PLOS ONE: Reg IV est une cible directe de Intestinal transcriptionnelle Factor CDX2 dans gastrique Cancer

Résumé

REG4
, qui code pour la protéine Reg IV, est un membre de la lectine dépendant du calcium superfamille et puissant activateur du récepteur du facteur de croissance épidermique /Akt /activateur de la protéine-1 voie de signalisation. Plusieurs cancers humains surexpriment Reg IV, et Reg IV expression est associée à la différenciation du phénotype intestinal. Toutefois, la réglementation de REG4
transcription reste incertaine. Dans la présente étude, nous avons examiné si CDX2 régule l'expression Reg IV dans le cancer gastrique (GC) cellules. Reg expression de CDX2 IV et a été analysé par Western blot inverse et amplification en chaîne par polymérase quantitative de transcription dans les lignées cellulaires 9 GC et des lignées cellulaires du cancer du côlon 2. La fonction de la région 5'-flanquante du REG4
gène a été caractérisé par un essai luciférase. Dans 9 lignées de cellules GC, endogène Reg IV et de l'expression de CDX2 étaient bien corrélées. En utilisant une forme œstrogène récepteur réglementé de CDX2, induction rapide de Reg IV expression a été observée dans cellules HT-29. dosages de gènes rapporteurs ont révélé un rôle important dans la transcription du consensus CDX2 ADN éléments dans la région 5'-flanquante du REG4
gène de liaison. Chromatine des analyses d'immunoprécipitation ont montré que CDX2 se lie directement à la région flanquant 5 'de
REG4. Ces résultats indiquent que la protéine CDX2 régule directement Reg IV expression

Citation:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV est une cible directe de Intestinal transcriptionnelle Factor CDX2 dans le cancer gastrique. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Editeur: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 24 mai 2012; Accepté 12 Septembre 2012; Publié 2 Novembre, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Naito et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions-in-Aid pour la recherche du Ministère de l'éducation, de la culture, de la science, du sport, et de la technologie du Japon, et, en partie, par un Grant-in-Aid pour la troisième Stratégie globale de 10 ans pour la lutte contre le cancer et pour la recherche sur le cancer du ministère de la Santé, du Travail et des Affaires sociales du Japon, et pour l'Institut national de l'innovation biomédicale (Programme pour la promotion des études fondamentales en sciences de la santé). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est l'un des cancers humains les plus répandues dans le monde. Le cancer se développe à la suite d'altérations génétiques et épigénétiques multiples [1]. Nous avons déjà effectué une analyse en série de l'expression génique (SAGE) de quatre primaires CG et identifié plusieurs gènes spécifiques GC [2]. Parmi ces gènes, régénérant membre de la famille des îlots dérivés 4
( REG4
, qui code pour la protéine Reg IV) est un gène candidat pour l'expression spécifique du cancer [3]. REG4
est un membre de la la famille de gènes de REG, qui appartient à la lectine superfamille dépendante du calcium. REG4
a été initialement identifiés par analyse de séquence à haut débit d'une grande banque d'ADNc de la maladie inflammatoire de l'intestin [4]. Reg IV est un puissant activateur du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) /Akt /activateur de la protéine-1 (AP-1) voies de signalisation dans les cellules cancéreuses du colon et augmente l'expression de Bcl-2, Bcl-xL et la survivine, qui sont des protéines associée à l'inhibition de l'apoptose [5]. Amplification du gène REG4 de a été rapporté dans le cancer du pancréas [6]. Reg IV a été identifié comme l'un des gènes régulés à la hausse dans les cellules cancéreuses initiatrices [7]. Nous avons déjà examiné l'effet de l'expression forcée de Reg IV dans la lignée cellulaire de GC. Nous avons montré que Reg IV inhibe la 5-fluorouracile (5-FU), l'apoptose induite par l'activation de l'EGFR dans des cellules GC [8]. En revanche, les cellules Reg IV surexprimant ne montrent pas de différences significatives dans la prolifération et l'activité de l'invasion par rapport aux cellules transfectées avec le vecteur vide [8]. Ces résultats soutiennent l'idée que la protéine Reg IV participe à la carcinogenèse gastrique

GC peut être subdivisé en quatre phénotypes selon l'expression de mucine:. Phénotype gastrique ou fovéolaire; phénotype intestinal; phénotype mixte intestinal et gastrique; et ni phénotype gastrique ni intestinal [9]. les modifications génétiques distinctes semblent être associés à un phénotype gastrique et intestinale GC [10]. Dans nos observations antérieures, Reg IV a été exprimé dans 30% des cas de GC et était en corrélation avec le phénotype intestinal [11]. Un certain nombre d'analyses immunohistochimiques de Reg IV ont été signalés dans les cancers humains [11] - [20]. En général, ces analyses ont indiqué que Reg IV est exprimée dans des cellules d'adénocarcinome présentant un phénotype intestinal. Il a été rapporté que Reg IV, l'expression est induite par GLI1, ce qui est un facteur de transcription clé dans la voie de signalisation Hedgehog [21], ou par des facteurs de croissance tels que l'EGF, le facteur de croissance transformant α (TGF-α), le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) ou le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) [22]. Cependant, ces molécules sont peu susceptibles de rendre compte de l'association entre l'expression Reg IV et la différenciation de phénotype intestinal.

Nous avons déjà constaté que l'expression de Reg IV a été corrélée avec l'expression de CDX2 [11]. CDX2 est un facteur de transcription intestinale liée caudale chez les mammifères, et importante pour le maintien des cellules épithéliales intestinales [23], [24]. Plusieurs preuves suggèrent que la métaplasie intestinale de l'estomac et l'intestin phénotype GC sont associés à l'expression ectopique de CDX2 [9], [25]. Dans la présente étude, nous avons examiné si CDX2 réglemente Reg IV expression dans GC et a constaté que CDX2 se lie directement à la région adjacente en 5 'de REG4
gène et améliore l'activité du promoteur.

Résultats

Reg IV et CDX2 expression sont corrélées dans les cellules du GC

Nous avons d'abord enquêté induction de Reg IV expression par CDX2 dans des lignées cellulaires de GC. Analyse par Western blot CDX2 dans 9 lignées de cellules GC a révélé que peu ou pas d'expression de faible niveau de CDX2 a été détectée dans MKN-7, TMK-1, SH-44PE et KATO-III (fig. 1A). Pour déterminer si CDX2 et Reg IV expression étaient étroitement corrélées dans les cellules du GC, Western blot et la réaction en chaîne polymérase-transcription inverse quantitative (qRT-PCR) analyse de Reg IV ont été réalisées sur des lignées cellulaires 9 GC. Comme on le voit sur la Fig. 1A, Reg IV expression de la protéine n'a été détectée dans les 3 lignées cellulaires avec des niveaux élevés de REG4
transcriptions mesurées par qRT-PCR. Des lignées cellulaires 5 GC à l'expression de la protéine CDX2, 2 lignées cellulaires (MKN-1 et MKN-28) manquaient d'expression détectable de REG4
transcrits et des protéines. Les lignées de cellules avec expression de la protéine CDX2 indétectable (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE et KATO-III) ne montrent pas REG4
transcrits ou protéines (Fig. 1A)
Ensuite, nous avons généré une population polyclonale de MKN-7, TMK-1, SH-44PE et les cellules KATO III exprimant des niveaux élevés de CDX2 par une infection des cellules avec des retrovirus à replication défectueuse portant une pleine longueur CDX2 ADNc humain à cause aucune ou une expression de faible niveau de CDX2 a été détectée dans ces lignées cellulaires. Toutefois, la surexpression de CDX2 n'a pas réussi à activer Reg IV expression par transfert de Western (données non présentées). Parce qu'il est possible que CDX2 seule ne suffit pas pour l'activation de l'expression Reg IV, l'expression de CDH17
(codant pour la protéine LI-cadhérine), qui est l'une des cibles de CDX2 [24], a également été étudiée. Cependant, l'activation de l'expression LI-cadhérine n'a pas été trouvé dans MKN-7, TMK-1, SH-44PE et KATO-III des cellules exprimant des niveaux élevés de CDX2 (données non présentées). Parce que nous avons montré une activation de l'expression de cadhérine-LI CDX2 par ligne dans le côlon HT-29 de cellules de cancer [24], l'induction de l'expression Reg IV a été étudiée dans la même lignée cellulaire. Comme on le voit sur la Fig. 1B, l'induction de l'expression Reg IV a été détectée dans HT-29 des cellules infectées par des retrovirus portant une pleine longueur d'ADNc humain CDX2. Nous avons également généré une population polyclonale de SW480 (lignée cellulaire de cancer du côlon), les cellules exprimant des niveaux élevés de CDX2 par une infection des cellules avec des retrovirus défectifs pour la replication portant une pleine longueur d'ADNc humain CDX2. Comme on le voit sur la Fig. 1B, l'induction de Reg IV expression a été trouvée dans les cellules SW480 infectées par des retrovirus portant une pleine longueur CDX2 humaine ADNc. Ces résultats suggèrent que Reg IV expression peut être induite par CDX2 dans des lignées cellulaires dérivées d'un cancer du côlon. Parce que dans la métaplasie intestinale de l'estomac, CDX2 et Reg IV expression sont bien corrélées [11], l'utilisation d'une lignée cellulaire de cancer du côlon pourrait être approprié pour le modèle de la métaplasie intestinale.

Pour mieux évaluer la relation entre CDX2 et Reg IV expression, nous avons étudié Reg IV expression dans une ligne HT-29 dérivé avec une activité CDX2 strictement réglementée. Nous avons utilisé un HT-29 lignée cellulaire polyclonale qui avait été transduites avec le vecteur pCDX2-ER. Le vecteur pCDX2-ER code pour une protéine chimère dans laquelle les séquences de pleine longueur Cdx2 sont fusionnées en amont d'un récepteur d'oestrogène muté (ER), le domaine de liaison de ligand. Le domaine de liaison au ligand muté ER ne se lie plus oestrogènes, mais conserve la capacité de se lier au tamoxifène. Le traitement de la lignée cellulaire /CDX2-ER-29 HT avec le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) a conduit à une forte induction de Reg IV expression de la protéine dans les 48 heures (Fig. 1C). Ces résultats indiquent que Reg IV est un gène cible directe ou primaire régulée par CDX2. Cependant, CDX2 seule ne suffit pas pour activer Reg IV expression.

Inhibition de CDX2 par interférence ARN (ARNi) Résultats dans le Down-régulation de Reg IV dans les cellules du GC

Pour déterminer si CDX2 est nécessaire pour l'expression Reg IV dans les cellules du GC, nous avons analysé l'effet d'inhiber l'expression de CDX2 par ARNi dans le niveau de Reg IV expression dans HSC-39 lignée cellulaire parce haute CDX2 endogène et Reg IV expression a été détectée dans HSC-39 lignée cellulaire. petits ARN spécifiques de Cdx2 interférents (siRNA) significativement supprimé CDX2 protéine expression 3 jours après la transfection et l'expression de la transcription Reg IV a été régulés à la baisse d'environ 50% par CDX2 ARNsi dans HSC-39 par rapport à ses niveaux dans les cellules siARN traités de contrôle ( Fig. 1D). Ces résultats indiquent que CDX2 est impliqué dans le maintien de l'expression du gène Reg IV.

Caractérisation fonctionnelle du flanquant 5 Région de REG4
Gene par Luciferase Assay

Pour identifier CDX2 potentiel liant le sites de la caudale la région du promoteur de REG4, une recherche des séquences génomiques immédiatement en 5 'du site de début de transcription présomptif a été réalisée, en utilisant un élément de liaison pour le poulet CDXA consensus
homologue (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] et un algorithme de recherche décrit précédemment [27]. Nous avons trouvé quatre sites putatifs de Cdx2 liaison dans le 2 kilobases (kb) flanquant 5 région du REG4
gène (Fig. 2A). Ce sont: le site A (5'-AATAATA-3 ', -1828 à -1834), le site B (5'-CTTTACAG-3', -901 à -908), le site C (5'-TTTTATGG-3 ', -114 à -121), le site D (5'AATAATA -3', -90 à -96). Pour évaluer le rôle de ces sites Cdx2 liaison présomptifs dans la régulation de REG4
transcription, différentes constructions de gènes rapporteurs ont été générés. Comme on le voit sur la Fig. 2B, constructions de gènes rapporteurs contenant 2,1, 1,2 ou 0,6 kb de séquence flanquant 5 'de la REG4
gène a montré une forte activité dans les HSC-39 cellules, qui présentent une forte expression endogène de REG4
transcrits et des protéines. Par comparaison, MKN-1 cellules ont peu endogène REG4
transcription et affichés peu ou pas d'activité transcriptionnelle induite par 2,1, 1,2 ou 0,6 kb Les constructions de gènes rapporteurs REG4 de (données non présentées) . Le Les constructions de gènes rapporteurs REG4 de contenant des paires de bases -116 à 58 et -87 à 58 avaient une activité réduite dans les HSC-39 cellules (figure 2B.), Ce qui indique que les séquences entre les paires de bases -634 et - 116 jouent un rôle clé dans l'activation de REG4
transcription. En outre, nous avons analysé des mutations uniques et multiples dans les sites de Cdx2 liaison présomptifs dans la région 5'-flanquante du REG4
gène utilisant HSC-39 cellules (Fig. 2C). Comme prévu, présomptif site CDX2 liaison C, qui est situé entre les paires de bases -634 et -116, joue un rôle crucial dans l'activation de REG4
transcription.

CDX2 se lie directement à l'extrémité 5 ' -flanking région de REG4
Gene

pour analyser si CDX2 se lie directement aux sites de Cdx2 liaison putatifs dans le REG4 région
flanquant 5, nous avons effectué la chromatine immunoprécipitation (ChIP) des essais en utilisant HSC-39 cellules. En utilisant 6 amorces pour la REG4
flanquant 5 région (Fig. 3A), nous avons récupéré des fragments d'ADN contenant le REG4
flanquant 5 région par l'amorce 1, qui englobe CDX2- présomptif un site de liaison C (Fig. 3B). Les fragments d'ADN provenant de la région flanquant 5 'de REG4
, qui ont été générés en utilisant les amorces 2, 3, 4, 5 et 6 de telle sorte qu'ils ne contenaient des sites de liaison présumés CDX2, ont pas été récupéré par l'anti- anticorps CDX2. La spécificité de la récupération de la la région promotrice de REG4 suivante ChIP avec l'anticorps anti-CDX2 a été montré par le fait que d'autres fragments d'ADN non pertinent manque de sites Cdx2 liaison (par exemple, l'exon 3 de la CDX1
gene) n'a pas été récupéré (Fig. 3B). En outre, immunoprécipitation mock (IgG de souris) a donné quelques REG4
ou fragments d'ADN spécifique de CDX1 de (Fig. 3B). Tous ces résultats suggèrent que CDX2 active REG4
transcription en se liant directement à des séquences dans la région adjacente en 5 'du gène.

trimethylation de l'histone H3 lysine 27 (H3K27me3) sur le REG4 de Promoteur dans la GC lignées cellulaires

Bien que l'expression de la protéine CDX2 a été trouvée dans MKN-1 et MKN-28 lignées cellulaires, ces 2 lignées cellulaires manquait d'expression détectable de REG4
transcription et des protéines. Parce qu'il a été rapporté que l'ADN hyperméthylation des îlots CpG est associée à silençage de plusieurs gènes [28], nous étudions si méthylation de l'ADN induite inactivation transcriptionnelle de Reg IV dans MKN-1 et MKN-28 cellules. Nous avons traité les cellules avec un agent de déméthylation, 5-aza-2'-désoxycytidine (aza-dC), puis effectuer la qRT-PCR. Cependant, Reg IV expression n'a pas été rétabli dans ces lignées cellulaires (données non présentées), ce qui suggère que la méthylation d'ADN ne sont pas susceptibles d'affecter Reg IV expression. Il a été également rapporté que H3K27me3 a été associée à l'expression des gènes réprimés [29]. Nous avons également étudié H3K27me3 dans des lignées cellulaires GC. Afin de déterminer l'enrichissement de H3K27me3 sur l'écran REG4 de promoteur dans les lignées cellulaires du GC, des essais ont été effectués ChIP. Dans MKN-1 et MKN-28 lignées cellulaires, les niveaux H3K27me3 sur le la région du promoteur de REG4 étaient élevés, alors que dans HSC-39 lignée cellulaire, niveau H3K27me3 sur le la région du promoteur de REG4 était faible (Fig. 3C). Ces résultats suggèrent que la structure de la chromatine fermée de REG4 de promoteur peut inhiber Reg IV expression par CDX2.

Discussion

Bien qu'il ait été rapporté que Reg IV expression est induite par GLI1 [21] ou EGF [22], ces molécules ne sont pas susceptibles de rendre compte de l'association entre Reg IV et la différenciation intestinale. Dans la présente étude, nous avons montré que CDX2 endogène et Reg IV expression étaient bien corrélées dans des lignées cellulaires de GC. En outre, en utilisant une forme de CDX2 ER-réglementé, nous avons constaté qu'il y avait une induction rapide de Reg IV expression après le traitement 4-OHT. dosages de gènes rapporteurs ont révélé un rôle important consensus CDX2 ADN éléments dans le REG4
région promotrice de liaison dans sa transcription. des essais de ChIP ultérieures ont montré que CDX2 se lie directement au promoteur du REG4 . Nous avons montré précédemment que dans le tissu GC primaire et la métaplasie intestinale de l'estomac, CDX2 et Reg IV expression étaient bien corrélées [11]. Ces résultats indiquent que la protéine CDX2 régule directement Reg IV expression dans GC et la métaplasie intestinale de l'estomac.

CDX2 est surexprimé dans l'intestin phénotype GC et métaplasie intestinale de l'estomac [9], [25]. En revanche, la perte de l'expression de CDX2 a été observée dans un sous-ensemble des cancers colorectaux primaires, les cancers colorectaux généralement peu différenciées dans [30]. L'importance de l'altération de l'expression des CDX2 dans les cancers humains demeure incertaine, et il est donc important de définir les gènes cibles qui sont en aval de CDX2. Nous avons identifié plusieurs gènes Cdx2 réglementés tels que CDH17
(qui code pour LI-cadhérine) [24], HEPH
(qui code héphaestine) [31], ABCB1
(qui code pour la résistance à la polychimiothérapie 1) [32], et DSC2
(qui code Desmocolline 2) [33]. Parmi ces gènes, ABCB1
a été initialement identifié comme un gène surexprimé et amplifié dans les cellules résistantes aux médicaments multiples, et son produit, la P-glycoprotéine, semble jouer un rôle essentiel dans la résistance aux médicaments [34]. Auparavant, nous avons signalé que l'expression forcée de Reg IV dans les cellules GC inhibé l'apoptose 5-FU-induite par l'induction de Bcl-2 et dihydropyrimidine déshydrogénase [8]. Pris dans leur ensemble, il est possible que, dans l'intestin GC phénotype, l'expression (ou l'expression ectopique) de CDX2 induit Reg IV et multirésistance 1 'expression, ce qui entraîne une augmentation de la résistance aux médicaments. En fait, il a été rapporté que la chimiothérapie post-opératoire est pas bénéfique pour les patients atteints de phénotype intestinal GC [35].

Bien que nos données soutiennent l'idée que CDX2 joue un rôle dans la régulation de REG4
transcription via une liaison à la région de promoteur, plusieurs résultats indiquent que CDX2 seule ne suffit pas pour activer REG4
expression. Dans la présente étude, nous avons généré une population polyclonale de MKN-7, TMK-1, HSC-44PE et KATO-III des cellules qui expriment des niveaux élevés de CDX2 par infection avec des retrovirus portant une pleine longueur CDX2 humaine ADNc. Cependant, la surexpression de CDX2 n'a pas réussi à activer Reg IV expression. Dans les lignées cellulaires du GC, aucune des lignées cellulaires avec indétectables expression de la protéine CDX2 avait détectables REG4
transcrits et des protéines. Par conséquent, CDX2 est nécessaire pour Reg IV expression, mais CDX2 seule ne suffit pas pour activer Reg IV expression. Dans la présente étude, neuf lignées cellulaires GC ont été étudiés. L'origine des lignées cellulaires étaient les suivants. Le MKN-7, MKN-28, MKN-74 et les lignées cellulaires ont été établies à partir de type intestinal GC. Les lignées cellulaires TMK-1 et MKN-45 ont été établies à partir de type diffus GC. Le KATO-III, HSC-39, et HSC-44PE lignées cellulaires ont été établies à partir de carcinome chevalière. La lignée de cellules MKN-1 a été établie à partir d'un carcinome adénosquameux. Parce que dans la métaplasie intestinale de l'estomac, CDX2 et Reg IV expression sont bien corrélées, les lignées cellulaires GC établies à partir du type GC diffus ou carcinome chevalière peuvent ne pas convenir à l'analyse de Reg IV induction par CDX2. En effet, Reg IV, l'expression peut être induite par CDX2 dans des lignées cellulaires dérivées d'un cancer du côlon dans la présente étude. De plus, nous avons démontré que les niveaux H3K27me3 sur la région promotrice du REG4 étaient élevés pour des lignées de cellules MKN-1 et MKN-28 GC. Ces 2 lignées cellulaires manquaient d'expression détectable de REG4
bien que l'expression de la protéine CDX2 a été trouvé. Par conséquent, les niveaux H3K27me3 sur le la région du promoteur de REG4 peuvent être riches en MKN-7, TMK-1, les cellules HSC-44PE et KATO-III, dans laquelle la surexpression de CDX2 échoué à activer Reg IV expression.

Il a été rapporté que REG4
expression de l'ARNm a été renforcée par la stimulation avec le TGF-α, EGF, HGF, ou bFGF par l'activation de la protéine kinase activée par un mitogene (MAPK) [22] . Ainsi, on peut faire l'hypothèse que Reg IV est également régulée par des facteurs de transcription en aval des voies de MAPK. Nous avons effectué in silico
analyses de la REG4
gène région flanquant 5, et trouvé au moins un présomptifs AP-1 séquences consensus (à -883 paires de bases de REG4
gène de la région), ce qui est un facteur de transcription en aval de la signalisation MAPK flanquant 5 '. Dans la présente étude, HSC-39 cellules ont montré une activité transcriptionnelle similaire de constructions de gènes rapporteurs contenant 1,2 kb et 0,6 kb de REG4
séquence flanquant 5 '. Comme l'effet de l'EGF ou TGF-α sur REG4
transcription n'a pas été examinée dans la présente étude, une enquête plus approfondie est nécessaire pour clarifier les mécanismes de signalisation qui induisent la régulation de REG4
transcription.

En conclusion, nos données actuelles montrent que la protéine CDX2 régule directement Reg IV expression. Reg IV active la voie de signalisation EGFR /Akt /AP-1. Comme intestinale phénotype GC exprime fréquemment EGFR [36], il est suggéré que cette voie Reg IV activé joue un rôle important dans ce sous-type de GC. Parce CDX2 induit également l'expression du gène de résistance à la polychimiothérapie, ABCB1
, traitement anti-EGFR, mais pas la chimiothérapie peut être bénéfique pour les patients atteints de l'intestin phénotype GC.

Plasmides

CDX2 l'ADNc a été inséré dans le site de clonage multiple du vecteur d'expression rétroviral PPG-CMV-néo-CITE comme décrit précédemment [24]. La pleine longueur, de type sauvage CDX2 ADNc a également été sous-cloné dans le vecteur rétroviral pBabe-Puro ER comme décrit précédemment pour générer pCDX2-ER [24]. Le vecteur pCDX2-ER code pour une protéine chimère dans laquelle les séquences de pleine longueur Cdx2 sont fusionnées en amont d'un domaine de liaison de ligand muté ER. Le domaine de liaison au ligand muté ER ne se lie plus oestrogènes, mais conserve la capacité de se lier au tamoxifène. Les séquences d'ADN génomiques de la région flanquante en 5 'de l'être humain REG4
gènes ont été amplifiés par PCR en utilisant l'ADN génomique purifié à partir de cellules HSC-39 en tant que matrice et sous-cloné dans le [luc2] pGL4.10 vecteur (Promega , Madison, WI). des approches basées sur la PCR ont été utilisés pour introduire des mutations dans les sites de Cdx2 liaison présomptifs dans la construction de gène rapporteur pGL4.10-de REG4 utilisant QuikChange Mutagenesis Kit Site-Directed (Stratagene, La Jolla, CA). Quatre sites de Cdx2 de liaison putatifs ont été changés. Tous les fragments générés par PCR ont été vérifiés par séquençage automatisé. Le vecteur (Promega) plasmide pGL4.74 [hRluc /TK] a été utilisé comme témoin pour l'efficacité de transfection dans des dosages de rapporteur.

lignées cellulaires, Rétrovirus Infections et traitement de la toxicomanie

Le amphotrope Phoenix lignée cellulaire d'emballage a été fourni par G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Neuf lignées cellulaires dérivées de GC humaine et de 2 lignées cellulaires dérivées du cancer du côlon humain ont été utilisées. La lignée cellulaire TMK-1 a été créé dans notre laboratoire [38]. Les lignées de cellules HSC-39 et HSC-44PE ont été établies par l'un des auteurs (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Cinq lignées de cellules GC de la série MKN ont été aimablement fournies par le Dr Toshimitsu Suzuki [41], [42]. La lignée cellulaire KATO-III a été aimablement fourni par le Dr Morimasa Sekiguchi [43]. Les lignées de cellules cancéreuses du côlon HT-29 et SW480 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection. Les cellules ont été conservées dans l'azote liquide jusqu'à l'initiation de l'étude. Après décongélation du stock congelé, les cellules ont été maintenues à un faible passage tout au long de l'étude. la morphologie cellulaire uniforme a été contrôlée par comparaison des images microscopiques. Les cellules d'encapsidation Phoenix ont été transfectées avec des constructions rétrovirales d'expression (DEP-Cdx2, DEP-néo, et pCDX2-ER) et le surnageant contenant le virus amphotrope non réplicatives a été récolté comme décrit précédemment [24]. Dans les cellules HT-29 exprimant la protéine CDX2-ER fusion (HT-29 /CDX2-RE), la fonction de CDX2 a été activé par addition de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) à la croissance milieu à une concentration finale de 500 nmol. Afin de déterminer si la méthylation d'ADN induit une inactivation transcriptionnelle de Reg IV, les cellules ont été traitées avec une concentration finale de 1 uM aza-dC (Sigma Chemical) pendant 5 jours avant leur récolte pour l'extraction de l'ARN

Western Blot L'analyse <. br>

Pour l'analyse par transfert de Western, les cellules ont été lysées comme décrit précédemment [44]. Les concentrations en protéines ont été déterminées par dosage de Bradford protéine (BioRad, Richmond, CA) avec de la BSA utilisé comme étalon. Les lysats (20 ug) ont été solubilisés dans un tampon d'échantillon Laemmli par ebullition, puis soumis à 12% de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, puis par électro-transfert sur un filtre de nitrocellulose. Le filtre a été mis en incubation pendant 1 heure à température ambiante avec un anticorps anti-Reg IV (anticorps polyclonal de lapin développé dans notre laboratoire, réf. 10) ou un anticorps anti-CDX2 (BioGenex, San Ramon, CA). Conjugué à la Peroxydase anti-lapin ou anti-IgG de souris a été utilisé dans la réaction secondaire. Immuns ont été visualisés avec un système ECL Plus Western Blot Detection (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actine (Sigma Chemical) a également été détecté comme un contrôle de chargement.

qRT-PCR Analyse

ARN total a été extrait avec un kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA), et 1 pg d'ARN total a été converti en ADNc avec un kit de synthèse d'ADNc premier brin (Amersham Biosciences). Quantification de Les taux d'ARNm de REG4 a été réalisée par détection de fluorescence en temps réel comme décrit précédemment [45]. PCR a été réalisée avec un kit SYBR Green PCR Réactifs de base (Applied Biosystems, Foster City, CA). Détection en temps réel de l'intensité d'émission de vert SYBR lié à l'ADN double brin a été réalisée avec un ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) tel que décrit précédemment [46]. ACTB
produits de PCR spécifique de ont été amplifiés à partir des mêmes échantillons d'ARN et a servi comme témoin interne. Séquences d'amorces pour REG4
qRT-PCR sont présentés dans le tableau 1. qRT-PCR ont été réalisées en triple pour chaque ensemble échantillon d'amorce, et la moyenne et l'écart type (SD) des trois expériences a été calculé comme valeur de quantification relative. Au bout de 40 cycles de PCR, les produits de réaction ont été séparés par électrophorèse sur 8% non dénaturants des gels de polyacrylamide pour confirmation visuelle des produits de PCR.

ARNi

Pour le knockdown CDX2 endogène, l'ARNi a été effectuée . Deux duplex de cARNi ciblant CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1 et AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG 5'-3', CDX2 siRNA2) et d'un duplex de cARNi nonsilencing (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') ont été synthétisés (Qiagen). La transfection a été réalisée en utilisant de la Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) selon le protocole du fabricant. En bref, 60 pmol de l'ARNsi et 10 ul de Lipofectamine RNAiMAX ont été mélangés dans 1 ml de milieu RPMI (10 nmol /L concentration d'ARNsi finale). Après 20 min d'incubation, on a ajouté le mélange aux cellules et celles-ci ont été étalées sur des boîtes pour chaque essai. Trois jours après la transfection, les cellules ont été analysées pour toutes les expériences.

gène rapporteur Dosages

HSC-39 et MKN-1, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). La transfection de cellules à 50% -80% de confluence a été réalisée avec 3 pi de FuGENE6 Transfection Réactif (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 pg de pGL4.10 constructions de gènes rapporteurs, et 0,2 pg pGL4.74 [hRluc /TK] vecteur (Promega). 48 heures après la transfection, les cellules ont été recueillies et remises en suspension dans du tampon de lyse passive (Promega). L'activité luciférase a été déterminée avec un système de dosage à double luciférase (Glomax 96 microplaques luminomètre, Promega).

Essais
ChIP

Les tests de copeau ont été effectuées en utilisant le Immunoprécipitation Kit chromatine EZ-ChIP (Millipore, Billerica , MA) selon les instructions du fabricant. Analyser si CDX2 se lie directement aux sites de liaison putatifs Cdx2 dans la région REG4
flanquant 5, nous avons effectué des analyses de puce en utilisant des cellules HSC-39. En bref, HSC-39 cellules (1-2 x 10 ^{7) ont été réticulés avec 1% de formaldéhyde dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant 15 min à 37 ° C, et la glycine a été ajouté pour arrêter aldéhydes réactifs. Après lavage des cellules avec du PBS froid, les cellules ont été remises en suspension dans le tampon de lyse SDS (1% de SDS, EDTA 10 mM et Tris 50 mM, pH 8,1) avec protéinase (Roche Diagnostics). Après que les échantillons ont été traités aux ultrasons, les extraits chromatine contenant des fragments d'ADN (taille moyenne 500 paires de bases) ont été immunoprécipitées en utilisant 2 pg d'anticorps monoclonal anti CDX2 (BioGenex) ou 2 ug d'IgG de souris (Millipore). Chaque échantillon d'ADN immunoprécipité a été quantifié par PCR quantitative en utilisant les amorces énumérées dans le tableau 1. A titre de témoin négatif, un environ 200 paires de bases du fragment d'ADN de l'exon 3 de la balise CDX1
gène a été amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques (voir le tableau 1 ).}

Afin de déterminer l'enrichissement de H3K27me3 sur l'écran REG4 de promoteur dans les lignées cellulaires du GC, des essais de copeau ont été effectuées à l'aide MKN-1, MKN-28 et HSC-39 lignées cellulaires. En bref, des cellules GC (1-2 x 10 ^{7) ont été réticulés avec 1% de formaldehyde dans du PBS pendant 15 min à 37 ° C et on a ajouté de la glycine pour étancher les aldéhydes réactifs. Après lavage des cellules avec du PBS froid, les cellules ont été remises en suspension dans du tampon de lyse SDS avec protéinase (Roche Diagnostics). Après que les échantillons ont été traités aux ultrasons, les extraits chromatine contenant des fragments d'ADN (taille moyenne 500 paires de bases) ont été immunoprécipitées en utilisant 2 pg anti H3K27me3 anticorps polyclonal (Abcam, Cambridge, MA) ou 2 ug d'IgG de lapin (Millipore). Chaque échantillon d'ADN immunoprécipité a été quantifiée par qPCR en utilisant REG4
Primer 1 (Tableau 1).}

RCQP ont été réalisées en triple pour chaque ensemble échantillon d'amorce, et la moyenne et l'écart type (SD) de les trois expériences a été calculée comme la valeur relative de quantification. Au bout de 40 cycles de PCR, les produits de réaction ont été séparés par électrophorèse sur 8% non dénaturants des gels de polyacrylamide pour confirmation visuelle des produits de PCR.

Remerciements

Nous remercions M. Shinichi Norimura assistance technique pour une excellente et des conseils. Ce travail a été réalisé avec l'aimable coopération du Centre de recherche en médecine moléculaire, Faculté de médecine, Université d'Hiroshima. Nous remercions le Centre d'analyse des sciences de la vie, Université d'Hiroshima, pour l'utilisation de leurs installations.

• PLOS ONE: RhoC régule la prolifération des cellules du cancer gastrique par interaction avec IQGAP1
• PLOS ONE: Expression différentielle de phospholipase C Epsilon 1 est associé à chronique atrophique Gastrite et cancer gastrique