Plos ONE: Reg IV je neposreden cilj črevesnih prepisovalni dejavnik CDX2 želodčnega raka

Povzetek

REG4
, ki kodira Reg IV protein, je član kalcija odvisno lektin naddružina in močan aktivator faktorja receptorja za epidermalni rastni /Akt /aktivator protein-1 signalne poti. Več o človekovih raka hiperekspresijo Reg IV, in Reg IV izraz je povezan s črevesno diferenciacijo fenotipa. Vendar pa ureditev REG4
prepis ostaja nejasna. V tej študiji smo raziskovali, ali CDX2 ureja Reg IV izraz v celicah raka želodca (GC). Izražanje Reg IV in CDX2 smo analizirali z Western blot in kvantitativno reverzne transkripcije-verižno reakcijo s polimerazo v 9 GC celičnih linijah in 2 debelega črevesa celičnih linijah. Funkcija 5'-bočno regijo REG4
gena označen s luciferazni test. V 9 GC celičnih linijah, so endogeni Reg IV in CDX2 izraz dobro povezana. Uporaba estrogenski receptor-regulirano obliko CDX2 opazili hiter indukcija Reg IV izražanja HT-29 celice. Reporterski gen testi so pokazali pomembno vlogo pri transkripciji za soglasje CDX2 DNA vezavo elementa v 5'-bočno regijo REG4
gena. Kromatin imuno testi so pokazali, da CDX2 veže neposredno na-5'spremljajočimi regiji REG4
. Ti rezultati kažejo, da CDX2 protein neposredno ureja Reg IV izraz

Navedba. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012), Reg IV je neposreden cilj črevesnih prepisovalni dejavnik CDX2 želodčnega raka. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 24. maj 2012; Sprejeto: 12. september 2012; Objavljeno: 2. november 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi v obliki pomoči za raziskave z Ministrstva za izobraževanje, kulturo, znanost, šport in tehnologijo Japonske, in v delu, ki ga Grant-in-pomoč za tretje celoviti 10-letne strategije za raka nadzor in za raziskave raka, ki ga je ministrstvo za zdravje, delo in socialne zadeve Japonske, ter Nacionalni inštitut za biomedicinsko inovacije (program spodbujanja temeljnih študije v Health Sciences). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je eden izmed najpogostejših človeških raka na svetu. Rak razvije kot posledica različnih genetskih in epigenetskih sprememb [1]. Smo že opravili serijsko analizo genske ekspresije (SAGE) za štiri primarne GK in ugotovila več GC-specifične gene [2]. Od teh genov, regeneracijo-otoček izhaja družinski član 4
( REG4
, ki kodira Reg IV protein) je gen kandidat za izražanje raka specifične [3]. REG4
je član reg
gen družina, ki spada v kalcija odvisno lektin naddružine. REG4
je bil prvotno označene z visoko pretočno sekvenčno analizo velikega vnetnega cDNA črevesna bolezen knjižnice [4]. Reg IV je močan aktivator za epidermalni rastni faktor receptor (EGFR) /Akt /aktivator protein-1 (AP-1) signalne poti v rakastih celicah debelega črevesa in poveča ekspresijo Bcl-2, Bcl-XL in survivin, ki so proteini povezano z inhibicijo apoptoze [5]. Pomnoževanje REG4
gene, so poročali pri raku trebušne slinavke [6]. Reg IV je bila opredeljena kot eden od genov up-urejena v celicah raka začetek [7]. Prej smo proučevali vpliv prisilne izražanja Reg IV v GC celične linije. Pokazali smo, da Reg IV inhibira 5-fluorouracil (5-FU) inducirano apoptozo z aktivacijo EGFR v GC celic [8]. V nasprotju s tem, Pravilo IV-prekomerno ekspresijo celice niso pokazale pomembnih razlik v proliferacijo in invazijo aktivnost v primerjavi s celicami transficirane s praznim vektorjem [8]. Te ugotovitve podpirajo idejo, da Reg IV protein sodeluje pri želodčnem rakotvornost

GC lahko razdelimo na štiri fenotipov po mucin izražanja:. Želodca ali foveolar fenotipa; črevesne fenotip; črevesne in želodca mešani fenotip; in niti želodca niti črevesna fenotip [9]. pojavljajo različne genetske spremembe, ki so povezani z želodčno in črevesno fenotipa GC [10]. V naših predhodnih pripomb, je Reg IV, izražen v 30% primerov GC in je bila povezana s črevesno fenotipa [11]. Številne Imunohistokemične analiz Reg IV so poročali v človeških rakih [11] - [20]. Na splošno so te analize so poročali, da je Reg IV izražen v adenokarcinom celicah prikazujejo tudi črevesno fenotip. Ugotovljeno je bilo, da je Reg IV ekspresijo induciramo z GLI1, ki je ključni transkripcijski dejavnik ježek signalne poti v [21], ali rastnih faktorjev, kot so EGF, transformirajočega rastnega faktorja-a (TGF-alfa), hepatocitnega rastnega faktorja (HGF) ali bazičnega fibroblastnega rastnega faktorja (bFGF) [22]. Vendar pa so te molekule malo verjetno, da se upošteva povezave med Reg IV izražanja in črevesne diferenciacije fenotipa.

Prej smo ugotovili, da je bil izraz Reg IV povezana z CDX2 izražanja [11]. CDX2 je pri sesalcih, povezanih z repna črevesnih transkripcijski dejavnik in pomemben za vzdrževanje črevesnih epitelnih celic [23], [24]. Več linij dokazov, kažejo, da so črevesno metaplazija želodca in črevesne fenotipa GC povezana z zunajmaternične CDX2 izražanja [9], [25]. V tej študiji smo raziskovali, ali CDX2 ureja Reg IV izraza v GC in ugotovila, da CDX2 neposredno veže na 5'-spremljajočih regiji REG4
gena in povečuje aktivnost promotor.

Rezultati

Reg IV in CDX2 Expression so korelirani v GC celice

najprej smo preiskanih indukcijo Reg IV izražanja CDX2 v celičnih linijah GC. Western blot analiza CDX2 v 9 GC celičnih linij je pokazala, da je bil izraz nizko raven CDX2 ni zaznana ali v MKN-7, TMK-1, HSC-44PE in KATO-III (sl. 1A). Če želite ugotoviti, ali so bili CDX2 in Reg IV izraz tesno povezana v GC celicah, Western blot in kvantitativno povratne reakcije transkripcijski-polimerazo (QRT-PCR) analize Reg IV, so bile izvedene na celičnih linijah 9 GC. Kot je prikazano na sliki. 1A, je Reg IV protein izraz zaznali le v celičnih linijah 3 z visoko stopnjo REG4
prepisov, merjeno po QRT-PCR. Vodov mobilnih 5 GC z izrazom CDX2 beljakovin, 2 celične linije (MKN-1 in MKN-28) ni imela zaznaven izraz REG4
prepis in beljakovin. Linije celic z izrazom nezaznavne CDX2 beljakovin (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE in KATO-III) niso pokazali REG4
prepisi ali beljakovin (sl. 1A).

Nato smo ustvarili poliklonsko populacijo MKN-7, TMK-1, HSC-44PE in celic KATO-III, ki izraža visoko stopnjo CDX2 z infekcijo celic z replikacijo defekten retrovirusov ki imajo celotno dolžino cDNA humani CDX2, ker je nobenimi ali izražanje nizko raven CDX2 bila odkrita v teh celičnih linijah. Vendar pa prekomerno izražanje CDX2 igrišča za aktiviranje Reg IV izražanje Western blot (podatki niso prikazani). Ker je možno, da sam CDX2 ne zadostuje za aktiviranje Reg IV izražanje, izražanje CDH17
(kodiranje LI-kadherina protein), ki je eden od ciljev CDX2 [24], so raziskovali tudi. Vendar aktivacija LI-kadherina izražanja ni bilo mogoče najti v MKN-7 TMK-1 HSC-44PE in Kato-III celice, ki izražajo visoke nivoje CDX2 (podatki niso prikazani). Ker smo pokazali aktivacije LI-kadherina izražanja CDX2 v HT-29 debelega črevesa rak celične linije [24], je bila indukcija Pravilo IV izražanja raziskali v isti celični liniji. Kot je prikazano na sliki. 1B, indukcija Reg IV izražanja je bila odkrita v celicah HT-29, okuženih z retro ki imajo celotno dolžino cDNA humani CDX2. Prav tako smo ustvarili poliklonsko populacijo SW480 (kolona rak celične linije) celicah, ki izraža visoke nivoje CDX2 z infekcijo celic z replikacijo defekten retrovirusi nosijo polno dolžino cDNA humanega CDX2. Kot je prikazano na sliki. 1B, indukcija Reg IV izražanja je bilo ugotovljeno v SW480 celic, okuženih z retro ki imajo celotno dolžino cDNA humani CDX2. Ti rezultati kažejo, da je Reg IV ekspresijo induciramo z CDX2 v celičnih linijah, pridobljenih iz raka kolona. Ker so v intestinalno metaplazijo v želodcu, CDX2 in Reg IV izražanja tudi v korelaciji [11], je uporaba debelega črevesa raka celične linije je lahko primerna za model intestinalno metaplazijo.

Za boljšo oceno razmerja med CDX2 in Reg IV izraz, smo proučevali Reg IV izraza v HT-29, ki izhaja skladu z dobro urejeno CDX2 dejavnostjo. Uporabili smo poliklonsko HT-29 celične linije, ki so bili transducirajo z pCDX2-ER vektorja. pCDX2-ER vektor kodira himerni protein, v katerem se polni dolžini CDX2 sekvence zlit gorvodno mutirano estrogenskih receptorjev (ER) ligandom za vezavo domeno. Mutiran ER ligand-vezavna domena ne veže estrogena, vendar ohrani sposobnost, da veže tamoksifen. Zdravljenje linije celic HT-29 /CDX2-ER s 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) je povzročila močno indukcijo Reg IV beljakovin izražanja v 48 urah (sl. 1C). Ti rezultati kažejo, da je Reg IV neposredna ali primarni ciljni gen, ki jih CDX2 urejeno. Vendar pa sama CDX2 ne zadostuje za aktiviranje Reg IV izraz.

Zaviranje CDX2 s RNA Interference (RNAi) Rezultati v Dol-regulacijo Reg IV v GC celice

Če želite ugotoviti, ali CDX2 je potrebno za Reg IV ekspresijo v GC celicah, smo analizirali učinek inhibiranja CDX2 izražanje RNAi v stopnji Reg IV izražanja v HSC-39 celične linije, ker je bila visoka endogeni CDX2 in Reg IV izraz odkrili pri HSC-39 celične linije. majhne moteče RNA CDX2 specifične (siRNAs) bistveno zatreti CDX2 protein izražanje 3 dni po transfekciji in izražanje Reg IV prepisa ga je CDX2 siRNAs navzdol regulirano približno 50% v HSC-39 v primerjavi s svojimi ravneh v kontrolnih celicah-siRNA obdelan ( fig. 1D). Ti rezultati kažejo, da je CDX2 sodeluje pri vzdrževanju Reg IV izražanje genov.

Funkcionalna Karakterizacija 5'-bočno regiji REG4
Gene s luciferazni test

Če želite ugotoviti morebitno CDX2 -binding mest v repno REG4
promotor regija, iskanje od genomskih zaporedij takoj 5 'do domnevnih prepis začetnem mestu je bila izvedena s pomočjo soglasje zavezujoč element za CdxA piščanca
homolog (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 '), [26] in opisana predhodno iskalni algoritem [27]. Našli smo štiri domnevna CDX2-vezavnih mest na 2 kilobaznih (KB) 5'-bočno regijo REG4
genov (sl. 2A). To so bili: stran A (5'-AATAATA-3 ', od -1828 do -1834), na mestu B (5'-CTTTACAG-3', od -901 do -908), na mestu C (5'-TTTTATGG-3 "od -114 do -121), lokacije, D (5'AATAATA -3", od -90 do -96). Da bi ocenili vlogo teh domnevnih CDX2-vezavna mesta pri urejanju REG4
prepis, smo ustvarili različne novinar genske konstrukte. Kot je prikazano na sliki. 2B, reporterski gen konstrukti, ki vsebujejo 2,1, 1,2 ali 0,6 kb 5'-bočno zaporedjem iz REG4
genov je pokazala močno aktivnost v celicah HSC-39, ki prikazujejo močno endogene izraz REG4
prepisi in beljakovin. Za primerjavo, celice MKN-1 imajo malo lastnih REG4
prepis in prikaže malo ali nič transkripcijski dejavnost, ki jo 2,1, 1,2 ali 0,6 kb povzroča REG4
reporter genske konstrukte (podatki niso prikazani) . REG4
reporter genske konstrukte, ki vsebujejo baznih parov -116 do +58 in -87 do +58 je zmanjšala aktivnost v celicah HSC-39 (slika 2B.), Kar kaže, da zaporedja med baznih parov -634 in - 116 igrajo ključno vlogo pri aktiviranju REG4
prepis. Poleg tega smo analizirali enojne in večkratne mutacije v domnevnih CDX2-vezavna mesta v 5'-bočno regijo REG4
gena uporabo HSC-39 celice (sl. 2c). Kot je bilo pričakovati, sum CDX2 veže na mestu C, ki se nahaja med baznih parov -634 in -116, igra ključno vlogo pri aktiviranju REG4
prepisu.

CDX2 neposredno veže na 5 ' plazmida regiji REG4
Gene

za analizo, ali CDX2 neposredno veže na domnevno CDX2 veže mest v REG4
5'-bočno regijo, smo izvedli kromatina imuno (Chip) teste s pomočjo HSC-39 celice. Uporaba 6 začetnih oligonukleotidov za REG4
5'-robno območje (sl. 3A), smo se vrniti DNA fragmente, ki vsebujejo REG4
5'-robno regijo s primerjem 1, ki obsega domnevno CDX2- vezavno mesto C (sl. 3B). DNA fragmenti iz-5 'robno regijo REG4
, ki so bili ustvarjeni s pomočjo primerjev 2, 3, 4, 5 in 6, tako da ne vsebujejo domnevne CDX2 veznih mest, so bili ne proti- predela CDX2 protitelo. Posebnost obnovitev REG4
promotor regija po čip z anti-CDX2 protiteles je pokazalo dejstvo, da drugi nepomembno DNA fragmenti primanjkuje CDX2-vezavnih mest (npr ekson 3 CDX1
gen) niso bili ponovno (sl. 3B). Poleg tega, mock imunoprecipitacije (miš IgG) prinesla nekaj REG4
ali CDX1
-specifična DNA fragmentov (sl. 3B). Vsi ti rezultati kažejo, da CDX2 aktivira REG4
transkripcijo neposredno vezavo na sekvence v 5 'robno regijo gena.

Trimethylation iz histona H3 Lizin 27 (H3K27me3) o REG4
Promotor v GC Cell Lines

Čeprav je CDX2 protein izraz našli v MKN-1 in MKN-28 celičnih linijah, ti 2 celične linije manjkalo zaznavno izraz REG4
prepis in beljakovin. Ker pa so poročali, da je DNA hypermethylation od CpG otokov povezana z utišanje več genov [28], smo raziskali, ali DNA metilacija povzroča transkripcijski inaktivacijo Reg IV v MKN-1 in MKN-28 celic. obdelamo smo te celice z demetiliranjem sredstvom, 5-aza-2'-deoksicitidin (aza-DC), nato pa izvedemo QRT-PCR. Vendar Reg IV izraz ni bila obnovljena v teh celičnih linijah (podatki niso prikazani), kar kaže, da je DNA metilacije ni verjetno, da vplivajo na Reg IV izraz. Ugotovljeno je bilo tudi, da je bila H3K27me3 povezana z zatrta genske ekspresije [29]. Dodatno smo raziskovali H3K27me3 v celičnih linijah GC. Za določitev obogatitev H3K27me3 na REG4
promotor v celičnih linijah GC, so bile izvedene Chip testov. V MKN-1 in MKN-28 celičnih linij, ravni H3K27me3 na REG4
promotor regiji so bili visoki, medtem ko je v HSC-39 celične linije, ravni H3K27me3 na REG4
promotor regija je bila nizka (sl. 3C). Ti rezultati kažejo, da je zaprt kromatin struktura REG4
promotor lahko zavirajo Reg IV izražanje CDX2.

Pogovor

Čeprav smo poročali, da je Reg IV izraz, ki jih povzroča GLI1 [21] ali ESPG [22], te molekule so malo verjetno, da se upošteva povezave med Reg IV in črevesne diferenciacije. V tej raziskavi smo pokazali, da so endogeni CDX2 in Reg IV izraz tudi korelacija v GC celičnih linijah. Poleg tega, z uporabo obrazca, ER urejena v CDX2, smo ugotovili, da je bila hitra indukcija Reg IV izražanja po zdravljenju s 4 OHT. Reporterski gen testi so pokazali pomembno vlogo za soglasje CDX2 DNA vezavo elementov v REG4
promotorja regiji v svojem prepisu. Kasnejši čip testi so pokazali, da CDX2 veže neposredno na REG4
promotorja. Smo prej pokazali, da so bile v osnovnem GC tkiva in intestinalno metaplazijo v želodcu, CDX2 in Reg IV izražanja dobro korelira [11]. Ti rezultati kažejo, da CDX2 protein neposredno ureja Reg IV izraz v GC in intestinalno metaplazijo želodca.

CDX2 se prekomerno v črevesju fenotipa GC in intestinalno metaplazijo želodca [9], [25]. V nasprotju s tem so opazili izguba CDX2 izražanja v podskupini primarnih debelega raka, običajno v slabo diferencirane kolorektalnega raka [30]. Pomen spreminjanja CDX2 izražanja v človeških rakavih obolenj je še vedno nejasno, zato je pomembno, da se opredelijo ciljne gene, ki so dolvodno od CDX2. Identificirali smo več-CDX2 urejeno gene kot CDH17
(ki kodira LI-kadherina) [24], HEPH
(ki kodira hephaestin) [31], ABCB1
(ki kodira odpornost mnogovrstnimi 1) [32], in DSC2
(ki kodira desmocollin 2) [33]. Med temi geni, ABCB1
je bila prvotno opredeljena kot prekomerno in pomnoženega gena v več celic drog odporna, in njegov izdelek, P-glikoprotein, se zdi, da igrajo pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila [34]. Prej smo poročali, da prisilno izražanje Reg IV GC celic inhibira 5-FU inducirane apoptoze z indukcijo Bcl-2 in dihidropirimidin dehidrogenaze [8]. Vzeta skupaj, je možno, da v črevesju fenotipa GC, izražanja (ali zunajmaternične izražanje) z CDX2 povzroči Reg IV in rezistenco 1 izražanje, kar je povzročilo povečanje drog odpornosti. V resnici je bilo sporočilo, da je pooperativna kemoterapija ni koristno za bolnike s črevesno fenotipa GC [35].

Čeprav so naši podatki potrjujejo, da igra CDX2 vlogo pri uravnavanju REG4
transkripcijo z vezavo na promotorja regiji, več ugotovitve kažejo, da sam CDX2 ne zadostuje za aktiviranje REG4
izraz. V tej študiji smo ustvarili poliklonsko populacijo MKN-7, TMK-1, HSC-44PE in KATO-III celice, ki izražajo visoko stopnjo CDX2 po okužbi z retro ki imajo celotno dolžino cDNA humani CDX2. Vendar čezmernim CDX2 ni aktivirati Reg IV izraz. V celičnih linijah GC, nobeden od celičnih linij z nedokazljivo izražanja CDX2 beljakovin imel zaznavne REG4
prepisov in beljakovin. Zato je CDX2 potrebna za Reg IV izražanja, vendar sama CDX2 ne zadostuje za aktiviranje Reg IV izraz. V tej študiji so preučevali devet GC celične linije. Začetki celičnih linij so bili naslednji. MKN-7, MKN-28, in MKN-74 celične linije so bile določene iz črevesne tipa GC. V celične linije TMK-1 in MKN-45 so bile določene od difuznega tipa GC. Kato-III HSC-39 in HSC-44PE celične linije so bile določene s karcinomom pečat obroč celic. celična linija MKN-1 je bila določena s karcinomom adenoskvamozni celic. Ker v intestinalno metaplazijo želodca, CDX2 in Reg IV izraz so dobro povezana, GC celične linije s sedežem iz razpršenega tipa GC ali karcinoma pečatni prstan celic morda ni primeren za analizo indukcije Reg IV, ki ga CDX2. Dejansko lahko Reg IV izraz inducira CDX2 v celičnih linijah, pridobljenih iz raka kolona v tej študiji. Poleg tega smo pokazali, da so bile vrednosti H3K27me3 na REG4
promotorja regiji visoka v celičnih linijah MKN-1 in MKN-28 GC. Ti 2 celične linije manjkalo zaznavno izraz je bilo REG4
čeprav izražanja CDX2 beljakovin. Zato ravni H3K27me3 na REG4
promotor regija lahko veliko MKN-7, TMK-1, HSC-44PE in KATO-III celice, v kateri čezmernim CDX2 ni aktivirati Reg IV izraz.

so poročali, da em <> REG4
mRNA izraz je okrepljen s stimulacijo z TGF-α, EGF, HGF, ali bFGF po aktivaciji z mitogeni aktivirani protein kinaze (MAPK) pathway [22] . Tako bi se lahko hipotezo, da je Reg IV urejeno tudi z nadaljnjim transkripcijskih faktorjev MAPK poti. izvedli smo silico
analize REG4
gen 5'-bočno regija, in našli vsaj eno domnevno AP-1 konsenz sekvence (na -883 baznih parov REG4
gen 5'-robno regijo), ki je v smeri toka transkripcijski faktor MAPK signalizacijo a. V tej študiji je HSC-39 celice pokazala podobno transkripcijske aktivnosti reporterski gen konstruktov, ki vsebujejo 1,2 kb in 0,6 kb REG4
5'-bočno sekvenco. Kot učinek ESPG in TGF-a na REG4
prepis ni bila raziskana v tej študiji, so potrebne nadaljnje preiskave za razjasnitev signalne mehanizme, ki sprožijo regulacijo REG4
prepisu.

Na koncu so naši sedanji podatki kažejo, da CDX2 protein neposredno ureja Reg IV izraz. Reg IV aktivira EGFR /Akt /AP-1 signalne poti. Kot črevesne fenotip GC pogosto izraža EGFR [36], je bilo predlagano, da je ta Reg IV aktivira pot pomembno vlogo v tem podtipa GC. Ker CDX2 tudi inducira ekspresijo gena za rezistenco proti več zdravilom, ABCB1
, anti-EGFR zdravljenje, vendar ne kemoterapije je lahko koristna za bolnike s črevesno fenotipa GC.

Materiali in metode

plazmide

cDNA CDX2 je bila vstavljena v multiplo mesto za kloniranje v retrovirusni izraz vektorske pPGS-CMV-Cite-neo kot prej [24] opisano. Polne dolžine, CDX2 cDNA divjega tipa subkloniramo tudi v retrovirusni vektor pBabe-Puro ER, kot je opisano prej ustvariti pCDX2-ER [24]. pCDX2-ER vektor kodira himerni protein, v katerem se polni dolžini CDX2 sekvence zlit gorvodno mutirani ER ligandom za vezavo domeno. Mutiran ER ligand-vezavna domena ne veže estrogena, vendar ohrani sposobnost, da veže tamoksifen. Genomske DNA sekvence iz 5'-bočno regijo človeške REG4
gena smo pomnožili s PCR z uporabo genomske DNA očistimo s HSC 39-celicah kot predlogo in subklonirali v [luc2] vektorja pGL4.10 (Promega Madison, WI). pristopi na osnovi PCR so bili uporabljeni za uvedbo mutacije v domnevnih CDX2-vezavna mesta v pGL4.10-REG4 reporterski genski konstrukt, ki uporabljajo QuikChange Site-usmerjena mutageneza Kit (Stratagene, La Jolla, CA). so spremenili štirje domnevni CDX2 veže mesta. Vsi delci, ki nastanejo s PCR smo preverili z avtomatizirano sekvenciranje. Plazmid pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega) je bila uporabljena kot kontrola za učinkovitost transfekciji v reporter testih.

Cell Lines, retrovirus Infekcijske in drog Zdravljenje

amphotropic Phoenix embalaža celično linijo je bil zagotovljen z G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. smo uporabili devet celične linije iz človeške GC in 2 celičnih linij, pridobljenih iz človeškega raka na debelem črevesu. Celično linijo TMK-1 je bila ustanovljena v našem laboratoriju [38]. V celične linije HSC-39 in HSC-44PE so bile določene z enim od avtorjev (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Pet GC celične linije serije MKN so sami pripravili dr Toshimitsu Suzuki [41], [42]. celično linijo KATO-III je prijazno, ki jih dr Morimasa Sekiguchi [43]. rak kolona celične linije je HT-29 in SW480 smo dobili od American Type Culture Collection. Celice smo shranimo v tekočem dušiku, dokler začetku te študije. Po tajanje iz zamrznjene zaloge so bile celice vzdržujemo pri nizki prehodu ves čas študije. Dosledno je morfologija celic smo spremljali s primerjavo mikroskopskih slik. V embalažni celice Phoenix so transfekciji s retrovirusnih izražanja konstrukti (pPGS-CDX2, pPGS-neo, in pCDX2-ER) in supernatanta, ki vsebuje nonreplicating amphotropic virus je pospravljena kot je opisano prej [24]. V HT 29-celicah, ki izražajo protein CDX2-ER fuzijski (HT-29 /CDX2-ER), je funkcija CDX2 aktiviramo z dodatkom 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) z rastjo medij na končno koncentracijo 500 nmol. Raziskati, ali DNA metilacija povzroča transkripcijsko inaktivacijo Reg IV, smo celice obdelali s končno koncentracijo 1 um aza-DC (Sigma Chemical) za 5 dni, preden so bili pridobljeni ekstrakcijo RNA.

Western Blot Analiza

Za Western blot analizo, smo celice lizirali kot prej [44] opisano. Koncentracije proteinske smo določili z Bradfordu beljakovin testom (BioRad, Richmond, CA) z BSA uporabimo kot standard. Za lizate (20 ug) smo raztopili v vzorčnem pufru Laemmlijevega s kuhanjem in nato izpostavimo 12% SDS-poliakrilamidnem gelu, čemur sledi elektro-prenosom na filtru nitrocelulozno. Filter smo inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi s protitelesom anti-Reg IV (kunčje poliklonalno protitelo razvit v našem laboratoriju, ref. 10) ali anti-CDX2 protitelesa (BIOGENEX, San Ramon, CA). Peroksidazo konjugiranih anti-kunčjega ali anti-mišji IgG smo uporabili v sekundarnem reakciji. Imunokompleksi smo prikazali s sistemom za ECL Plus Western Blot Detection (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-aktin (Sigma Chemical) je bil zaznan tudi kot kontrolo obremenitve.

QRT-PCR analizo

Total RNA je bila vzeta s RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), in 1 ig celotne RNA smo pretvorili v cDNA z Prva Sklop cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantificiranje REG4
ravni mRNA je opravil v realnem času fluorescenčno detekcijo kot prej [45] opisano. PCR smo izvedli s kompletom SYBR Green PCR Core reagenti (Applied Biosystems, Foster City, CA). detekcija v realnem času intenzivnosti emisije SYBR zelene vezan na dvoverižno DNA smo izvedli z ABI PRISM 7900 Sistem za zaznavanje zaporedja (Applied Biosystems), kot smo že prej opisali [46]. ACTB
-specifična PCR produkte smo pomnožili iz istih vzorcih RNA in je služil kot notranji nadzor. Sekvence oligonukleotidnih za REG4
QRT-PCR, so prikazani v tabeli 1. QRT-PCRs smo izvedli v treh izvodih za vsak vzorec osnovnim naborom in srednja in standardna deviacija (SD) treh poskusov smo izračunali kot relativna količinsko vrednost. Na koncu 40 ciklov PCR so reakcijski produkti elektroforetsko ločili na 8%-denaturirnih brez poliakrilamidnih gelih za vizualno potrditev produktov PCR.

RNAi

rasklapanje endogenega CDX2, RNAi bila izvedena . Dva siRNA Dvojniki ciljanja CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1 in 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) in nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') so bili sintetizirani (Qiagen). Transfekciji smo izvedli z Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, 60 pmol z siRNA in 10 xl od Lipofectamine RNAiMAX zmešamo v 1 ml RPMI mediju (10 nmol /L koncentracijskem končno siRNA). Po 20 minutah inkubacije smo zmes dodamo k celicam in jih zasadimo v posode za vsak test. Tri dni po transfekciji smo analizirali celice za vse poskuse.

reporterski gen Testi

HSC-39 in MKN-1 celice smo zasejali v 6 vdolbinami (BD Falcon, Franklin jezer, NJ ). Transfekciji celic na 50% -80% konfluentne je bila izvedena s 3 p.L FuGENE6 transfekciji Reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0.8 ig pGL4.10 reporter genskih konstruktov in 0,2 mikrogramov pGL4.74 [hRluc /TK] vektorja (Promega). 48 ur po transfekciji smo celice zbrali in ponovno suspendirali v pasivnem liznega pufra (Promega). Luciferazno aktivnost je bila določena s poskusnim sistem dvojnega luciferazno (GloMax 96 mikroplošč Luminometer, Promega).

čip Testi

čip Teste smo izvedli s pomočjo EZ-chip kromatina imuno Kit (Millipore, Billerici , MA) po navodilih izdelave. Analizirati, ali CDX2 neposredno veže na domnevno CDX2 veže mest v REG4
5'-sosednja območja, smo izvedli čip teste s pomočjo HSC-39 celice. Na kratko, HSC-39 celice (1-2 x 10 ^{7) so bili navzkrižno povezane z 1% formaldehida v fosfatnim pufrom (PBS), 15 minut pri 37 ° C in dodamo glicin dušenja reaktivne aldehidov. Po izpiranju celic z mrzlo PBS, smo celice resuspendirali v SDS lize blažilnika (1% SDS, 10 mM EDTA in 50 mM Tris pH 8,1) s proteinazo Zaviralec (Roche Diagnostics). Potem ko so bili sonicated vzorcev, so kromatin izvlečki, ki vsebujejo DNA fragmente (povprečna velikost, 500 baznih parov), imuno uporabo 2 mikrogramov monoklonsko anti-CDX2 protitelesa (BIOGENEX) ali 2 mikrogramov miške IgG (Millipore). Vsak imunoprecipitirali vzorec DNK smo kvantificirali s qPCR uporabo primerjev, navedene v tabeli 1. Kot negativno kontrolo, an približno 200 baznih parov DNA fragmentov iz ekson 3 CDX1
gen smo pomnožili s PCR z uporabo specifičnih primerjev (Tabela 1 ).}

Za določitev obogatitev H3K27me3 na REG4
promotor v celičnih linijah GC, čip teste smo izvedli s pomočjo MKN-1, MKN-28, in HSC-39 celičnih linij. Na kratko, GC celic (1-2 x 10 ^{7) so bili navzkrižno povezane z 1% formaldehida v PBS 15 minut pri 37 ° C in dodamo glicin dušenja reaktivne aldehidov. Po spiranju celice z mrzlo PBS, smo celice resuspendirali v SDS liznega pufra s proteinazo Zaviralec (Roche Diagnostics). Potem ko so bili sonicated vzorcev, so kromatin izvlečki, ki vsebujejo DNA fragmente (povprečna velikost, 500 baznih parov) imuno z 2 ig poliklonski anti-H3K27me3 protitelesa (Abcam, Cambridge, MA) ali 2 mikrogramov zajec IgG (Millipore). Vsak imuno vzorec DNK je količinsko s qPCR uporabo REG4
Primer 1 (tabela 1).}

qPCRs smo izvedli v treh izvodih za vsak vzorec grundiranje nizu, povprečni in standardni odklon (SD) o trije poskusi smo izračunali kot relativna vrednost določljivosti. Ob koncu 40 ciklov PCR, so reakcijski produkti elektroforetsko ločili na 8%-denaturacije niso poliakrilamidnih gelov za vizualno potrditev produktov PCR.

Priznanja

Zahvaljujemo se gospodu Shinichi Norimura za odlično tehnično pomoč in svetovanje. To delo je bilo opravljeno v sodelovanju prijazno Raziskovalnega centra za molekularno medicino Medicinske fakultete, Univerze Hirošima. Zahvaljujemo se za analizo Center of Life Science, Hiroshima University, za uporabo svojih objektov.

• Plos ONE: RhoC Uravnava širjenju želodca raka celic skozi interakcijo z IQGAP1
• Plos ONE: Diferencialni Izražanje fosfolipaze C Epsilon 1 je povezana s kronično atrofični gastritis in želodca Cancer