PLoS ONE: Reg IV on suora Tavoite Suolen transkriptiotekijä CDX2 mahalaukun Cancer

tiivistelmä

REG4
, joka koodaa Reg IV proteiinia, on jäsenenä kalsiumista riippuvan lektiini superperheen ja mahdollinen aktivaattori, epidermaalisen kasvutekijän reseptori /Akt /aktivaattoriproteiini-1 signalointireitin. Useat ihmisen syövissä yli-ilmentävät Reg IV, ja Reg IV ilmentyminen liittyy suoliston fenotyypin erilaistumisen. Kuitenkin sääntely REG4
transkriptio jää epäselväksi. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet, onko CDX2 säätelee Reg IV ilmentymisen mahasyövässä (GC) soluja. Expression of Reg IV ja CDX2 analysoitiin Western blot ja määrälliset käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio 9 GC-solulinjoissa ja 2 koolonsyöpäsolulinjoissa. Toiminto 5'-reunustava alue on REG4
geeni tunnusomaista lusiferaasianalyysissä. 9 GC solulinjoissa, endogeeninen Reg IV ja CDX2 ilmaisun korreloivat hyvin. Käyttämällä estrogeenireseptori-säänneltyjen muoto CDX2, nopea induktio Reg IV ilmentymistä havaittiin HT-29-soluja. Reportteri geeni analyysit paljastivat tärkeä rooli transkriptio konsensus CDX2 DNA: n sitoutuminen elementtejä 5'-reunustava alue on REG4
geeni. Kromatiinin immunosaostusmäärityksissä osoitti, että CDX2 sitoutuu suoraan 5'-reunustavan alueen REG4
. Nämä tulokset osoittavat, että CDX2 proteiini suoraan säätelee sääntö IV ilmaisun.

Citation: Naito Y, Oue N Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV on suora Tavoite Suolen transkriptiotekijä CDX2 mahasyövän. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2012; Hyväksytty: 12 syyskuu 2012; Julkaistu: 02 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-tuki Research opetus-, kulttuuri-, tiede-, urheilu, ja tekniikka Japani, ja osittain jota Grant-in-tuki kolmannen Kattava 10-Year strategia Cancer Ohjaus ja Cancer Research terveysministeriön, Labour and Welfare Japanin, ja National Institute of Biomedical Innovation (Program for edistäminen Fundamental Studies in Health Sciences). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien maailmassa. Syöpä kehittyy seurauksena useiden geneettisten ja epigeneettisten muutokset [1]. Olemme aikaisemmin suoritettu sarja analyysi geenien ilmentymistä (SAGE) neljän ensisijaisen GC ja tunnistettu useita GC-geenit [2]. Näistä geeneistä, regeneroituva luoto johdettu perheenjäsen 4
( REG4
, joka koodaa Reg IV proteiinia) on ehdokkaana geeni syövän ekspressio [3]. REG4
on jäsenenä REG
geeniperheen, joka kuuluu kalsiumista riippuvan lektiini Yläheimo. REG4
alun perin tunnistettiin suuren suoritustehon sekvenssianalyysi suuri tulehduksellinen suolistosairaus cDNA-kirjasto [4]. Reg IV on voimakas aktivaattori epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) /Akt /aktivaattori proteiini-1 (AP-1) signalointireitin paksusuolen syövän soluja ja lisää ekspressiota Bcl-2, Bcl-xl ja surviviinista, jotka ovat proteiineja liittyy apoptoosin [5]. Monistaminen REG4
geeni on raportoitu haimasyövän [6]. Reg IV on tunnistettu yhdeksi geeneistä säädellään ylöspäin syöpään aloittamista solujen [7]. Olemme aiemmin tutkineet vaikutus pakko ilmentymisen Reg IV GC solulinjassa. Olemme osoittaneet, että Y-IV estää 5-fluorourasiilin (5-FU) aiheuttaman apoptoosin kautta EGFR aktivaation GC-soluissa [8]. Sen sijaan Reg IV-yliekspressoivia solut eivät osoittaneet merkittäviä eroja leviämisen ja invaasion aktiivisuutta verrattuna soluihin transfektoitu tyhjällä vektorilla [8]. Tulokset tukevat käsitystä, että Reg IV proteiini osallistuu mahasyövän.

GC voidaan jakaa neljään fenotyypit mukaan musiiniekspressiota: maha- tai foveolar fenotyyppi; suolen fenotyyppi; suoliston ja mahalaukun sekoitetaan fenotyyppi; ja kumpikaan mahalaukun tai suoliston fenotyyppi [9]. Selvät geneettisiä muutoksia näyttävät liittyvän mahalaukun ja suoliston fenotyypin GC [10]. Meidän aiempien huomautusten, Reg IV ilmaistiin 30% GC tapauksissa ja korreloi suoliston fenotyyppiin [11]. Useat immunohistokemiallisen analyysin Reg IV on raportoitu ihmisen syövissä, [11] - [20]. Yleisesti, nämä analyysit on raportoitu, että Y-IV ilmentyy adenokarsinoomasoluja näytetään suoliston fenotyyppi. On raportoitu, että Y-IV ekspressio indusoi GLI1, joka on keskeinen transkriptionaalinen tekijä Hedgehog signalointireitin [21], tai kasvutekijät, kuten EGF, transformoiva kasvutekijä-α (TGF-α), hepatosyyttikasvutekijä (HGF), tai emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) [22]. Nämä molekyylit ovat todennäköisesti selittää yhdistyksen välillä Reg IV ilmaisun ja suoliston fenotyypin erilaistumisen.

Olemme aikaisemmin havainneet, että ilmentyminen Reg IV korreloi CDX2 ilme [11]. CDX2 on nisäkkään caudal liittyvä suoliston transkriptiotekijän ja tärkeä ylläpito suolen epiteelisolujen [23], [24]. Useat tekijät osoittavat, että suoliston metaplasia mahan ja suoliston fenotyypin GC liittyy ektooppinen CDX2 ilmaisun [9], [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet, onko CDX2 säätelee Reg IV ilmentymisen GC ja havaitsi, että CDX2 sitoutuu suoraan 5'-reunustavan alueen REG4
geenin ja parantaa promoottorin aktiivisuutta.

Tulokset

Reg IV ja CDX2 Expression korreloivat GC Solut

ensimmäinen tutkittiin induktio Reg IV ilmentymisen CDX2 GC solulinjoissa. Western blot-analyysi CDX2 9 GC-solulinjoissa ilmeni, että mitään tai matalan tason ilmentymistä CDX2 havaittu MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO III (Fig. 1A). Sen määrittämiseksi, CDX2 ja Reg IV ilmaisun olivat tiukasti korreloivat GC soluissa, Western blot ja määrällinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) analyysit Reg IV tehtiin 9 GC solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, Reg IV proteiinin ilmentyminen havaittiin vain 3 solulinjoissa, joilla on korkea REG4
selostukset mitattuna qRT-PCR. Niistä 5 GC solulinjoissa CDX2 proteiinin ilmentymistä, 2 solulinjat (MKN-1 ja MKN-28) puuttui havaittava ilmentyminen REG4
selostukset ja proteiinia. Solulinjaa havaittavissa CDX2 proteiinin ilmentymisen (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO-III) ei osoittanut REG4
transkriptien tai proteiini (Fig. 1A).

Seuraavaksi generoidaan polyklonaalinen populaatio MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO III solut, jotka ekspressoivat korkeita CDX2 infektoimalla solut replikaation retrovirukset kuljettavat täyspitkä ihmisen CDX2 cDNA, koska tai ei matalan tason ilmentymistä CDX2 havaittiin näissä solulinjoissa. Kuitenkin, yli-ilmentyminen CDX2 ei aktivoida Reg IV ilmentymisen Western blot (tuloksia ei ole esitetty). Koska on mahdollista, että CDX2 yksin ei ole riittävä aktivoimaan Reg IV ilmentymisen ilmentyminen CDH17
(koodaus LI-kadheriinin proteiini), joka on yksi tavoitteista CDX2 [24], tutkittiin myös. Kuitenkin aktivointi LI-kadheriinin ilmentyminen ei havaittu MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO III solut, jotka ekspressoivat korkeita tasoja CDX2 (tuloksia ei ole esitetty). Koska me, ilmeni aktivoitumista LI-kadheriinin ilmentymisen CDX2 HT-29 koolonisyöpäsolulinja [24], induktio Reg IV ilmentymistä tutkittiin samassa solulinjassa. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, induktio Reg IV ekspressiota havaittiin HT-29-soluja infektoitiin retroviruksilla kuljettaa ihmisen täyspitkän CDX2 cDNA. Meillä on myös tuotettu polyklonaalinen populaatio SW480 (paksusuolen syövän solulinja) solut, jotka ekspressoivat korkeita CDX2 infektoimalla solut replikaation retrovirukset kuljettavat täyspitkä ihmisen CDX2 cDNA. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, induktio Reg IV ekspressio havaittiin SW480-soluja infektoitiin retroviruksilla kuljettaa ihmisen täyspitkän CDX2 cDNA. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Reg IV ilmentyminen voidaan indusoida CDX2 solulinjoissa, jotka ovat peräisin paksusuolen syöpä. Koska suolen metaplasiaa mahan, CDX2 ja Reg IV ilmaisun hyvin korreloi [11], käyttö koolonisyöpäsolulinja voisi olla sopiva malli suoliston metaplasiaa.

Paremmin välisen suhteen arvioimiseksi CDX2 ja Reg IV ilmaisun, tutkimme Reg IV ilmentymistä HT-29-johdettu linjassa säädeltyä CDX2 aktiivisuutta. Käytimme polyklonaalinen HT-29-solulinjaa, joka oli transdusoitu pCDX2-ER vektori. PCDX2-ER vektori koodaa kimeeristä proteiinia, jossa täyspitkän CDX2 sekvenssit fuusioidaan ylävirtaan mutatoitua estrogeenireseptorin (ER) ligandia sitovan domeenin. Mutatoidun ER ligandisitoutumisdomeenista enää sitoo estrogeeni, mutta säilyttää kyvyn sitoa tamoksifeenin. Hoito HT-29 /CDX2-ER solulinja 4-hydroksitamoksi- (4-OHT) johti vahva induktio Reg IV proteiinin ilmentymisen 48 tunnin kuluessa (Fig. 1 C). Nämä tulokset osoittavat, että Reg IV on suora tai ensisijainen kohdegeenin säätelee CDX2. Kuitenkin CDX2 yksin riitä aktivoinnin Reg IV ilmaisun.

esto CDX2 RNA Interference (RNAi) Tulokset Down-regulation of Reg IV GC Solut

Voit selvittää CDX2 on välttämätöntä Reg IV ilmentymistä GC soluissa, olemme analysoineet estävä vaikutus CDX2 ilmentymisen RNAi tason Reg IV ilmentymisen HSC-39 solulinjaa koska korkea endogeenisiä CDX2 ja Reg IV ekspressiota havaittiin HSC-39 solulinjaa. CDX2-erityisiä pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) merkittävästi tukahdutti CDX2 proteiinin ilmentymistä 3 päivää transfektion jälkeen, ja ilmaus Reg IV Transkriptiä alassäädetty noin 50%: iin CDX2 siRNA HSC-39 verrattuna sen tasot ohjaus siRNA käsiteltyjä soluja ( kuva 1D). Nämä tulokset osoittavat, että CDX2 on mukana ylläpitää Reg IV geeniekspressiota.

Functional Characterization 5'-sivuava alue REG4
Gene by lusiferaasimäärityssysteamiä

tunnistamaan mahdollisia CDX2 ta sitovaa sivustoja REG4
promoottorialueen, etsimään geenisekvenssejä välittömästi 5'-olettamaa transkription aloituskohdasta suoritettiin käyttäen konsensus sitova tekijä CDXA kana caudal
homologin (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 ') [26], ja aiemmin kuvattu algoritmi [27]. Löydettiin neljä oletetun CDX2-sitoutumiskohdat 2 kiloemäksen (kb) 5'-reunustava alue on REG4
geenin (Fig. 2A). Nämä olivat: site A (5'- AATAATA-3 ', -1828--1834), sivusto B (5'-CTTTACAG-3', -901--908), sivusto C (5'- TTTTATGG-3 "-114--121), sivusto D (5'AATAATA -3 ', -90--96). Arvioimaan, millainen näiden oletettujen CDX2 sitovaa kohtaa säätelyssä REG4
transkriptio, eri reportterigeenirakenteilla kertyi. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, reportterigeenirakenteilla sisältävän 2,1, 1,2 tai 0,6 kb 5'-sivuava sekvenssi REG4
geeni osoitti voimakasta aktiivisuutta HSC-39-solut, jotka osoittavat vahvaa endogeenistä ilmaus REG4
selostukset ja proteiinia. Vertailun, MKN-1-soluja on vähän endogeenista REG4
transkriptio ja näytetään vain vähän tai ei lainkaan transkriptionaalista aktiivisuutta indusoi 2,1, 1,2, tai 0,6 kb REG4
reportterigeenirakenteilla (tuloksia ei ole esitetty) . REG4
reportterigeenirakenteilla sisältävä emäsparia -116-+58 ja -87-58 oli vähentänyt aktiivisuutta HSC-39-soluissa (kuvio. 2B), mikä osoittaa, että sekvenssit emäsparia -634 ja - 116 avainasemassa aktivoimisessa REG4
transkriptio. Lisäksi olemme analysoineet yhden ja useiden mutaatioiden oletetuilla CDX2 sitovat kohdat 5'-reunustava alue on REG4
geeni käyttäen HSC-39-soluissa (kuvio. 2C). Kuten odotettua, oletetuilla CDX2 sitovaan kohtaan C, joka sijaitsee välillä emäsparia -634 ja -116, on keskeinen rooli aktivoinnissa REG4
transkriptio.

CDX2 sitoutuu suoraan 5 ' reunusse- alue REG4
Gene

analysoida, CDX2 sitoutuu suoraan otaksutun CDX2 sitovat kohdat REG4
5'-reunustava alue, teimme chromatin immunosaostuksella (chip), joissa käytetään HSC-39 soluihin. Käyttämällä 6 alukkeita REG4
5'-reunustavan alueen (Fig. 3A), me talteen DNA-fragmentit, jotka sisältävät REG4
5'-reunustavan alueen, jonka aluke 1, joka käsittää oletetun CDX2- sitoutumiskohta C (Fig. 3B). DNA-fragmenttien 5'-reunustavan alueen REG4
, joka muodostettiin käyttämällä alukkeita, 2, 3, 4, 5 ja 6 siten, että ne eivät sisällä oletetun CDX2 sitoutumiskohtia, ei talteen anti- CDX2 vasta-aine. Spesifisyys elpyminen REG4
promoottorialueen seuraavat piiri anti-CDX2 vasta-aine osoittaa se, että muut merkityksettömiä DNA-fragmentit puuttuu CDX2-sitoutumiskohtia (esim eksoni 3 CDX1
geeni) jäivät kattamatta (Fig. 3B). Lisäksi mock immunosaostus (hiiren IgG) tuotti muutaman REG4
tai CDX1
erityinen DNA-fragmenttien (Fig. 3B). Kaikki nämä löydökset viittaavat siihen, että CDX2 aktivoi REG4
transkription suoraan sitovia sekvenssejä 5'-reunustavan alueen geenin.

Trimethylation on histoni H3 lysiinin 27 (H3K27me3) on REG4
Promoottori GC Cell Lines

Vaikka CDX2-proteiinin ekspressio havaittiin MKN-1 ja MKN-28 solulinjat, nämä 2 solulinjat puuttui havaittava ilmentyminen REG4
transkriptio ja proteiinia. Koska on raportoitu, että DNA: n hypermetylaation CpG-saarekkeiden liittyy hiljentäminen useita geenejä [28], tutkimme, onko DNA: n metylaatio indusoiman transkription inaktivointi Reg IV MKN-1 ja MKN-28-soluissa. Käsittelimme nämä solut demetyloivan agentti, 5-atsa-2'-deoksisytidiini (atsa-dC) ja sitten suoritetaan qRT-PCR. Kuitenkin Reg IV ilmentymistä ei auta näissä solulinjoissa (tuloksia ei esitetty), mikä viittaa siihen, että DNA: n metylaatio ei todennäköisesti vaikuta Reg IV ilme. On myös raportoitu, että H3K27me3 on liittynyt tukahdutettu geenin ilmentymistä [29]. Tutkimme lisäksi H3K27me3 GC solulinjoissa. Voit selvittää rikastuminen H3K27me3 on REG4
promoottori GC solulinjoissa, siru määritykset suoritettiin. In MKN-1 ja MKN-28 solulinjat, H3K27me3 tasot REG4
promoottorialue oli suuri, kun taas HSC-39-solulinja, H3K27me3 tasolla REG4
promoottorialue oli alhainen (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että suljetun kromatiinin rakennetta REG4
promoottori voi estää Y-IV ilmentymisen CDX2.

Keskustelu

Vaikka on raportoitu, että Y-IV ekspressio indusoidaan GLI1 [21] tai EGF [22], nämä molekyylit eivät todennäköisesti selittää yhdistyksen välillä Reg IV ja suoliston erilaistumista. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että endogeeniset CDX2 ja Reg IV ilmaisun korreloivat hyvin GC solulinjoissa. Lisäksi käyttämällä ER-säännelty muoto CDX2, huomasimme, että siellä oli nopea induktio Reg IV ilmaisun jälkeen 4-OHT hoitoa. Reportteri geeni analyysit paljastivat tärkeä rooli konsensus CDX2 DNA: n sitoutuminen elementtejä REG4
promoottorialue sen transkription. Myöhemmät ChIP analyysit osoittivat, että CDX2 sitoutuu suoraan REG4
promoottori. Osoitimme aikaisemmin, että ensisijainen GC kudosten ja suoliston metaplasiaa mahan, CDX2 ja Reg IV ilmaisun korreloivat hyvin [11]. Nämä tulokset osoittavat, että CDX2 proteiini suoraan säätelee Reg IV ilmaisun GC ja suoliston metaplasiaa vatsaan.

CDX2 yliekspressoituu suoliston fenotyyppiin GC ja suolen metaplasiaa mahan [9], [25]. Sen sijaan, menetys CDX2 ilmentymistä havaittiin osajoukko ensisijaisen peräsuolen syöpiä, yleensä huonosti eriytetty paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [30]. Merkityksen muuttaminen CDX2 ekspression ihmisen syövissä on edelleen epäselvä, ja sen vuoksi on tärkeää määritellä kohde geenejä, jotka ovat alavirtaan CDX2. Olemme tunnistaneet useita CDX2 geenien kuten CDH17
(joka koodaa LI-kadheriinin) [24], HEPH
(joka koodaa hephaestin) [31], ABCB1
(joka koodaa monilääkeaineresistenssin 1) [32], ja DSc2
(joka koodaa desmocollin 2) [33]. Näistä geeneistä, ABCB1
alunperin identifioitiin ilmentynyt ja monistettu geeni useita lääkkeille vastustuskykyisiä soluja, ja sen tuote, P-glykoproteiinin, näyttää olevan keskeinen rooli lääkeresistenssin [34]. Aiemmin kerroimme, että pakko ilmentymistä Reg IV GC soluissa esti 5-FU-aiheuttaman apoptoosin induktion kautta Bcl-2 ja dihydropyrimidiinidehydrogenaasin [8]. Yhdessä on mahdollista, että suoliston fenotyypin GC, lauseke (tai ektooppinen lauseke) on CDX2 indusoi Reg IV ja monilääkeresistenttisyyttä 1 ilme, jolloin kasvu lääkeresistenssideterminantit. Itse asiassa se on raportoitu, että leikkauksen jälkeinen kemoterapia ei ole hyötyä potilaille, joilla on suoliston fenotyyppiin GC [35].

Vaikka tiedot tukevat näkemystä, että CDX2 on rooli säätelyssä REG4
transkriptio sitoutumisen kautta promoottorialueen, useita tulokset osoittavat, että CDX2 yksin ei ole riittävä aktivoimaan REG4
ilmaisua. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tuottaneet polyklonaalisia populaatio MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO III -soluja, jotka ilmentävät korkeita CDX2 infektio retrovirusten kuljettaa ihmisen täyspitkän CDX2 cDNA. Kuitenkin yli-ilmentyminen CDX2 ei aktivoida Reg IV ilme. GC solulinjat, yksikään solulinjojen havaittavissa CDX2 proteiinin ilmentyminen oli havaittavissa REG4
transkriptien ja proteiinin. Siksi CDX2 tarvitaan Reg IV ilmaisun, mutta CDX2 yksin riitä aktivoinnin Reg IV ilme. Esillä olevassa tutkimuksessa, yhdeksän GC solulinjat tutkittiin. Alkuperä solulinjojen olivat seuraavat. MKN-7, MKN-28, ja MKN-74 solulinjat perustettiin suolen tyyppiä GC. TMK-1 ja MKN-45 solulinjat perustettiin hajanaisista tyyppi GC. Kato-III, HSC-39, ja HSC-44PE solulinjat perustetaan sinettisormus cell carcinoma. MKN-1 solulinja perustetaan adenosquamous cell carcinoma. Koska suolen metaplasiaa mahan, CDX2 ja Reg IV ilmaisun hyvin korreloi, GC solulinjoja perustetaan hajanainen tyyppi GC tai sinettisormus karsinooma ei ehkä sovi analysointiin Reg IV indusoinnin CDX2. Itse asiassa, Reg IV ilmentyminen voidaan indusoida CDX2 solulinjoissa, jotka ovat peräisin paksusuolensyöpä esillä olevassa tutkimuksessa. Lisäksi osoitimme, että H3K27me3 tasot REG4
promoottorialue olivat suuret MKN-1 ja MKN-28 GC solulinjoissa. Nämä 2 solulinjat puuttui havaittava ilmentyminen REG4
vaikka CDX2 proteiinin ilmentyminen havaittiin. Siksi H3K27me3 tasot REG4
promoottori alue voi olla suuri MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, ja KATO III soluja, jossa yli-ilmentyminen CDX2 ei aktivoida Reg IV ilmaisua.

on raportoitu, että REG4
mRNA: n ekspressio on parannettu stimulaatio TGF-α, EGF, HGF, tai bFGF aktivaation kautta mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitti [22] . Siten voitaisiin hypoteesi, että Reg IV säätelee myös alavirran transkriptiotekijöitä MAPK polkuja. Suoritimme in silico
analyysit REG4
geenin 5'-reunustavan alueen, ja löysi ainakin yhden oletetuilla AP-1 konsensus-sekvenssit (at -883 emäsparia REG4
geenin 5'-reunustava alue), joka on alavirtaan transkription tekijä MAPK-signalointia. Esillä olevassa tutkimuksessa, HSC-39-solut osoittivat samanlaisia ​​transkriptionaalista aktiivisuutta reportterigeenirakenteilla, joka sisälsi 1,2 kb: n ja 0,6 kb: REG4
5'-reunustavan sekvenssin. Koska EGF tai TGF-α on REG4
transkriptio ei tutkittu tässä tutkimuksessa, lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään signalointimekanismeja jotka aiheuttavat sääntelyn REG4
transkriptio.

Johtopäätöksenä tämänhetkisiin tiedot osoittavat, että CDX2 proteiini suoraan säätelee sääntö IV ilme. Reg IV aktivoi EGFR /Akt /AP-1 signalointireitin. Kuten suoliston fenotyyppi GC ilmaisee usein EGFR [36], on ehdotettu, että tämä Reg IV-aktivoitua reitin tärkeä rooli tässä alatyyppiä GC. Koska CDX2 myös indusoi ilmentymisen monilääkeresistenttisyyttä geeni, ABCB1
, anti-EGFR hoitoon, mutta ei kemoterapia voi olla hyötyä potilaille, joilla on suoliston fenotyyppiin GC.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

CDX2 cDNA insertoitiin monikloonauskohtaan retroviruksen ekspressiovektorin pPGS-CMV-CITE-neo, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Täysipituisen, villityypin CDX2 cDNA myös subkloonattiin retrovirusvektoriin pBabe-Puro ER edellä kuvatulla tavalla tuottaa pCDX2-ER [24]. PCDX2-ER vektori koodaa kimeeristä proteiinia, jossa täyspitkän CDX2 sekvenssit fuusioidaan ylävirtaan mutatoidun ER ligandia sitovan domeenin. Mutatoidun ER ligandisitoutumisdomeenista enää sitoo estrogeeni, mutta säilyttää kyvyn sitoa tamoksifeenin. Genomi-DNA-sekvenssit 5'-reunustava alue ihmisen REG4
geeni monistettiin PCR: llä käyttäen genomista DNA: ta puhdistettiin HSC-39-soluja templaattina ja subkloonattiin pGL4.10 [luc2] -vektoriin (Promega , Madison, WI). PCR-lähestymistavat käytettiin mutaatioiden oletetun CDX2-sitoutumiskohdat pGL4.10-REG4 reportterigeenirakenteen käyttäen QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Neljä otaksuttu CDX2-sitoutumiskohtia muutettiin. Kaikki fragmentit PCR varmistettiin automatisoidulla sekvensoinnilla. Plasmidi pGL4.74 [hRluc /TK] -vektoriin (Promega) käytettiin verrokkina transfek- tehokkuutta reportteri määrityksissä.

Cell Lines, Retrovirus-infektiot, ja niiden hoito

amfotrooppinen Phoenix pakkaus solulinja saatiin G. Nolan (Stanfordin yliopisto, Stanford, CA) [37]. Yhdeksän solulinjat ovat peräisin ihmisen GC ja 2 johdetut solulinjat ihmisen paksusuolen syövän käytettiin. TMK-1 solulinja perustettiin laboratoriossamme [38]. HSC-39 ja HSC-44PE solulinjat perustettiin yksi kirjoittajista (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Viisi GC solulinjat MKN sarjojen toimitti ystävällisesti Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. Kato III solulinja toimitti ystävällisesti Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. HT-29 ja SW480 paksusuolen syövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection. Soluja varastoitiin nestemäisessä typessä aloittamiseen asti tässä tutkimuksessa. Kun oli sulatettu pakastetusta varastosta, soluja pidettiin varhainen koko tutkimuksen ajan. Yhdenmukainen solujen morfologiaa tarkkailtiin vertaamalla mikroskooppikuvia. Phoenix pakkaus solut transfektoitiin retroviruksen ekspressiokonstruktien (pPGS-CDX2, pPGS-neo, ja pCDX2-ER), ja supernatantti, joka sisälsi replikoituvissa amfotrooppinen virus kerättiin talteen kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. HT-29-soluja, jotka ilmentävät CDX2-ER-fuusioproteiinin (HT-29 /CDX2-ER), CDX2 toiminto aktivoitiin lisäämällä 4-hydroksitamoksifeeni (4-OHT: ta) (Sigma Chemical, St. Louis, MO), kasvua elatusaineeseen pitoisuus on 500 nmol. Sen tutkimiseksi, onko DNA: n metylaatio indusoiman transkription inaktivointi Reg IV, soluja käsiteltiin lopullinen konsentraatio 1 uM Aza-dC (Sigma Chemical) ja 5 päivää ennen kuin ne kerättiin RNA.

Western Blot-analyysi

Western blot -analyysiä varten, solut hajotettiin, kuten aiemmin on kuvattu [44]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä (BioRad, Richmond, CA), jossa BSA: ta käytettiin standardina. Lysaatit (20 ug) liuotettiin Laemmlin näytepuskuria keittämällä ja sitten suoritettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja sen jälkeen sähkö- siirto nitroselluloosasuodattimelle. Suodatin inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, jossa on anti-Reg IV-vasta-ainetta (kanin polyklonaalinen vasta-aine on kehitetty laboratoriossamme, Ref. 10) tai anti-CDX2-vasta-aine (BioGenex, San Ramon, CA). Peroksidaasiin konjugoitua anti-kani tai anti-hiiri-lgG: tä käytettiin toisen reaktion. Immunokompleksit visualisoitiin ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-aktiini (Sigma Chemical) havaittiin myös latauskontrollina.

qRT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), ja 1 ug kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi, jossa First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantitointi REG4
mRNA-tasot suoritettiin reaaliaikainen fluoresenssi-ilmaisulla, kuten aiemmin on kuvattu [45]. PCR suoritettiin SYBR Green PCR Core Reagents Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaaliaikainen havaitseminen päästöintensiteetti SYBR green sitoutuneen kaksisäikeisen DNA suoritettiin ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) kuten aiemmin on kuvattu [46]. ACTB
erityisiä PCR-tuotteet monistettiin samassa RNA-näytteet ja toimi sisäisenä kontrollina. Sekvenssit alukkeiden REG4
qRT-PCR on esitetty taulukossa 1. qRT-PCR: t suoritettiin kolminkertaisesti kullekin näytteelle alukesarjan, ja keskiarvo ja keskihajonta (SD) on kolmen kokeen laskettiin suhteellinen kvantifiointi arvo. Lopussa 40 PCR-sykliä, reaktiotuotteet erotettiin elektroforeettisesti 8% ei-denaturoivissa polyakryyliamidigeeleissä visuaalisen vahvistuksen PCR-tuotteita.

RNAi

pudotus endogeenisen CDX2, RNAi suoritettiin . Kaksi siRNA-dupleksit kohdistaminen CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1, ja 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) ja nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') syntetisoitiin (Qiagen). Transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, 60 pmol siRNA ja 10 ui Lipofectamine RNAiMAX sekoitettiin 1 ml: aan RPMI-väliainetta (10 nmol /l lopullinen siRNA pitoisuus). Kun 20 min inkuboinnin jälkeen seos lisättiin soluihin ja näitä maljattiin ruokia kutakin määritystä varten. Kolme päivää transfektion jälkeen solut analysoitiin kaikissa kokeissa.

Reporter Gene määritykset

HSC-39 ja MKN-1-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Solujen transfektio 50% -80%: n konfluenssiin suoritettiin 3 ui FuGENE6 Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 ug pGL4.10 reportterigeenirakenteilla, ja 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vektori (Promega). 48 tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen passiivista hajotuspuskuria (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin kaksi lusiferaasin määritysjärjestelmä (GloMax 96 Microplate Luminometer, Promega).

ChIP määritykset

ChIP-kokeet suoritettiin käyttäen EZ-ChIP Kromatiini immunosaostus Kit (Millipore, Billerica , MA) kohden valmistajan ohjeita. Analysoida, CDX2 sitoutuu suoraan otaksutun CDX2 sitovat kohdat REG4
5'-reunustavan alueen, suoritimme ChlP määrityksiä käyttäen HSC-39 soluihin. Lyhyesti, HSC-39-soluja (1-2 x 10 ^{7) oli silloitettu 1%: lla formaldehydiä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja lisättiin glysiiniä sammuttamiseksi reaktiivisia aldehydejä. Pesun jälkeen solut kylmällä PBS: llä, solut suspensoitiin uudelleen SDS-lyysipuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, ja 50 mM Tris, pH 8,1), jossa proteinaasi-inhibiittori (Roche Diagnostics). Sen jälkeen näytteet sonikoitiin, kromatiinin uutteet sisältävät DNA-fragmentteja (keskimääräinen koko 500 emäsparia) immunosaostettiin käyttämällä 2 ug monoklonaalisia anti-CDX2-vasta-aine (BioGenex) tai 2 ug hiiren IgG: tä (Millipore). Kukin immunosaostettiin DNA-näyte kvantitatiivisesti qPCR käyttäen alukkeita luetellaan taulukossa 1. Kuten on negatiivinen kontrolli, joka on noin 200 emäsparia DNA-fragmentti, eksoni 3 CDX1
-geeni monistettiin PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita (taulukko 1 ).}

määrittämiseksi rikastuminen H3K27me3 on REG4
promoottori GC solulinjoissa, siru määritykset suoritettiin käyttäen MKN-1, MKN-28, ja HSC-39 solulinjoissa. Lyhyesti, GC-soluja (1-2 x 10 ^{7) oli silloitettu 1% formaldehydiä PBS: ssä 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja lisättiin glysiiniä sammuttamiseksi reaktiivisia aldehydejä. Pesun jälkeen solut kylmällä PBS: llä, solut suspensoitiin uudelleen SDS-hajotuspuskuriin Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Sen jälkeen näytteet sonikoitiin, kromatiinin uutteet sisältävät DNA-fragmentteja (keskimääräinen koko 500 emäsparia) immunosaostettiin käyttämällä 2 ug polyklonaalista anti-H3K27me3-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA) tai 2 ug kani-IgG (Millipore). Jokainen immu- DNA-näyte kvantitatiivisesti qPCR käyttämällä REG4
Primer 1 (taulukko 1).}

qPCRs tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle alukesarjan, ja keskiarvo ja keskihajonta (SD) ja kolmen kokeita laskettiin suhteellinen määrän arvon. Lopussa 40 PCR sykliä, reaktiotuotteet erotettiin elektroforeettisesti 8% ei-denaturoivissa polyakryyliamidigeeleillä visuaalisen vahvistuksen PCR-tuotteita.

Kiitokset

kiittää Shinichi Norimura erinomaista teknistä tukea ja neuvoja. Tämä työ tehtiin sellaista yhteistyötä tutkimuskeskuksen molekyylilääketieteen, Lääketieteellinen tiedekunta, Hiroshima University. Kiitämme analyysi Center of Life Science, Hiroshiman yliopiston käyttöön niiden tilat.

• PLoS ONE: RhoC Säätelee leviämisen mahasyövän Solut vuorovaikutuksessa IQGAP1
• PLoS ONE: Differential Expression of fosfolipaasi C Epsilon 1 liittyy krooninen atrofisen gastriitin ja mahasyövän