fuzijskog gena hNIS /oscilacije generirati GV260-hNIS /oscilacije-3xmir16 (Slika 1A). Kodirani slijed nukleotida slične duljine 3xmir16 također umetnuta 3'UTR hNIS /oscilacije fuzijskog gena kako bi se dobila kontrolni konstrukt (GV260-hNIS /oscilacije-otimati. Dobiveni su Slijed 3xmir16 slijed ili otimati žarenjem sljedeće nukleotide : pregled

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 'pregled

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3' pregled

otimati-FW: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3' pregled

otimati-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA pregled

Želučani kultura stanica raka i stabilne stanične linije generacija pregled

Ljudski rak želuca stanične linije SGC7901 i njegova multirezistentnog varijanta SGC7901 /VCR (uspostaviti i održavati u našem laboratoriju, kao što je ranije opisano [11]) uzgojene su u RPMI-1640 mediju nadomještenom s 10% seruma goveđeg fetusa i 100 jedinica penicilina i 100 ug /ml streptomicina (Invitrogen ). Održavati MDR fenotip, vinkristin (s konačnom koncentracijom od 1 g /ml) se doda u medij kulture na SGC7901 /VCR stanica. Za generiranje stabilne stanične linije, lentivirus vektor GV260-hNIS /oscilacije ili GV260-hNIS /oscilacije-3xmir16 prvi put kontraučinak u 293T stanica s ambalaže plazmida (, gag, pol VSV-G
). Medij za rast se mijenja u 6 sati nakon transfekcije i supernatant lentivirus sadržava se skupi na 48 sati nakon transfekcije. Dobivenih supernatanti su centrifugirani na 4000 g tijekom 10 minuta do pelete staničnog otpada. Koncentriran virus titriran na 293T stanicama. SGC7901 stanice i SGC7901 /VCR stanice se transducirane s GV260-hNIS /oscilacije i GV260-hNIS /oscilacije-3xmir16 virusa, odnosno pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 10. Nakon toga, stanice su ispitana s puromicinom za 3 tjedna i stanične kolonije prikupljaju se proširio za sljedeći korak eksperimenata pregled

RNA oligonukleotida i transfekcija pregled

Mirna-16 i negativna kontrola (NC) RNA oligonukleotida su sintetizirani (Shanghai GenePharma Kina) koristeći sljedeće sekvence.: pregled

Mirna-16 razum: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 'pregled

Mirna-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3' pregled

NC osjećaj: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3' pregled

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 'pregled

Prije transfekcije SGCC7901 stanice su nasađene u 1 × 10 ^{5 stanica po jažici, u 24 jažica i rastu kroz 24 h. Transfekcija je vršena uz reagens lipofektamin 2000 (Invitrogen), prema uputama proizvođača. Sve transfekcije provedene su u triplikatu. Pregled}

kvantitativni PCR u realnom vremenu (QRT-PCR) analiza pregled

Ukupna RNA je izolirana iz kultiviranih stanica pomoću Trizola (Invitrogen). RT je izvedena s PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japan) i qPCR je izvedena s Brzo SYBR Green Master Mix (tnom City, CA) i ABI StepOne Plus Real-time PCR sustava (Applied Biosystems) prema uputama proizvođača , PCR proizvodi su analizirani na 3% agaroznom gelu. Relativna količina Mirna-16 je normaliziran U6 snRNA. I relativna količina oscilacije normalizirana je GAPDH gena. Fold-promjena za Mirna-16 ili oscilacije gena iz eksperimenta grupe u odnosu na kontrolnu skupinu izračunat je pomoću 2 ^{-ΔΔCt metoda, gdje ΔΔCt = ΔCt eksperiment - ΔCt kontrola i ΔCt = Ct Mirna - Ct U6 ili ΔCt = Ct oscilacije - Ct GAPDH. PCR je izvršena u triplikatu. Klice se koriste za matičnih petlje RT-PCR za Mir-16 navedeni su kako slijedi: pregled}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 'pregled

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 'pregled

mir-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3' pregled

mir-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 'pregled

mir-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' pregled

oscilacije-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 'pregled

oscilacije-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3' pregled

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 'pregled

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3' pregled

Western blot analiza pregled

SGC7901 stanice su isprane tri puta s PBS-om i zatim lizirane u hladnom puferu za lizu (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 1% Triton X-100 i 1% aprotinina) kroz 30 min na ledu. Stanični lizati su potom centrifugirani na 12000 rpm tijekom 15 minuta na 4 ° C. Supernatant se sakupi i identične količine proteina se mogu razdvojiti pomoću 8% SDS-PAGE i zatim se prenesu na nitrocelulozne membrane. Membrane se inkubiraju u blokirajućoj otopini koja sadrži 5% BSA kroz 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim se imunoblot s navedenim antitijelima. Imunološki reaktivne bendovi su vizualizirani pomoću hemiluminiscencija kit (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ). Pregled

MTT test pregled

Za određivanje stope rasta od NF-prazan, NF-3xmir16 i NF-3xmir16 /stanica VCR, ta tri tipa stanica su inokulirani u 96 jažica s istim brojevima (5000 stanica) po bazenčiću. U različitim vremenskim točkama (24, 48, 72, 96 h), 25 ul 5,0 mg /ml sterilno filtrira 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazolij-bromid (MTT; Sigma) je dodan u svaku jažicu. Neizreagirani boja uklonjena je nakon 4 h inkubacije, a netopljivi formazan kristali otope u 100 ul dimetilsulfoksida (DMSO). Apsorbancija na 570 nm (referentna valna duljina, 630 nm) je mjerena s Sinergija II višemodno mikro ploče čitača (Biotech Instruments, VT). Pregled

Radioaktivni unos jodid Test pregled

Kako prepoznati vezu između jodida unos i broj stanica, serija razrjeđenja stanica su inokulirani u 24 jažica. Nakon 12 h inkubacije, ^{131I razina preuzimanje je ispitan. Upijanje jodid je određena inkubacijom stanica s 500 ul Hanksovoj balansiranoj otopini soli (HBSS) koja sadrži 0,5% albumina goveđeg seruma sa 37 kBq iz bez nosača Na 131I i 10 mM Nal 30 min. Nakon inkubacije, stanice su isprane dva puta brže moguće s 1 ml ledeno hladnog HBSS pufera. Stanice su odvojene s 200 uL tripsinom, a radioaktivnost je izmjerena pomoću y-brojača (Perkin-Elmer). Procijeniti funkcionalnu ekspresiju hNIS u sustavu reporter-gena, NF-3xmir16 stanice su posađene u na 1 × 10 5 stanica po jažici, u 24 jažica na dan prije transfekcije, pa Mirni-16 i NC oligonukleotida su transfektirane , 24 sata kasnije, dimnjak jodid su mjerene kao što je gore opisano. Pregled}

In vitro pregled bioluminiscencija slike Test pregled

Kako prepoznati odnos između luminiscencije signala i broja stanica, serija za razrjeđivanje stanica su inokulirani u 24 jažica. Nakon 12 sati inkubacije, u svaku jamicu se ispere s fosfatnim beffered slane otopine (PBS). Zatim D-luciferin (Xenogen) u koncentraciji od 0,5 mmol /L dodana odmah prije testa. Bioluminiscencija je mjerena s Ivis 100 Imaging sustav (Xenogen) i analizirani pomoću verziju Dnevni slike softver 2.50 (Xenogen). Procijeniti funkcionalnu ekspresiju oscilacije u sustavu reporter-gena, NF-3xmir16 stanice su posađene u na 1 × 10 ^{5 stanica po jažici, u 24 jažica na dan prije transfekcije, pa Mirni-16 i NC oligonukleotida su transfektirane , 24 sata kasnije, ispitivanje je bioluminiscencija se mjeri kao što je gore opisano. Pregled}

bioluminiscentni i ^{99mTc-pertehnetata slike na miševe}

jednakih brojeva (5 × 10 ^{6 stanica) NF-prazna i NF-3xmir16 ili NF-3xmir16 /VCR i NF-3xmir16 stanice, bile su cijcpljcno strano tkivo potkožno u lijevu i desnu stražnju stranu od svakog golog miša kao što je navedeno u rezultatima. Bioluminiscentni slikanje je kupio jedan dan nakon injekcije stanica. Svi miševi su anestezirani s 2,5% izofluran plinom kisikom, pri protoku od 1,5 L /min. Vodena otopina D-luciferine (150 mg /kg tjelesne mase) se injektira perkutano 10 min prije snimanja. U cijelo tijelo slike za oscilacije signala su stekli tijekom 2 min i živa slika software (Xenogen) je pokrenut kako bi se dobila bioluminiscentne slike. ROI je izabran i ručno preko intenziteta signala. Bioluminiscencija signali su izraženi kao fotona u sekundi po kubičnom centimetru po steradijanu (p /s /cm 2 /sr) unutar ROI. Pregled}

Za nuklearnog slikanja, lučne su intraperitonealno ubrizgan 18,5 MBq od ^{99mTc-pertehnetata na 2weeks nakon ubrizgavanja stanica. 30 min nakon injekcije, životinja je stavljen u poziciju u širenju-ležeći na krevetu u SPECT skenera (Symbia T2, Siemens). Anestezija je izvedena s 1% do 2% izoflurana u 100% O _{2 tijekom injekcije i slike. Sve slike su rekonstruirane sa 2-dimenzionalni naručene-podskupovi očekivanja maksimalno algoritam. Aktivnost se kvantificira pregledom područja interesa (ROI) u tumorima i na području ROI je bio konstantan za sve nuklearne i optičkih slika. Nakon bioluminiscentnih i 99mTc-pertehnetata slike, tumori su sakupljeni i izvagani. Pregled}}

Statistička analiza pregled

Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Podaci prikazuju usporedbu između dvije skupine određene su korištenjem Student t-testa. Usporedbe više od dvije skupine određene su analizom varijance (ANOVA) s odgovarajućim ispitivanjem posthoc. Vrijednosti <P;. 0,05 smatrane su statistički značajne pregled

Rezultati

Uspostava želučanih staničnim linijama karcinoma koje stabilno eksprimiraju hNIS i oscilacije gene pregled

Za generiranje reporterski gen fusion (GV260- hNIS /oscilacije, s obzirom na NF-prazno) je hNIS cDNA je klonirana u vektor lentivirusa (GV260-oscilacije-puro) koji kodira gen oscilacije za generiranje fuzijski protein, koji je pod kontrolom ubikvitinski promotor. Zatim tri primjerka komplementarne sekvence protiv Mirne-16 (3xmir16) su umetnuta nakon stop kodona fuzijskog gena hNIS /oscilacije generirati novi konstrukt (GV260-hNIS /oscilacije-3xmir16, iz NF-3xmir16) (Slika 1A). Kodirani slijed nukleotida slične duljine 3xmir16 također umetnuta 3'UTR hNIS /oscilacije fuzijskog gena kako bi se dobila kontrolni konstrukt (GV260-hNIS /oscilacije-scramble, iz NF-otimati). In vitro pregled bioluminiscencija snimka pokazala je da se genske aktivnosti oscilacije od NF-praznih ćelija bila je slična onoj od NF-otimati stanica (Slika S1A). Tako smo izabrati NF-prazan konstrukt u daljnjem studiju. Dvije stanične linije, A MDR ljudski rak želuca stanična linija SGC7901 /VCR i njegova roditeljska stanična linija SGC7901, su transduced s lentivirasa koji sadrži NF-prazna ili NF-3xmir16 gen, odnosno da se uspostavi tri stabilne stanične linije NF-prazan /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 i NF-3xmir16 /SGC7901 /videorekorder (u daljnjem tekstu NF-prazan, NF-3xmir16 i NF-3xmir16 /VCR). Najprije smo obavili MTT testa za mjerenje stope rasta tih tri stanične linije (Slika S1B). Onda smo izvedeno qPCR testom ispitati objedinjenih kopije reporter konstrukta u tri stanične linije (Slika S1C). In vitro pregled bioluminiscencija slike (Slika 1B) i zapadne upijajući (slika 1C) dodatno su provedena kako bi pokazali uspješnu ekspresiju oscilacije i hNIS gena u ove tri stanične linije. Pregled

Linearnost korelacija oscilacije i transgen aktivnosti hNIS s brojevima mobilnih in vitro

Da bi se procijenila oscilacije i hNIS transgena koji aktivnosti u stanicama, proveli smo in vitro
bioluminiscencija slike i ^{131 radioiodide Probe u nizu razrjeđenja od NF-3xmir16 staničnim linijama. Kao što je prikazano na Slici 1D, prema povećanja broju stanica, akumulacija luminescencije također povećana. Bioluminiscencija signali su našli dobro korelira s brojem stanica (γ 2 = 0.9990) (Slika 1E). U međuvremenu, 131I upijanje također je povećana sa brojevima stanica (Slika 1 f). Unos radioiodide uočeno je dobro povezana (γ 2 = 0,9543) s brojevima stanica (Slika 1 g). Jer oscilacije je spojeni s hNIS, dobro korelacija između intenziteta bioluminiscencijom i 131I radioaktivnosti je uočena u stanicama u skladu s analizom linearne regresije (γ 2 = 0,9339) (Slika 1 H). Pregled}

Validacija Mirna-16 aktivnosti preko pregled sustava reporter gena pregled

da bi se testiralo da li NF-3xmir16 reporter vektor koji sadrži Mirna-16 ciljne sekvence je potisnuta egzogenog Mirna-16, ispitali smo aktivnost oscilacije i hNIS nakon uvođenja Mirna-16. U usporedbi sa stanicama koje su transfektirane s NC oligosa je bioluminiscencija signal je smanjen za 35%, u stanicama koje su transfektirane s Mirni-16 (slika 2a i 2b). I ^{131I radioiodide unos u Mirna-16 inficiranim stanicama bio je oko 70% da je u NC inficiranim stanicama kvantificirati radioaktivnim brojanjem (Slika 2C). I aktivnost oscilacije i hNIS smanjeni su na način koji ovisi o dozi (Slika S1D-F). Ovi podaci pokazuju da je NF-3xmir16 reporter konstrukcije može se modulirati Mirna-16. Pregled}

Detekcija endogenog Mirna-16 izražavanja In vitro pregled i In vivo pregled

za otkrivanje endogene Mirna-16 razina ekspresije u želučanih stanica raka In vitro pregled, jednak broj (1 × 10 ^{6) NF-prazna i NF-3xmir16 stanice su posađene, a zatim aktivnost oscilacije i hNIS su ispitani. Kao što je prikazano na slici 2D i 2E, oscilacije aktivnost koja proizlazi iz NF-3xmir16 stanica je smanjen za oko 50% endogenog Mirna-16 u usporedbi s onima sa NF-praznih ćelija. A hNIS aktivnost od NF-3xmir16 stanica također je smanjen za oko 40%, kao odgovor na endogene Mirna-16, za razliku od toga sa NF-praznim stanicama (Slika 2F). Nedostatak represiju oscilacije ili hNIS aktivnosti promatrane u NF-prazne ćelije u pogledu da nema Mirna-16 ciljna mjesta u NF-prazan konstrukt. Pregled}

Dvostruki slike reporter gena sustav omogućio u vivo pregled vizualizacija endogenog Mirna-16 ekspresije u želučanim stanicama raka. Jednake (1 × 10 ^{7) NF-prazne i NF-3xmir16 stanice su cijcpljcno strano tkivo supkutano u lijevo i desno stražnje bočne strane golih miševa (n = 6), a zatim bioluminiscentni slike i 99mTc-pertehnetata gama kamere slike su stečene. Kao što je prikazano na Slici 2G, intenzitet luminescencije od usađenih NF-3xmir16 stanicama je oko 55% manja od one od NF-prazne stanice, slično za razliku aktivnosti luciferaze mjerena in vitro pregled (Slika 2D i 2E). Nakon interperitonelanog injektiranja 99mTc-pertehnetata na 18.5 MBq, gama kamere slike je izvršena. Za razliku od NF-prazna tumora, koji su pokazali istaknuto unos 99mTc-pertehnetata, NF-3xmir16 tumora pokazalo je zanemariv unos (Slika 2H), što ukazuje na endogeni Mirna-16 smanjena izraz hNIS. Fiziološko unos je također uočeno na mjestima štitnjače, želuca i mjehura, u kojem hNIS obično se izražava. Područja interesa (ROI) je analiza pokazala da hNIS aktivnost značajno smanjio u NF-3xmir16 ksenografta usporedbi s onim u NF-praznim stranih tijela (Slika 2 H). Nakon snimanja, prikupili smo i izvagao NF-prazne i NF-3xmir16 tumora (Slika S1G). Rezultati su pokazali da imaju iste težine, pokazalo je da su razlike u intenzitetu signala doista zbog endogenog Mirna-16 funkcija, ali ne i broj stanica. Pregled}

Vizualizacija izražavanja promjene Mirna-16 u MDR stanice raka želuca in vitro pregled i In vivo

promjena izraz Mirna-16 u rezistentne stanice raka želuca droga otkrivena je preko pregled aktivnosti oscilacije i hNIS strane bioluminiscencija slike i ^{131 unosa radioiodide analiza. Oba oscilacije aktivnosti (slika 3A i 3B) i aktivnost hNIS (Slika 3C) porasla je za oko 1,5 puta u NF-3xmir16 /VCR stanica u usporedbi s onom u NF-3xmir16 stanica, koje je predložio da se Mirna-16 je regulirani u NF-3xmir16 /VCR stanice. Za potvrđivanje rezultata dobivenih pomoću sustava reporter gena, kvantitativna RT-PCR (Q-PCR) provodi se na analizu diferencijalne ekspresije Mirne-16 u ove dvije stanične linije. U skladu s podacima reporter gena sustava, Q-PCR pokazale smanjenu Mirna-16 razina u NF-3xmir16 /videorekorder u odnosu na svoje kolege NF-3xmir16 stanice (slika 3D). Pregled}

Za neinvazivnom kvantitativno praćenje miRNA- 16 diferencijalne ekspresije u MDR stanice raka želuca u vivo
, bioluminescentnog slike i ^{99mTc-pertehnetata gama kamere slike su izvedene. Bioluminiscentni slike pokazala je da luminiscencije signali su 1,7-struko povećanje u ksenografta NF-3xmir16 /VCR odnosu NF-3xmir16 ksenografta (Slika 3e), u skladu s povećanjem od aktivnosti luciferaze mjerena in vitro pregled (Slika 3A i 3B). Injekcija 99mTc-pertehnetata i stjecanje gama kamera slike pokazuju da znatno veću akumulaciju 99mTc-pertehnetata zabilježeno je u NF-3xmir16 /VCR ksenografta nego da je u NF-3xmir16 ksenografta. Fiziološka 99mTc-pertehnetata akumulacije su također promatrana u štitnjači, mjehura i želuca (Slika 3f). A NF-3xmir16 i NF-3xmir16 /tumori VCR imali iste težine (Slika S1H). Pregled}

VP-16 i 5-FU uzlazni Mirna-16 izražavanja neinvazivno snimljen sa sustavom gena dvostrukom reporter

da bi se utvrdilo jesu li drugi antitumorski lijekovi mogu mijenjati Mirna-16 profil izlučivanja, pet kliničkih lijekovi za rak želuca su dodani NF-3xmir16 stanica, nakon čega slijedi in vitro
bioluminiscencija slike i ^{131 unosa radioiodide analiza. Rezultati su pokazali da je intenzitet luminescencije (Slika 4A i 4B), odnosno stanični jodid unosa (Slika 4E) su znatno smanjena izloženost VP-16, 5-FU i CDDP, ali ne MMC i ADR tretmana u odnosu na one nontreated stanice. pregled}

razlozi smanjenja signala promatrati u VP-16, 5-FU i CDDP liječenje može biti da je droga aktiviraju endogenog Mirna-16 izražavanja ili inhibiran rast stanica i izazvao smrt stanica. Kako bi se isključila potonju mogućnost, pet Lijekovi su dodani u NF-prazna stanica koje sadrže nikakve Mirna-16 ciljna mjesta u konstrukt. in vitro
bioluminiscencija slika rezultati pokazuju da VP-16 i 5-FU nema inhibitorni utjecaj na intenzitet luminescencije, dok CDDP dalje smanjio luminiscencije signala (Slika 4C i 4D), što pokazuje da CDDP može inhibirati stanične rast, ali ne i aktivirati endogenog Mirna-16 izraza. S druge strane, MMC i ADR Utvrđeno je da su neznatno povećati intenzitet luminiscencije u obje NF-3xmir16 i NF-praznih stanica (Slika 4A-D), koje može doći zbog promicanja staničnu proliferaciju. Pregled

Kako bi se uvjerili da Mirna-16 aktivacijski sudjelovao u antikancerogene efekte iz VP-16 i 5-FU, Q-PCR su izvedene za određivanje razine Mirna-16 u NF-3xmir16 stanice izlaganja na citostatike tretmane. S tim u skladu, Mirna-16 ekspresija značajno doregulirano nakon VP-16 ili 5-FU tretmana u SGC7901 stanicama u usporedbi s netretiranim kontrolnim stanicama, dok MMC, ADR i CDDP imala manji učinak na Mirni-16 ekspresije (slika 4F). Pregled

Povećana Mirna-16 ekspresije VP-16 i 5-FU su uključeni u p38 MAPK, ali NF-kB signalizacije pregled

Kao i modulaciji RNA gena za kodiranje proteina, transkripcija Mirna gena pojavljuje se regulira se više signalnih putova. Aktivacija NF-kB ili MAPK signalnih putova je uobičajeni odgovor slijedi kemoterapijskih lijekova [17], [18]. Dakle, pretpostavili smo da je uzlazni Mirna-16 mogla bi biti posljedica povećane aktivacije NF-kB ili MAPK nakon VP-16 ili 5-FU liječenja. Rasvijetiliti ulogu ovih signalnih puteva u VP-16 i 5-FU-induciranu transaktivacije Mirne-16, prvo smo mjerili intenzitet luminescencije u NF-3xmir16 stanica kao odgovor na VP-16 i 5-FU, u prisutnosti ili odsutnosti farmakoloških inhibitorima na NF-kB ili p38 MAPK. Tretiranje stanica sa specifičnog inhibitora NF-kB, Bay 11-7082, nije imao učinka na luminiscencije signal u usporedbi sa stanicama tretiranog lijeka bez inhibitora (Slika S2). Pregled

Nasuprot tome, tretman s određenom p38 inhibitor MAPK, SB203850, izrazito spasio smanjenje bioluminiscencijom (slika 5A i 5B) ili jodida unosa (Slika 5C), od VP-16 i 5-FU u usporedbi sa tretiranim kontrolnim stanicama. Za potvrdu Mirna-16 razina ekspresije u prisustvu SB203850, real time PCR je proveden a rezultati su pokazali da je inhibitorni p38 MAPK drastično potisnuta VP-16 i 5-FU-inducirana Mirna-16 regulaciju (Slika 5D), što znači da povećana Mirni-16 ekspresijom VP-16 i 5-FU koji su uključeni u p38 MAPK signalnim putem, pregled

prethodna studija pokazalo je da bcl-2 proteina je izravna ciljanog gena Mirni-16 u razvoju MDR u SGC7901 želučanih stanica raka [11]. Da bi testirali da li Bcl-2 je uključen u VP-16 i 5-FU stimulacije Mirna-16 preko
p38 MAPK puta, utvrdili smo Bcl-2 nivo proteina Western blot analizom. Kao što je prikazano na slici 5E i 5F, VP-16 i 5-FU značajno smanjila razinu bcl-2 proteina od 50% u usporedbi s neobrađenim kontrolnim stanicama u odsutnosti SB203850. Nakon tretmana uz SB203850, smanjenja bcl-2 proteina drastično se oslabljena, što ukazuje na važnost p38 MAPK aktivacije u VP-16 i 5-FU-induciranu silazni bcl-2 protein. Pregled

In vivo pregled praćenja pojačane Mirna-16 ekspresiju VP-16 i 5-FU pregled

Za neinvazivnom praćenje pojačane Mirna-16 ekspresije inducirane VP-16 i 5-FU, NF-prazan i NF -3xmir16 stanice su cijepljeni na lijevu i Desni stražnji ud svakog miša (n = 6), respektivno. Da bi se izbjegla bioluminiscenciju signal sa NF-prazna ometa da se od NF-3xmir16 tijekom liječenja lijekom, različit broj NF-prazan (1 × 10 ^{5 stanice) i NF-3xmir16 (1 × 10 7 stanice) se cijepi. Kao što je prikazano na slici 6, značajno smanjuje intenzitet bioluminiscencija zabilježeno je NF-3xmir16 ksenografta nakon VP-16 i 5-FU tretmana u usporedbi s neliječenja. Konkretno, u miševa tretiranih s VP-16 je bioluminiscencija signal smanjen za oko 40% u NF-3xmir16 ksenografta dok blago povećana za NF-prazne ksenografta nasuprot drugoj liniji liječenja slika (Slika 6A i 6B), isto tako za razliku intenziteta luminescencije koje su izazvane od strane VP-16 In vitro pregled (Slika 4A-D).}

• PLoS ONE: mikrornk-219-2-3p djeluje kao supresor tumora na rak želuca, a reguliran je DNK Methylation
• PLoS ONE: pridruživanju između glutation S-transferaze T1 Null genotipa i rak želuca rizika: meta-analiza 48 Studies