PLoS ONE: Down-asetus AP-4 Estää leviämisen, indusoi solusyklin pysähtymiseen ja Edistää apoptoosi ihmisen mahasyövän Cells

tiivistelmä

Background

AP-4 kuuluu perus helix-loop-helix leusiini-vetoketju alaryhmä; se ohjaa kohdegeenin ilmentyminen säätelee kasvua, kehitystä ja solujen apoptoosin ja on tuumorigeneesiin. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että AP-4 oli usein yli-ilmennetään syöpien ja saattavat liittyä heikkoon ennusteeseen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia, vaiennettu AP-4 voi muuttaa biologisia ominaisuuksia mahalaukun syöpäsoluja.

Methods

Kaksi erityistä siRNA kohdistaminen AP-4 suunniteltiin, syntetisoitiin, ja transfektoidut mahalaukun syövän solulinjoissa ja ihmisen normaalia limakalvon soluista. AP-4 ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä ja Western blot. Solujen lisääntyminen ja Chemo-herkkyyden havaittiin CCK-8 määrityksessä. Solusyklin määritys ja apoptoosimäärityksessä suoritettiin virtaussytometrillä, ja suhteellinen ilmentyminen solun lukiertosäätelijöistä havaittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä ja Western blot, ilmaus tekijöitä apoptoosireittiä tutkittiin mRNA ja proteiini tasolla.

tulokset

ilmentyminen AP-4 hiljennettiin jonka siRNA: t transfektion ja vaikutuksia AP-4 knockdown kesti 24-96 tuntia. SiRNA-välitteinen vaiennettu AP-4 tukahdutetaan solujen proliferaatiota, indusoi apoptoosin ja herkistyneet syöpäsolujen syöpälääkkeiden. Lisäksi, ekspression taso p21, p53 ja kaspaasi-9 lisättiin, kun AP-4: n pudotus, mutta ilmaus sykliini D1, Bcl-2 ja Bcl-x _{L estyi. Se ei aiheuttanut solusyklin pysähtymiseen, kun AP-4 pudotus p53 vika mahasyövässä solulinja Kato-III.}

Johtopäätökset

Nämä tulokset havainnollistetaan että geenien AP-4 voi tehokkaasti esti solujen lisääntymistä, laukaisee apoptoosin ja herkistyneen syöpäsolujen syöpälääkkeet in vitro, viittaa siihen, että AP-4 siRNA-välitteisen hiljentäminen on mahdollista arvoa hoidettaessa ihmisen mahasyövän.

Citation: Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) Down-asetus AP-4 Estää leviämisen, indusoi solusyklin pysähtymiseen ja Edistää apoptoosi ihmisen mahasyöpä syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 18 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 16, 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka ilmaantuvuus ja kuolleisuus liittyy mahasyöpä on vähitellen laskenut viime vuosina useimmilla alueilla maailmassa [1], [2], mahasyöpä edelleen maailmanlaajuinen terveys- taakka, ja edelleen yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien vähän parantamisen pysyvyyttä. Tehokkain hoito mahasyövän oli täysin kirurginen poisto neoplastisen kudoksen D2 imusolmukkeiden. Lisäksi adjuvantti kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat auttaneet parantamaan ennustetta. Jopa niin, 5 vuoden pysyvyys pysyi erittäin huono [1], [3]. Yli miljoona uutta tapausta diagnosoitiin vuosittain, etenkin Itä-Aasiassa, kuten Japani, Korea, ja Kiina. Näissä maissa, mahasyövän edelleen yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat, ja tarkka synnyssä on tuntematon [3].

transkriptio tekijät ovat tärkeitä sääntelyn komponentteja [4]. He kuuluivat helix-loop-helix perheen ja oli tärkeä rooli solujen lisääntymisen ja erilaistumisen, solulinjaan määritys, ilmaus solunsisäisen geneettisen informaation, ja muita keskeisiä prosesseja [5]. Jäsenenä perus helix-loop-helix leusiini-vetoketju (bHLH-LZ) alaryhmä bHLH-proteiinien [6], aktivoimalla tehostajan sitova proteiini 4 (AP-4) tunnistettiin alunperin solun proteiini, joka sitoutuu apinavirus 40 (SV40) edistäjä ja aktivoida viruksen myöhäinen geenin transkriptio [7]. AP-4 on ekspressoituvat transkriptiotekijän ja ne voivat valvoa transkription verkkojen aikana solujen erilaistumisen muodostamalla homodimeerien ja sitoutumaan symmetrinen DNA-sekvenssin, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 on ligandi immunoglobuliini-kappa-promoottorin E-box elementtejä, jotka voidaan osallisena on immuunivajavuustilan [13], [14]. Lisäksi, toisin kuin muut HLH proteiineja, AP-4 sisältää kaksi proteiinia, dimerointi kuviot koostuvat leusiinin toista elementtien LR1 ja LR2. Näin ollen AP-4 esitetään erityinen kolmen osapuolen dimeroitumisen rakenne viittaa siihen, että AP-4 voivat olla vuorovaikutuksessa monenlaisia ​​transkriptiotekijöiden [8], [14]. AP-4 säätelee kuvaamaan joitakin geenejä [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Esimerkiksi se aktivoi transkriptiota hMTIIA geenin ja osallistuu säätelyyn ihmisen proenkefaliini ilmaisun [22], ja se voi olla tärkeä rooli ilmaus haiman exocrine geeniperheen [23]. Äskettäin yliekspressio AP-4: n raportoitu peräsuolen syöpä, rinta- ja eturauhassyövän [9], [18], [24].

RNA-interferenssi (RNAi) on prosessi, jossa sekvenssin tiettyyn toimeen -transcriptional geenien alulle kaksijuosteinen RNA [25], mikä voi johtaa vaiennettaisi erityisten solun geenin ja tarjoavat tehokkaan käänteisen genetiikan lähestymistapaa, jossa analysoidaan geenifunktioiden sekä in vitro että in vivo [26]. Tällä hetkellä yleisimmin käytetty nukleiinihapposekvenssi-pohjainen sekvenssi-spesifisen geenin hiljentäminen molekyylit olivat pieniä häiritseviä RNA: ita, [27], nimeltään siRNA: t, jotka on symmetrinen dupleksien 19-21 emäsparia [28]. SiRNA menetelmä voisi estää kohdegeenin ilmentymisen kanssa spesifisyys, tehokkuutta ja kestävyyttä [29].

raportoitu aikaisemmin, että AP-4 yliekspressoitui mahasyövän ja että se voi liittyä huono ennuste [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutki vielä AP-4: n toimintaa ihmisen mahasyövän solun RNA-interferenssi.

Tulokset

Erityisiä siRNA kohdistaminen AP-4 ilmentyminen ihmisen mahasyövän solujen ja ihmisen normaalin limakalvon solut

vaikutuksen arvioimiseksi siRNA-välitteisen hiljaisuus AP-4-geenin ilmentymistä, ohjaus siRNA ja AP-4 erityisiä siRNA: t transfektoitiin soluihin 24 h, 48 h, 72 h , ja 96 h. Tehoa in alaspäin säätäminen ilmentymisen AP-4-geenin havaittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä ja western blot. Kuten on esitetty kuviossa 1, AP-4 erityisiä siRNA: t voivat tehokkaasti estää geenin transkription ja translaation. MRNA ja proteiini tasot AP-4 vähennettiin AP-4 siRNA transfektion ryhmä, mutta ei kontrolli siRNA (kuvio 1). SiRNA: t indusoitiin tukahduttaminen AP-4: n ekspression ei voitu havaita 24 tunnin transfektion jälkeen. Kuitenkin inhibitio aleni 72 tuntia transfektion jälkeen. Tehokkain ajankohta oli välillä 48 h 72 h tukahduttaa ilmentyminen AP-4. Suhteellinen mRNA transkriptien merkitsevästi väheni lähes 90% vuonna siRNA-1 ryhmässä, ja 95% vuonna siRNA-2-ryhmä. Oli välillä tilastollista merkitystä siRNA: t ryhmän ja kontrolliryhmän.

Down-regulation of AP-4 lauseke esti solujen lisääntymistä ja herkistyneet ihmisen mahasyövän solujen syöpälääkkeiden

vaikutuksen tutkimiseksi AP-4 erityisiä siRNA soluproliferaatioon ja chemo-herkkyys syöpäsolujen, 20 nM AP-4 erityisiä siRNA: t tai ohjaus siRNA transfektoitiin ja solujen lisääntyminen määritettiin CCK-8-määritys 48 tunnin transfektion jälkeen. Olemme havainneet, että pudotus AP-4 voi inhiboida mahasyövän solulinjojen SGC7901 ja AGS (kuvio 2), mutta ei normaalissa limakalvon solulinjassa GES-1 verrattuna kontrolliin siRNA-transfektiolla 48 tuntia (kuvio 2). Nämä tulokset osoittivat, että AP-4 siRNA heikennetty soluproliferaatioon mahalaukun syövän soluissa in vitro. Lisäksi olemme tutkineet rooli AP-4 säätelyssä kemiallis-herkkyys ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Vertasimme lääkeaine herkkyys AP-4 siRNA: t, kanssa, ohjaus siRNA tai mock-solut ja totesi, että suhteellinen inhibitio hinnat AP-4 erityisiä siRNA: t olivat huomattavasti korkeampia kuin ohjaus siRNA tai mock-solut (p < 0,0001) (kuvio 2 ). Lisäksi AP-4 siRNA merkittävästi parannettu herkkyyttä solujen ADR, 5-FU tai cis-plantinum hoito kahdella eri tavalla annoksen (kuva 2), nämä ehdotti, että alas-säätely AP-4 voi olla myönteinen vaikutus herkkyys kemoterapiaa.

hiljentäminen AP-4 ilmentyminen indusoi solusyklin pysähtymiseen ja moduloitu ilmentymistä p53, p21 ja sykliini D1

vaikutus AP-4 solusyklin etenemistä tutkittiin . Ihmisen mahasyövän-solut transfektoitiin 20 nM ohjaus siRNA, ja AP-4 erityisiä siRNA: t 48 tuntia, vastaavasti, jonka jälkeen propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometria-analyysi solusyklin. Kun taas solut, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA edennyt eri vaiheiden solusyklin solut transfektoitiin AP-4 erityisiä siRNA: t näytetään huomattavasti korkeampi taajuus solut G0 /G1 vaiheiden (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68.97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) ja harvemmin solujen S-vaiheen (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Prosenttiosuus solujen G0 /G1 vaihetta transfektoitu AP-4 siRNA: t oli merkittävästi korkeampi kuin mock-solut (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p < 0,05) tai kontrolli-siRNA (SGC7901 /ohjaus siRNA: 52,18%; AGS /ohjaus siRNA: 50,38%) (kuvio 3). Näin ollen transfektion AP-4-spesifisiä siRNA: iden indusoima solun sykliini pidätys G0 /G1 vaiheissa.

AP-4 erityisiä siRNA indusoi solusykliä lohkon tutkittiin tarkemmin havainnoimalla vaikutuksia AP-4 erityisiä siRNA: illa hoitoon suhteelliseen ekspressioon solun lukiertosäätelijöistä: kasvaimen p53, sykliiniriippuvaiset kinaasi-inhibiittori p21, ja G (1) -vaiheen-spesifisiä sykliini D1, jotka olivat kriittisiä säätelijöitä solusyklin ja lisääntymistä. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen ihmisen mahalaukun syövän solut kerättiin reaaliaikaista PCR: ää ja immunoblottaus-analyysi. Transfektio AP-4 erityinen siRNA voisi ajan säädellä p53 ja p21-proteiinin. Modu vaikutus AP-4 siRNA: t oli suurempi kuin ohjaus siRNA (kuvio 4) (p < 0,01). Kuten odotettua, sykliini D1 alassäädetty verrattuna valvoa siRNA ryhmään ja mock ryhmä (kuva 4) (p < 0,01). Nämä tiedot edelleen tukivat hypoteesia, että hiljentäminen ilmentymistä AP-4 muuttunut ilmentyminen muiden solun pyöräily sääntelyviranomaisten, indusoi solusyklin pysähtymiseen ja inhiboivat ihmisen mahalaukun syöpäsolujen

havaitseminen apoptoosin ja tekijöitä apoptoosireittiä

määrittää vaikutus AP-4 erityisiä siRNA apoptoosiin ihmisen mahasyövän soluja, anneksiini-V: n ja PI-värjäyksellä määrityksiä käytettiin yhdessä virtaussytometrialla. Solut värjättiin anneksiini V-FITC /PI ja porteilla osaksi Ala Right (LR) ja ylhäällä oikealla (UR) neljännestä. Solut LR ja UR katsottiin varhainen apoptoottinen (anneksiini ^{+ /PI -) ja myöhäinen apoptoottiset (anneksiini + /PI +) vastaavasti. Solut LL (alhaalla vasemmalla) ja UL (ylempi vasen) neljännesten katsottiin olevan elossa ja nekroottista vastaavasti. Laajuus apoptoosin ilmaistiin summa prosenttiosuudet LR ja UR neljännestä. Apoptoottiset hinnat olivat osoitti kuvassa 5. Käsitelty solujen AP-4 siRNA osoitti enemmän apoptoottisia soluja (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) kuin negatiivinen (SGC7901 /ohjaus siRNA: 5,5%; AGS /ohjaus siRNA: 6,7%) (p < 0,05) ja tyhjä (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Nämä tulokset osoittivat, että AP-4 erityinen siRNA kykenivät indusoimaan apoptoosin näissä soluissa.}

Lisäksi tutkimme ilmaus tekijöitä apoptoosireitin reaaliaikainen PCR mRNA-tasolla, kuten Bcl-2 Bcl-x _{L, Caspase-9, kaspaasi-8: n ja Bax. Se osoitti, että pudotus AP-4 voisi up-säätelemään Baspase-9 ihmisen mahalaukun syövän soluja, ja modu- loiva vaikutus AP-4 siRNA: t oli suurempi kuin ohjaus siRNA (kuvio 6) (p < 0,01). Ilmaisu Bcl-2 ja Bcl-x L laskivat verrattuna kontrolliryhmään siRNA tai mock ryhmä (kuva 6) (p < 0,01). Nämä tiedot edelleen tuettava että vaiennettaisi AP-4 ilmaus johti apoptoosin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Kuitenkin, ekspressio kaspaasi-8: n ja Bax olivat erilaisia ​​eri solulinjoissa transfektion jälkeen. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, kaspaasi-8: n ja Bax oli yli ilmentymistä AGS soluissa. Vuonna SGC7901 soluissa, ekspressio Bax kasvoi, mutta ekspressio kaspaasi-8 lisääntyi vain siRNA-1 ryhmä. SiRNA-2-ryhmä, kaspaasi-8 ilmentyminen ei ollut merkittävää vaikutti (kuvio 6).}

AP-4 hiljentäminen voi säädellä solusyklin ja solu- apoptoosia sekä p53-riippuvainen ja riippumaton-tavat

Voit tarkistaa, onko säätely ylöspäin p53 AP-4 knockdown mahasyövän soluissa oli kriittinen rooli solukierron pysähtymisen, Kato-III soluja, eräänlainen p53 vika mahasyövän solulinjaa käytettiin arvioimaan riippuvuutta AP -4 knockdown vaikutus p53. Huomasimme, että knockdovvn AP-4 AGS villiin p53 tai SGC7901 kanssa mutantti p53 voisi aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen, mutta tämä ilmiö ei havaittu Kato-III soluja (kuvio 7), prosenttiosuus solujen G0 /G1 faasit olivat 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (kontrolli siRNA) ja 59,06% (mock). Ne osoittivat, että Knockdown AP-4 ehkä säätelevät solusyklin avulla p53-p21-reitin. Apoptoosi populaatio havaittiin myös Kato-III solujen anneksiini V-FITC ja PI värjäystä. Tulokset osoittivat, että apoptoosin määrä Kato-III transfektoitujen solujen AP-4 siRNA (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) oli suurempi kuin kontrolli siRNA (3,3%) (p < 0,05) ja mock soluja (3,5%) (p < 0,05), mutta vähemmässä määrin kuin se teki AGS (p < 0,05) ja SGC7901 solut (p < 0,05), mikä osoittaa, että hiljentäminen AP-4 voivat aiheuttaa apoptoosin mahasyövän soluihin molemmat p53-riippuvaisen ja riippumaton-tavat.

keskustelu

Geenien ilmentyminen on keskeinen ja erittäin konservoitunut prosessi. Transkriptio, ensimmäinen vaihe geenin ilmentymisen, suoritetaan rakenteellisesti konservoituneet DNA: sta riippuvan RNA-polymeraasit, mikä johtaa synteesi RNA-molekyylin DNA-templaatista [31]. Transkriptiotekijät, muoto transkription aloitus- kompleksi RNA polymeras II osallistua prosessiin transkription aloittamisesta säätelemään geeniekspressiota. Ne voivat olla tärkeä rooli muutoksen, tuumorigeneesiprosessin kasvainprogression ja etäpesäkkeiden säätelemällä transkriptiota ja siten geenin ilmentymistä [32], [33], [34]. Transkriptiotekijän AP-4, joka kuuluu nopeasti kasvava ryhmä HLH proteiinien [8] osallistuu erilaistumiseen ja solujen lisääntymistä [35], [36], [37], [38], [39], vaikuttaa solusyklin tapahtumia ja apoptoosin, säätelee ja valvoo joissakin geeniekspression [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Viime aikoina on raportoitu, että AP-4: ää säädellään ylöspäin paksusuolen syöpä, rintasyöpä ja eturauhassyöpä [9], [18], [24]. Lisäksi AP-4 positiivinen ilme osoitti huonon ennusteen kanssa merkitystä yli luokalla solmun tila tai koko ER + rintasyövän, ja mahdollisesti yhdessä kemoterapian herkkyys [40]. Meidän aiemmin tutkia, olemme havainneet, että ilmentymisen AP-4: n yli-ilmennetään, ja se yhteistyössä liittyvät huonoon ennusteeseen [30]. Se voi olla molekyyli markkeri diagnoosia ja ennusteen mahasyövässä. Esillä olevassa tutkimuksessa ,. Suunnittelimme kaksi AP-4 erityisiä siRNA estää ilmentymisen AP-4-geenin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. He olivat vakiintuneet ja transfektoida soluihin johtaa knock-down AP-4-geenin ilmentymisen. Olemme havainneet, että tehokkain ajankohtana tukahduttamaan AP-4: n ekspression mahasyövän soluja 48 h ja 72 h transfektion jälkeen. Näin ollen, päätimme entinen edelleen tehdä niihin liittyviä tutkimus.

Aiemmin on osoitettu, että transkriptiotekijän AP-4, toisin kuin muut HLH proteiineja, sisälsi kaksi erillistä leusiini toista elementit, jotka myös suoraan dimerisaation ja sallivat valikoiva kompleksin muodostuminen läsnä AP-4-proteiinia [8], [41].

AP-4 voisi olla tärkeä rooli modulaatioon solutoiminnoille säätelemällä geenien viruksen tuotantoon [7], [16 ], [22], [42], [43], solujen kasvuun ja eloonjääminen [9], [17], [23], [44], immuunivastetta [14], [41], [45], ja angiogeneesi [21]. Peter Jung, et ai havaittu, että AP-4 voisi koodata c-MYC-indusoituvaa repressoria inhiboida p21 ilmentymistä [9], ja oletettavasti tärkeä rooli välittämisessä proliferatiivinen aktiivisuus c-MYC [10]. Lisäksi, AP-4 vaikuttanut herkkyyttä apoptoosia ekspressiota sääteleviä kaspaasi-9 [17]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että alas-säätely AP-4 inhiboivat ihmisen mahasyövän soluissa in vitro. Leviämisen estäminen suhde AP-4 erityinen siRNA oli merkittävästi alhaisempi kuin transfektoitujen solujen ohjaus siRNA tai mock ryhmä.

Kemoterapia on yksi tärkeä strategia hoidossa mahasyövän, mutta se ei usein takia kestävyys syöpälääkkeiden. Kerrottiin, että AP-4 positiivista ilmentymistä mahdollisesti liittyvät kemiallis-herkkyys [40]. Me tutkimme seuraavaksi roolia AP-4 säätelyssä kemiallis-herkkyys ihmisen mahalaukun syöpäsoluja ja totesi, että esto AP-4 voitaisiin parantaa huomattavasti herkkyyttä näiden solujen ADR, 5-FU tai cis-plantinum hoito, mikä viittaa että inhibitio AP-4 voi olla edullinen vaikutus chemo-herkkyyden.

lisäksi, hiljentämisen AP-4, indusoi solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheet, analyysi mahdollisen mekanismit vaikutukset AP-4 hiljentäminen inhibitioon ihmisen mahasyövän soluproliferaatiota leimasi ilmentyminen solusyklin liittyvien sääntelyviranomaisten. Huomasimme, että alas-säätely AP-4 lauseke esti ilmaus sykliini D1, mutta sääteli ilmentymistä p53 ja p21. p53 ja p21 on oletettu olevan negatiivinen säätelijä solusyklin ja lisääntymistä [46], [47], ja toisaalta, sykliini D1 edistänyt etenemisensä G _{1-S-vaiheen solusyklin [48 ]. Alassäädetty ilmentyminen AP-4, p21 ja p53 tällä välin voisi tehdä solukierron pysähtymisen aiheuttamia knockdovvn AP-4 katoaminen. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä mallin kanssa, jossa AP-4 indusoi solukierron pysähtymisen säätelemällä ilmaus solusyklin sääntelyviranomaisten, kuten p53, p21 ja sykliini D1.}

Apoptoosi tai ohjelmoitu solukuolema, on tiedossa osallistua erilaisiin biologisiin prosesseihin pääasiassa kaksi apoptoottisia reittejä, mitokondrio (luontainen) reitti ja kuoleman reseptori (ulkoista) reitin [49]. Huomasimme, että hiljentäminen AP-4 ilmaisun trigged apoptoosia meidän kokeessa, joka osoitti, että AP-4 tukahdutetaan apoptoosin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja.

Meidän kokeessa yltyviin kaspaasi-9 ja alassäätöä Bcl-2 ja Bcl-x _{L havaittiin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja, mikä osoittaa, että pudotus AP-4 aktivoitu sekä ulkoisen ja sisäisen polkuja apoptoosin syöpäsoluissa. [49], [50]}

Yhteenvetona tulokset osoittavat, että RNAi-välitteinen säätely alaspäin transkriptiotekijän AP-4 esti tehokkaasti solujen lisääntymistä, osoitti solusyklin pysähtymisen, laukeaa apoptoosin ja parannettu Chemo-herkkyys ihmisen mahalaukun syövän solujen vähentynyttä ilmentymistä sykliini D1, Bcl-2 ja Bcl-x _{L ja aktivoida p21, p53 ja kaspaasi-9-ekspressio, mikä ehdotti, AP-4 voi olla onkogeeni on tärkeä rooli tuumorigeneesissä . Vaikka tarkkaa mekanismia tämä rooli on vielä tutkittava, AP-4specific-siRNA: t voivat olla mahdollisia arvoja uusia terapeuttisia aineita ihmisen mahasyövän.}

Materiaalit ja menetelmät

Solun viiva ja soluviljelmissä

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat AGS villityypin p53, SGC7901 kanssa mutantti p53 (saatu Wuhan University) ja Kato-III p53 genomin deleetio (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) viljeltiin DMEM tai RPMI1640-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO _2.

Erityiset siRNA ja transfektio

cDNA-sekvenssi AP-4-geenin saatiin Genbank ( NM_003223) ja kohdennussekvenssiä kahden 21-nukleotidin eri siRNA: t suunniteltiin ja kemiallisesti syntetisoidut (Qiagen Saksa). Nukleotidisekvenssit olivat seuraavat: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sense), ja 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisense). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sense), ja 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisense). Allstars negatiivinen kontrolli siRNA (Qiagen Saksa) käytettiin salattu siRNA ohjaus. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja siRNA: t transfektoitiin viljelysoluja Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNAiso Plus (Takara, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. CDNA: kokonais-RNA syntetisoitiin käyttäen PrimeScript® RT reagenssia Kit (Takara, Japani). MRNA ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapore) Fast SYBR Green PCR reagenssit. GAPDH levitettiin sisäisen valvonnan. Pitoisuuksien reagenssien säädettiin päästä lopulliseen tilavuuteen 20 ui, joka sisälsi 2 ui käänteiskopioitiin tuote, 10 ui Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja 0,5 ui 10 uM eteenpäin ja reverse-alukkeita. Reaktio suoritettiin 45 monistussykliä 95 ° C: ssa 3 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Seuraavat alukkeet suunniteltiin (Table.1). PCR-alukkeet suunniteltiin Primer 5,0 ja Blast haku tarkistaa spesifisyys. Alukesekvenssit käytetään on lueteltu taulukoissa 1. Tulokset laskettiin käyttäen 2 ^{-ΔΔCt menetelmällä.}

Western blot

Proteiini uutettiin proteiini Extraction Kit (Beyotime, Kiina) mukaan suuntaan. Proteiini laimennettiin 3 ug /ul, ja erotettiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, USA), ja sitten blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta TBST: ssa 1 tunti huoneen lämpötilassa. Immunoblottaus suoritettiin käyttäen anti-AP-4-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich, Shanghai, laimennus 1:1000), anti-p21-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich, Shanghai, laimennus 1:1000), anti-p53-vasta-ainetta (Abcam, UK, laimennus 1:500) ja anti-sykliini D1-vasta-ainetta (Abcam, Iso-Britannia, laimennus 1:500) yön yli 4 ° C: ssa. Kun kolme kertaa huuhdeltiin TBST: llä, kaivoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineiden (laimennus 1:2000, Boster, Kiina) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tulos visualisoitiin ECL Plus Western blotting havaitsemisjärjestelmä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Anti-β-aktiini (laimennus 1:1000, Boster, Kiina) vasta-aine toimi sisäisen valvonnan.

Measurement soluproliferaation

Vaikutus hiljentäminen AP-4 sekä mahasyövän solujen lisääntymistä 48 tunnin jälkeen transfektion mitattiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Kiina), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, mahasyöpä soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä ja transfektoitiin 20 nM ohjaus siRNA, AP-4 erityisiä siRNA: t. 48 tunnin jälkeen, 10 ui CCK-8-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, 1 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, absorbanssi mitataan 450 nm: ssä. Suhteellisia tasoja solujen lisääntyminen kussakin ryhmässä soluja laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: R = (A2-A1) /A2 x 100%, ja P = A1 /A2 x 100%, jossa R oli suhteellisen estävä määrä ja P oli suhteellisen leviämisen suhde solujen kasvua; A1was tarkoittaa absorbanssin arvo transfektoitujen solujen; ja A2 oli keskimääräinen absorbanssin arvo transfektoimattomilla kontrollisolujen ilman lääkehoitoa. Kaikki kokeet tehtiin 5 syvennystä per koe ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Cell cycle määritys

Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja kiinnitettiin 70% jääkylmää etanolia yhdessä yössä, pestään 1 x PBS: llä ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) (50 ug /ml) 1 x PBS: ssä, jota oli täydennetty RNaasi (50 ug /ml) 30 minuuttia. Testit tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle, ja analyysit suoritettiin virtaussytometrillä (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) noudattaen valmistajan ohjeita.

Chemo-Herkkyystestiä in vitro

kuten aiemmin on kuvattu, CCK-8-määritystä käytettiin arvioimaan vaikutusta kemiallis-herkkyys mahalaukun syövän solujen syöpälääkkeiden. Lyhyesti, kuusi tuntia transfektion jälkeen elatusaine poistettiin ja korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi vaihtelevia pitoisuuksia anti-kasvain huumeiden (ADR, 5-FU tai cis-platina) ja inkuboitiin 48 tuntia. Suhteellisen estävä määrä solujen kasvua laskettiin kaavan mukaan edellä mainitut.

Apoptoosi määrityksessä anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) värjäämällä

arvioimiseksi määrä solun apoptoosin, apoptoosia kvantifioitiin anneksiini-V-FITC ja propidiumjodidilla kaksinkertainen värjäys käyttämällä anneksiini-V /FITC kit (Antgene, Kiina). Solut kerättiin mukaisesti valmistajan ohjeiden 48 tuntia transfektion jälkeen, pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin sitoutumispuskuriin, ja sitten soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan pimeässä 4 ° C: anneksiini V-FITC: llä ja PI fosfaattipuskurissa ja analysoitiin virtaussytometrillä (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) 1 tunnin kuluessa värjäyksen jälkeen.

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot on esitetty keskiarvona ± SD. Ero ryhmien välillä analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA ja Student-Newman-Keuls (SNK) -q testi käyttäen SPSS 12.0 for Windows-ohjelmiston. Tilastollinen merkittävyys määritettiin * p < 0,05 ** p < 0,01.

Kiitokset

Kiitämme Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Hang ja Li Wei niiden asiantuntijoiden teknistä tukea .

• PLoS ONE: pitkän aikavälin tuloksia ja ennustavat tekijät mahasyövän Potilaat, joilla on mikroskooppinen Peritoneaalisille Carcinomatosis
• PLoS ONE: Risk Assessment mahasyövän aiheuttaman Helicobacter pylori käyttäminen CagA Sequence Markers