PLoS ONE: Reg IV is een directe doel van Intestinal transcriptiefactor CDX2 bij maagkanker

Samenvatting

REG4
die Reg IV codeert, is een lid van de calcium-afhankelijke lectine superfamilie potente activator van de epidermale groeifactor receptor /Akt /activator proteïne-1 signaleringsroute. Verschillende menselijke kankers overexpressie Reg IV en IV Reg expressie is geassocieerd met intestinale fenotype differentiatie. Echter, regulering van de REG4
transcriptie blijft onduidelijk. In de huidige studie hebben we onderzocht of CDX2 reguleert Reg IV expressie bij maagkanker (GC) cellen. Expressie van Reg IV en CDX2 werd geanalyseerd door Western blot en kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie 9 GC cellijnen en 2 colonkanker cellijnen. De functie van het 5'-flankerende gebied van het REG4
gen werd gekarakteriseerd door luciferase-assay. In 9 GC cellijnen, werden endogene Reg IV en CDX2 expressie correleerde goed. Middels een oestrogeen receptor-gereguleerde vorm van CDX2, snelle inductie van Vo IV-expressie werd waargenomen in HT-29 cellen. Reportergenassays onthulde een belangrijke rol in transcriptie van consensus CDX2 DNA bindende elementen in het 5'-flankerende gebied van het REG4
gen. Chromatine immunoprecipitatie assays toonde aan dat CDX2 bindt rechtstreeks aan de 5'-flankerende gebied van REG4
. Deze resultaten geven aan dat CDX2 eiwit reguleert direct Reg IV expressie

Citation:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, N Sakamoto, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV is een direct doelwit van Intestinal transcriptiefactor CDX2 bij maagkanker. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Uitgever: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 24 mei 2012; Aanvaard: 12 september 2012; Gepubliceerd: 2 november 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Steun voor onderzoek van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Wetenschap, Sport en Technologie van Japan, en, voor een deel, door een Grant-in-Steun voor de Derde Comprehensive 10-Year-strategie voor Kankerbestrijding en for Cancer Research van het ministerie van Gezondheid, Arbeid en Welzijn van Japan, en voor het Nationaal Instituut voor Biomedische Innovatie (Programma voor de bevordering van de fundamentele Studies in Health Sciences). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende menselijke kankers ter wereld. Kanker ontwikkelt zich als gevolg van verschillende genetische en epigenetische veranderingen [1]. We eerder uitgevoerde seriële analyse van genexpressie (SAGE) van vier primaire GC en geïdentificeerd verschillende GC-specifieke genen [2]. Van deze genen, regenereren-eilandje afgeleide familielid 4
( REG4
, die Reg IV eiwit codeert) is een kandidaat-gen voor kanker-specifieke expressie [3]. REG4
is een lid van de REG
gen-familie, die behoort tot de calcium-afhankelijke lectine superfamilie. REG4
werd oorspronkelijk geïdentificeerd door high-throughput-sequentie-analyse van een groot inflammatoire darmziekte cDNA-bibliotheek [4]. Reg IV is een potente activator van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) /Akt /activator proteïne-1 (AP-1) signaalweg in darmkankercellen en verhoogt de expressie van Bcl-2, Bcl-xl en survivine die eiwitten verband met de inhibitie van apoptose [5]. Amplificatie van de REG4
gen werd gemeld bij pancreaskanker [6]. Reg IV is geïdentificeerd als een van de genen opgereguleerd in kanker initiërende cellen [7]. We hebben eerder onderzocht het effect van gedwongen expressie van Reg IV in GC cellijn. We toonden aan dat Reg IV remt 5-fluorouracil (5-FU) geïnduceerde apoptose door middel EGFR activatie in GC-cellen [8]. Daarentegen vertoonde Reg IV-overexpressie cellen geen significante verschillen in proliferatie en invasie activiteit vertonen vergeleken met cellen getransfecteerd met lege vector [8]. Deze bevindingen ondersteunen de gedachte dat Reg IV proteïne deelneemt aan maagkanker

GC kan worden onderverdeeld in vier fenotypes volgens mucine expressie. Maag- of foveolar fenotype; intestinale fenotype; darmen en maag gemengd fenotype; en noch maag of darm fenotype [9]. Verschillende genetische veranderingen lijken geassocieerd met maag- en intestinale GC fenotype [10]. In onze eerdere opmerkingen, werd Reg IV uitgedrukt in 30% van de GC gevallen en was gecorreleerd met intestinale fenotype [11]. Een aantal immunohistochemische analysen van Vo IV gemeld in menselijke kankers [11] - [20]. In het algemeen zijn deze analyses gemeld dat Reg IV uitgedrukt in adenocarcinoom cellen die een intestinale fenotype. Vermeld is dat Reg IV expressie wordt geïnduceerd door GLI1, hetgeen een belangrijke transcriptiefactor in de Hedgehog signaling pathway [21] of door groeifactoren zoals EGF, transformerende groeifactor-α (TGF-α), hepatocyt groeifactor (HGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) [22]. Echter, deze moleculen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor de associatie tussen Reg IV meningsuiting en intestinale fenotype differentiatie.

We hebben eerder geconstateerd dat de expressie van Reg IV werd gecorreleerd met CDX2 meningsuiting [11]. CDX2 een zoogdier-caudale gerelateerde transcriptiefactor darm en belangrijk voor het behoud van intestinale epitheelcellen [23], [24]. Verschillende lijnen van bewijs suggereren dat intestinale metaplasie van de maag en darm fenotype GC worden geassocieerd met ectopische CDX2 expressie [9], [25]. In de huidige studie hebben we onderzocht of CDX2 reguleert Reg IV meningsuiting in GC en vond dat CDX2 direct bindt aan het 5'-flankerende gebied van REG4
gen en verbetert de promotor activiteit.

Resultaten

Reg IV en CDX2 expressie gecorreleerd zijn in GC Cells

We hebben eerst onderzocht inductie van Reg IV expressie door CDX2 in GC cellijnen. Western blot analyse van CDX2 in 9 GC cellijnen bleek dat geen of lage expressie van CDX2 werd gedetecteerd in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO-III (fig. 1A). Om te bepalen of en CDX2 Reg IV expressie sterk gecorreleerd met GC cellen, Western blot en kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) analyse van Vo IV werden uitgevoerd op 9 GC cellijnen. Zoals getoond in Fig. 1A, werd Reg IV eiwitexpressie alleen gedetecteerd in de 3 cellijnen met hoge niveaus van REG4
transcripten gemeten met qRT-PCR. Van de 5 GC-cellijnen met CDX2 eiwitexpressie, 2 cellijnen (MKN-1 en MKN-28) ontbrak detecteerbare expressie van REG4
transcripten en eiwitten. De cellijnen met niet op te sporen CDX2 eiwitexpressie (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO-III) kwam niet opdagen REG4
transcripten of eiwit (Fig. 1A).

Vervolgens genereerden wij een polyklonale populatie van MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO III cellen die hoge niveaus van CDX2 door infectie van de cellen met replicatie-defecte retrovirussen met een volle-lengte humane CDX2 cDNA omdat geen of low-level expressie van CDX2 werd gedetecteerd in deze cellijnen. Echter, overexpressie van CDX2 niet Reg IV expressie door Western blot activeren (gegevens niet getoond). Omdat het mogelijk is dat CDX2 alleen niet voldoende voor het activeren Reg IV expressie, expressie van CDH17
(coderend LI-cadherin eiwit), dat is een van de doelstellingen van CDX2 [24], werd eveneens onderzocht. Echter, activering van LI-cadherine werd niet gevonden in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO III cellen die hoge niveaus van CDX2 (gegevens niet getoond). Omdat we activatie van LI-cadherine getoond door CDX2 in het HT-29 coloncarcinoom cellijn [24], inductie van Vo IV-expressie werd onderzocht in dezelfde cellijn. Zoals getoond in Fig. 1B, inductie van Vo IV-expressie werd gedetecteerd in HT-29 cellen geïnfecteerd met retrovirussen die een full-length cDNA humaan CDX2. We genereerden ook een polyklonale populatie SW480 (colonkanker cellijn) cellen die hoge niveaus van CDX2 door infectie van de cellen met replicatie-defecte retrovirussen die een full-length cDNA humaan CDX2. Zoals getoond in Fig. 1B, inductie van Vo IV-expressie werd gevonden in SW480-cellen geïnfecteerd met retrovirussen die een full-length cDNA humaan CDX2. Deze resultaten suggereren dat Reg IV expressie kan worden geïnduceerd door CDX2 in cellijnen afkomstig van darmkanker. Omdat in intestinale metaplasie van de maag, en CDX2 Reg IV expressie zijn goed gecorreleerd [11], het gebruik van een colonkankercellijn misschien geschikt voor het model van intestinale metaplasie zijn.

Om beter de relatie tussen beoordelen CDX2 en Reg IV meningsuiting, bestudeerden we Reg IV expressie in een HT-29-afgeleide lijn met strak gereguleerd CDX2 activiteit. We gebruikten een polyklonaal HT-29 cellijn die getransduceerd was met de pCDX2-ER vector. De pCDX2 ER-vector codeert voor een chimeer eiwit waarin full-length CDX2 sequenties stroomopwaarts van een gemuteerd oestrogeen receptor (ER) ligand bindingsdomein gefuseerd. Het gemuteerde ER ligandbindende domein bindt niet meer oestrogeen, maar het vermogen behoudt om te binden tamoxifen. Behandeling van HT-29 /CDX2 ER-cellijn met 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) leidde tot sterke inductie van Vo IV eiwitexpressie binnen 48 uur (Fig. 1C). Deze resultaten geven aan dat Reg IV is een direkte of primaire doelgen gereguleerd door CDX2. Echter, CDX2 alleen niet voldoende is voor het activeren van Reg IV expressie.

Remming van CDX2 door RNA interferentie (RNAi) Resultaten in de stads regulering van Reg IV in GC Cells

Om te bepalen of CDX2 noodzakelijk Reg IV expressie in GC cellen, analyseerden we het effect van het remmen CDX2 expressie van RNAi in het niveau van Vo IV expressie in HSC-39 cellijn omdat hoge endogene CDX2 en Reg IV expressie in HSC-39 cellijn werd gedetecteerd. CDX2-specifieke kleine interfererende RNA's (siRNA's) significant onderdrukt CDX2 eiwitexpressie 3 dagen na transfectie en expressie van Vo IV transcript neerwaarts gereguleerd ongeveer 50% van CDX2 siRNA in HSC-39 vergeleken met niveaus in controle-siRNA behandelde cellen ( fig. 1D). Deze resultaten geven aan dat CDX2 is betrokken bij het handhaven Reg IV genexpressie.

Functionele karakterisatie de 5'-flankerende regio REG4
Gene door Luciferase Assay

Om potentiële CDX2 identificeren -bindings sites in de REG4
promotorgebied, het doorzoeken van het genomische sequenties onmiddellijk 5 'aan de vermoedelijke startplaats van transcriptie werd uitgevoerd onder toepassing van een consensus inbindelement de CdxA kip caudaal
homoloog (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] en een eerder beschreven zoekalgoritme [27]. We vonden vier vermoedelijke CDX2 bindingsplaatsen in de 2 kilobasen (kb) 5'-flankerende gebied van de REG4
gen (Fig. 2A). Deze waren: site A (5'-AATAATA-3 ', -1.828--1.834), plaats B (5'- CTTTACAG-3', van -901 tot -908), ter C (5'-3-TTTTATGG ', van -114 tot -121), ter D (5'AATAATA -3', van -90 tot -96). Om de rol van deze vermoedelijke CDX2-bindingsplaatsen bij de regulering beoordelen REG4
transcriptie verschillende reportergen constructen werden gegenereerd. Zoals getoond in Fig. 2B, reporter gen constructen die 2,1, 1,2 of 0,6 kb van 5'-flankerende sequentie van de REG4
gen vertoonden een sterke activiteit in de HSC-39 cellen, die een sterke endogene expressie van tonen REG4
transcripten en eiwitten. Ter vergelijking, MKN-1-cellen weinig endogene REG4
transcript en weergegeven of nauwelijks transcriptionele activiteit geïnduceerd door 2,1, 1,2 of 0,6 kb REG4
reportergenconstructen (data niet getoond) . REG4
reportergen constructen die baseparen -116 tot +58 en -87 tot 58 hadden verminderde activiteit in de HSC-39-cellen (Figuur 2B.), Wat aangeeft dat sequenties tussen bp -634 en - 116 spelen een belangrijke rol bij het activeren REG4
transcriptie. Verder hebben we geanalyseerd enkelvoudige en meervoudige mutaties in de vermoedelijke-CDX2 bindingsplaatsen in het 5'-flankerende gebied van de REG4
gen met behulp van HSC-39 cellen (Fig. 2C). Zoals verwacht, vermoedelijke bindingsplaats CDX2-C, die zich tussen baseparen -634 en -116, speelt een cruciale rol bij het activeren REG4
transcriptie.

CDX2 direct bindt aan de 5 ' flankerende regio REG4
Gene

om te analyseren of CDX2 rechtstreeks bindt aan de vermeende-CDX2 bindingsplaatsen in de REG4
5'-flankerende gebied, voerden wij chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays gebruikt HSC-39 cellen. Met behulp van 6 primers voor de REG4
5'-flankerende gebied (Fig. 3A), we teruggewonnen DNA-fragmenten die de REG4
5'-flankerende gebied van primer 1, waarin vermoedelijke CDX2- omvat bindingsplaats C (fig. 3B). DNA-fragmenten van het 5'-flankerende gebied van REG4
, die werden gegenereerd onder gebruikmaking van primers 2, 3, 4, 5 en 6 zodat ze niet CDX2 vermoedelijke bindingsplaatsen bevatte, werd niet teruggewonnen door het anti- CDX2 antilichaam. De specificiteit van herstel van de REG4
promotorregio volgende chip met anti-CDX2 antilichaam werd aangetoond door het feit dat andere irrelevant DNA-fragmenten ontbreekt-CDX2 bindingsplaatsen (bv exon 3 van het CDX1
gen) werden niet teruggevonden (Fig. 3B). Daarnaast mock immunoprecipitatie (muis IgG) leverde enkele REG4 golfreizen of CDX1
-specifieke DNA-fragmenten (Figuur 3B.). Al deze bevindingen suggereren dat CDX2 activeert REG4
transcriptie door direct binden aan sequenties in de 5'-flankerende gebied van het gen.

trimethylering van histon H3 lysine 27 (H3K27me3) op REG4
Promotor in het GC cellijnen

Hoewel CDX2 eiwit expressie werd gevonden in MKN-1 en MKN-28 cellijnen, deze 2 cellijnen ontbrak detecteerbare expressie van REG4
transcript en eiwitten. Omdat is gerapporteerd dat DNA hypermethylatie van CpG eilanden is geassocieerd met silencing van verschillende genen [28] wordt onderzocht of DNA methylatie geïnduceerde transcriptionele inactivatie van Vo IV MKN-1 en MKN-28 cellen. We behandelden deze cellen met een demethyleringsmiddel, 5-aza-2'-desoxycytidine (Aza-dC) en vervolgens uitgevoerd qRT-PCR. Echter, Reg IV expressie niet hersteld in deze cellijnen (data niet getoond), wat suggereert dat DNA methylatie is niet waarschijnlijk Reg IV expressie beïnvloeden. Men heeft ook gemeld dat H3K27me3 is geassocieerd met onderdrukte de genexpressie [29]. We verder onderzocht H3K27me3 GC cellijnen. Om de verrijking van H3K27me3 op de REG4
promotor in de GC-cellijnen, ChIP testen werden uitgevoerd te bepalen. In MKN-1 en MKN-28 cellijnen, H3K27me3 niveaus op de REG4
promotorregio waren hoog, terwijl in HSC-39 cellijn, H3K27me3 niveau over de REG4
promotorregio was laag (Fig. 3C). Deze resultaten suggereren dat gesloten chromatine structuur van REG4
promotor kan Reg IV expressie remmen door CDX2.

Discussie

Hoewel het is gemeld dat Reg IV expressie wordt geïnduceerd door GLI1 [21] en EGF [22], deze moleculen waarschijnlijk overeenkomt met het verband tussen Reg IV en intestinale differentiatie. In de huidige studie hebben we aangetoond dat endogene CDX2 en Reg IV expressie waren goed gecorreleerd in GC cellijnen. Bovendien, met een ER-gereguleerde vorm van CDX2, vonden we dat er een snelle inductie van Vo IV expressie na 4-OHT behandeling. Reportergenassays onthulde een belangrijke rol CDX2 consensus DNA bindende elementen in de REG4
promotorgebied in zijn transcriptie. Latere ChIP assays toonde aan dat CDX2 bindt rechtstreeks aan de REG4
promotor. We hebben eerder toonden aan dat in het primair GC weefsel en intestinale metaplasie van de maag, CDX2 en Reg IV expressie waren goed gecorreleerd [11]. Deze resultaten geven aan dat CDX2 eiwit reguleert direct Reg IV expressie in GC en intestinale metaplasie van de maag.

CDX2 is overexpressie in intestinale GC fenotype en intestinale metaplasie van de maag [9], [25]. Daarentegen verloren CDX2 expressie werd waargenomen in een subset van primaire colorectale kanker, meestal in slecht gedifferentieerde colorectale kanker [30]. De betekenis van verandering van CDX2 in humane kankers onduidelijk, en daarom is het belangrijk om de doelgenen die stroomafwaarts van CDX2 zijn gedefinieerd. We hebben verscheidene CDX2 gereguleerde genen zoals CDH17
(die LI-cadherine codeert) [24], HEPH
(dat codeert hephaestin) [31] vastgesteld, ABCB1
[32] (waarvan multidrug resistentie 1 codeert) en DSC2
(dat codeert desmocollin 2) [33]. Van deze genen, ABCB1
werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een overexpressie en geamplificeerd gen in multiple drug-resistente cellen, en zijn product, P-glycoproteïne, lijkt een belangrijke rol in resistentie [34] spelen. Eerder hebben we gemeld dat geforceerde expressie van Vo IV GC cellen remde 5-FU-geïnduceerde apoptose door middel van inductie van Bcl-2 en dihydropyrimidine dehydrogenase [8]. Samengevat, is het mogelijk dat intestinale GC fenotype, de expressie (of ectopische expressie) van CDX2 induceert Reg IV en multidrug resistentie 1 expressie, wat resulteert in een toename van resistentie. In feite is gerapporteerd dat postoperatieve chemotherapie niet nuttig zijn voor patiënten met intestinale GC fenotype [35].

Hoewel onze gegevens ondersteunen de opvatting dat CDX2 een rol speelt bij het reguleren REG4
transcriptie via binding aan het promotergebied, verschillende bevindingen wijzen erop dat CDX2 alleen niet voldoende voor het activeren REG4
expressie. In deze studie, genereerden we een polyklonale populatie van MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO III cellen die een hoog CDX2 door infectie met retrovirussen die een volledige lengte humaan cDNA tot expressie CDX2. Echter, overexpressie van CDX2 niet Reg IV expressie te activeren. In GC cellijnen, geen van de cellijnen detecteerbare CDX2 eiwitexpressie detecteerbare REG4
transcripten en eiwitten. Daarom CDX2 vereist Reg IV expressie, maar CDX2 alleen niet voldoende voor het activeren Reg IV expressie. In deze studie werden negen GC cellijnen onderzocht. De oorsprong van de cellijnen als volgt. De MKN-7, MKN-28, en MKN-74 cellijnen werden gevestigd uit intestinaal Type GC. De TMK-1 en MKN-45 cellijnen werden vastgesteld op basis van diffuse het type GC. De KATO-III, HSC-39, en HSC-44PE cellijnen werden vastgesteld op basis van zegelring cell carcinoma. De MKN-1 cellijn werd vastgesteld op basis van adenosquamous cell carcinoma. Omdat in intestinale metaplasie van de maag, en CDX2 Reg IV expressie zijn goed gecorreleerd kunnen GC vastgesteld door diffuse Type GC of zegelring cell carcinoma cellijnen niet geschikt voor de analyse van Vo IV inductie door CDX2 zijn. In feite kan Reg IV expressie worden geïnduceerd door CDX2 in cellijnen afkomstig van colonkanker in deze studie. Verder toonden we aan dat H3K27me3 niveaus op de REG4
promoter regio waren hoog in MKN-1 en MKN-28 GC cellijnen. Deze 2 cellijnen ontbrak detecteerbare expressie van REG4
hoewel CDX2 eiwitexpressie werd gevonden. Daarom H3K27me3 niveaus op de REG4
promotorregio kan hoog zijn in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE en KATO-III cellen, waarin overexpressie van CDX2 niet Reg IV expressie te activeren.

vermeld is dat em <> REG4
mRNA expressie was door stimulatie met TGF-α, EGF, HGF, of bFGF door stimulatie van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) route [22] . Derhalve kan worden verondersteld dat Reg IV ook geregeld door stroomafwaartse transcriptionele factoren van MAPK routes. We voerden in silico
analyses van de REG4
gen 5'-flankerende gebied, en vond ten minste één vermoedelijke AP-1 consensus sequenties (bij -883 basenparen van REG4
gen 5'-flankerende gebied), hetgeen een stroomafwaartse transcriptionele factor MAPK signalering. In deze studie HSC-39 cellen vertoonden vergelijkbare transcriptionele activiteit van reportergen constructen bevattende 1,2 kb en 0,6 kb van REG4
5'-flankerende sequentie. Als het effect van de EGF of TGF-α op REG4
transcriptie is niet onderzocht in deze studie verder onderzoek is nodig om de signalering mechanismen die de regulering van de REG4
transcriptie te induceren te verduidelijken.

Tot slot, onze huidige gegevens blijkt dat CDX2 eiwit direct reguleert Reg IV expressie. Reg IV activeert de EGFR /Akt /AP-1 signaleringsroute. Intestinale GC fenotype vaak EGFR tot expressie brengt [36], wordt voorgesteld dat Reg IV-geactiveerde pathway een belangrijke rol speelt subtype van GC. Omdat CDX2 ook induceert expressie van het multidrug resistance gen, ABCB1
, anti-EGFR therapie, maar niet chemotherapie kan gunstig zijn voor patiënten met intestinale fenotype GC zijn.

Materialen en methoden

Plasmiden

de CDX2 cDNA werd geïnserteerd in de meervoudige kloneringsplaats van de retrovirale expressievector PPG-CMV-neo-CITE zoals eerder [24] beschreven. De volledige lengte, wildtype CDX2 cDNA werd gesubkloneerd in de retrovirale vector pBabe-Puro ER zoals eerder beschreven pCDX2-ER [24] te genereren. De pCDX2 ER-vector codeert voor een chimeer eiwit waarin full-length CDX2 sequenties stroomopwaarts van een gemuteerd ER-ligand bindende domein gefuseerd. Het gemuteerde ER ligandbindende domein bindt niet meer oestrogeen, maar het vermogen behoudt om te binden tamoxifen. Genomisch DNA sequenties van de 5'-flankerende gebied van het humane REG4
-gen werden geamplificeerd door PCR met genomisch DNA gezuiverd uit HSC-39 cellen als een matrijs en gesubkloneerd in de pGL4.10 [luc2] vector (Promega , Madison, WI). PCR-gebaseerde benaderingen werden gebruikt om mutaties te introduceren in de vermoedelijke CDX2-bindingsplaatsen in de pGL4.10-REG4 reportergenconstruct behulp QuikChange plaatsgerichte mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA). Vier vermoedelijke CDX2 bindende plaatsen werden veranderd. Alle fragmenten door PCR werden geverifieerd door geautomatiseerde sequentiebepaling. Het plasmide pGL4.74 [hRluc /TK] vector (Promega) werd gebruikt als controle voor transfectie-efficiëntie in reporter assays.

Cellijnen, retrovirusinfecties en Drug Treatment

De amfotrope Phoenix verpakking cellijn werd verzorgd door G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Negen cellijnen afgeleid uit humane GC en 2 cellijnen afgeleid uit humane colonkanker gebruikt. De TMK-1 cellijn werd opgericht in ons laboratorium [38]. De HSC-39 en HSC-44PE cellijnen werden vastgesteld door een van de auteurs (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Vijf GC cellijnen van de MKN reeksen werden vriendelijk verschaft door Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. De KATO-III-cellijn werd vriendelijk verschaft door Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. De HT-29 en SW480 colonkanker cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection. De cellen werden opgeslagen in vloeibare stikstof tot het begin van dit onderzoek. Na het ontdooien van bevroren voorraad werden de cellen bij lage passage gehele studie behouden. Consistent celmorfologie werd gevolgd door vergelijking van microscopische beelden. De Phoenix verpakking cellen werden getransfecteerd met retrovirale expressieconstructen (PPG-CDX2, PPG-neo en pCDX2-ER) en het supernatant bevattende replicerende amfotrope virus werd geoogst zoals eerder beschreven [24]. In HT-29 cellen die de CDX2 ER-fusieproteïne (HT-29 /CDX2-ER), werd CDX2 geactiveerd door toevoeging van 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) om de groei medium bij een uiteindelijke concentratie van 500 nmol. Om te onderzoeken of DNA methylatie geïnduceerde transcriptionele inactivatie van Vo IV werden de cellen behandeld met een eindconcentratie van 1 uM Aza-dC (Sigma Chemical) gedurende 5 dagen voordat zij werden geoogst RNA-extractie.

Western Blot analyse

Voor Western blot analyse werden de cellen gelyseerd zoals eerder [44] beschreven. Eiwitconcentraties werden bepaald door Bradford eiwit assay (BioRad, Richmond, CA) met BSA als standaard. De lysaten (20 ug) werden Laemmli monsterbuffer opgelost door koken en vervolgens onderworpen aan 12% SDS-polyacrylamidegel elektroforese gevolgd door elektro-overdracht op een nitrocellulosefilter. Het filter werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een anti-Reg IV antilichaam (polyklonaal konijn-antilichaam ontwikkeld in ons laboratorium, Ref. 10) of anti-CDX2 antilichaam (BioGenex, San Ramon, CA). Peroxidase-geconjugeerd anti-konijn of anti-muis IgG werd gebruikt in de secundaire reactie. Immuuncomplexen werden gevisualiseerd met ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actine (Sigma Chemical) werd ook gedetecteerd als beladingscontrole.

qRT-PCR analyse

Totaal RNA werd geëxtraheerd met een RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) en 1 ug totaal RNA werd omgezet in cDNA met een First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kwantificering van REG4
mRNA werd uitgevoerd door real-time fluorescentie detectie, zoals eerder [45] beschreven. PCR werd uitgevoerd met SYBR Green PCR Reagentia Core Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Real-time detectie van de emissie-intensiteit van SYBR green gebonden aan dubbelstrengs DNA werd uitgevoerd met een ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) zoals eerder beschreven [46]. ACTB
-specifieke PCR-producten werden geamplificeerd uit dezelfde RNA-monsters en diende als een interne controle. Sequenties van primers voor REG4
qRT-PCR worden getoond in Tabel 1. qRT-PCR's werden uitgevoerd in triplo voor elk monster primerset, en het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van de drie experimenten werd berekend als relatieve kwantificatie waarde. Eind 40 PCR cycli werden reactieproducten elektroforetisch op 8% niet-denaturerende polyacrylamidegels gescheiden visuele bevestiging van PCR producten.

RNAi

​​De endogene CDX2 knockdown, RNAi werd uitgevoerd . Twee siRNA duplexen gericht CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1 en 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) en een nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') werden gesynthetiseerd (Qiagen). Transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens het protocol van de fabrikant. Kort, 60 pmol siRNA en 10 pi Lipofectamine RNAiMAX werden gemengd in 1 ml RPMI-medium (10 nmol /L siRNA uiteindelijke concentratie). Na 20 min incuberen werd het mengsel aan de cellen toegevoegd en deze werden uitgeplaat op schotels voor elke assay. Drie dagen na transfectie werden de cellen geanalyseerd voor alle experimenten.

reportergenassays

HSC-39 en MKN-1 cellen werden uitgezaaid in 6-well platen (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Transfectie van cellen bij 50% -80% confluentie werd met 3 pl van FuGENE6 transfectiereagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 ug pGL4.10 reportergenconstructen en 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vector (Promega). Op 48 uur na transfectie werden de cellen verzameld en opnieuw gesuspendeerd in passieve lysisbuffer (Promega). Luciferase activiteit werd bepaald met een dubbele luciferase testsysteem (GloMax 96 Microplate Luminometer, Promega).

ChIP assays

De ChIP assays werden uitgevoerd met behulp van de EZ-ChIP Chromatine immunoprecipitatie Kit (Millipore, Billerica , MA) per productie-instructies. Om te analyseren of CDX2 rechtstreeks bindt aan de vermeende-CDX2 bindingsplaatsen in de REG4
5'-flankerende gebied, voerden we ChIP assays met behulp van HSC-39 cellen. Kortom, HSC-39 cellen (1-2 x 10 ^{7) zijn verknoopt met 1% formaldehyde in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 15 minuten bij 37 ° C en glycine toegevoegd om reactieve aldehyden te doven. Na wassen cellen met koude PBS werden cellen geresuspendeerd in SDS-lysisbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA en 50 mM Tris pH 8,1) met Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Nadat monsters werden gesonificeerd werden chromatine extracten die DNA-fragmenten (gemiddelde grootte, 500 basenparen) immunologisch neergeslagen middels 2 ug monoklonaal anti-CDX2 antilichaam (BioGenex) of 2 ug IgG (Millipore). Elk immunogeprecipiteerd DNA monster werd gekwantificeerd door qPCR gebruikt in tabel 1. Als een negatieve controle primers, een ongeveer 200 baseparen DNA-fragment van exon 3 van het CDX1
gen werd geamplificeerd door PCR met gebruikmaking van specifieke primers (Tabel 1 ).}

Om de verrijking van H3K27me3 op het bepalen van de REG4
promotor in de GC-cellijnen, ChIP assays werden uitgevoerd met behulp van MKN-1, MKN-28, en HSC-39 cellijnen. Kortom, GC cellen (1-2 x 10 ^{7) zijn verknoopt met 1% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij 37 ° C en glycine toegevoegd om reactieve aldehyden te doven. Na wassen cellen met koude PBS werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in SDS-lysisbuffer met Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Nadat monsters werden gesonificeerd werden chromatine extracten die DNA-fragmenten (gemiddelde grootte, 500 basenparen) immunologisch neergeslagen middels 2 ug polyklonale anti-H3K27me3 antilichaam (Abcam, Cambridge, MA) of 2 ug konijn IgG (Millipore). Elk immunogeprecipiteerd DNA-monster werd gekwantificeerd door qPCR met REG4
Primer 1 (tabel 1).}

qPCRs werden in drievoud uitgevoerd voor elk monster primer set, en de gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van de drie experimenten werd berekend als de relatieve kwantificatie waarde. Aan het einde van de 40 PCR-cycli, werden reactieproducten elektroforetisch op 8% niet-denaturerende polyacrylamidegels gescheiden voor visuele bevestiging van PCR-producten.

Dankwoord

Wij danken de heer Shinichi Norimura voor een uitstekende technische bijstand en advies. Dit werk werd uitgevoerd met de medewerking van het Research Center for Molecular Medicine, Faculteit der Geneeskunde, Hiroshima University uitgevoerd. Wij danken de Analysis Center van Life Science, Hiroshima University, voor het gebruik van hun faciliteiten.

• PLoS ONE: RhoC regelt de verspreiding van maagkanker cellen door interactie met IQGAP1
• PLoS ONE: differentiële expressie van fosfolipase C Epsilon 1 wordt geassocieerd met chronische atrofische gastritis en Cancer