Plos ONE: Dol-Ureditev AP-4 zavira proliferacijo, povzroča Cell Cycle prijetje in spodbuja apoptozo v humani Rak želodca Cells

Povzetek

Ozadje

AP-4 spada k osnovni vijačnice -loop-vijačnice levcin-zadrgo podskupinami; nadzoruje ciljno izražanje genov, uravnava rast, razvoj in apoptozo celic in je bil vpleten v tumorigeneze. Naši prejšnje študije so pokazali, da je AP-4 pogosto izraženi pri želodčnih raka in je lahko povezana s slabo prognozo. Namen te študije je preveriti, ali utišanje AP-4 lahko spremenijo biološke značilnosti želodca rakavih celic.

Metode

Dve posebni siRNAs ciljanje AP-4 so bili zasnovani, sintetizirali in transfektirali v želodcu raka celičnih linijah in človeških normalnih sluznici celic. AP-4 izraz je bila izmerjena v realnem času kvantitativno PCR in Western blot. Cell orožja in kemoterapijo občutljivost so odkrile CCK-8 testom. Test Celični ciklus in apoptoza test smo izvedli s pretočnim citometrom in relativni izraz regulatorjev celičnega ciklusa so odkrile realnem času kvantitativni PCR in Western blot, je bilo pregledano izraz dejavnikov, vključenih v apoptozo poti v mRNA in raven beljakovin.

Rezultati

izraz AP-4 so utihnile, ki ga siRNAs transfekciji in učinki AP-4 rasklapanje je trajal 24 do 96 ur. The-siRNA posredovano utišanje AP-4 zavre celično proliferacijo, inducirano apoptozo in preobčutljivih rakave celice proti raku drog. Poleg tega smo nivo izražanja p21, p53 in kaspaza-9, ko je rasklapanje AP-4 povečala, vendar izražanje ciklina D1, Bcl-2 in Bcl-x _{L bil inhibiran. To ni povzročil aretacijo celičnega ciklusa, ko je bila AP-4 rasklapanje v p53 napaka želodčni rak celične linije Kato-III.}

Sklepi

Ti rezultati učinkovito ponazarja, da je gensko utišanje AP-4 lahko proliferacijo zaviral celica sprožil apoptoza in senzibiliziranih rakave celice proti raku drog in vitro, kar kaže, da ima AP-4 siRNAs posredovana utišanje potencialno vrednost pri zdravljenju raka človeškega želodčnega

Navedba. Liu X, Zhang B Guo Y, Liang Q Wu C Wu L, et al. (2012) Dol-Ureditev AP-4 zavira proliferacijo, povzroča Cell Cycle prijetje in spodbuja apoptozo v Human želodca rakavih celic. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096

Urednik: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Združene države Amerike

Prejeto: 4. junij, 2011; Sprejeto: 18. april 2012; Objavljeno: 16. maj 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Čeprav se je stopnja pojavnosti in umrljivosti, povezane z rakom želodca postopoma zmanjšal v zadnjih letih na večini področij na svetu [1], [2], želodčni rak ostaja v svetu breme za zdravje, in je še vedno najpogostejši vzrok smrti zaradi raka, povezanih z malo izboljšanje dolgoročno preživetje. Najbolj učinkovita zdravljenje raka želodca je popolnoma kirurška odstranitev neoplastične tkiva z D2 limfadenektomijo. Poleg tega so adjuvantno kemoterapijo in radioterapijo pomaga izboljšati prognozo. Celo tako, 5-letno preživetje preostala zelo slaba [1], [3]. Več kot milijon novih primerov je bilo vsako leto diagnosticirajo, predvsem v vzhodni Aziji, kot so Japonska, Koreja in Kitajska. V teh državah, želodčni rak ostaja najpogostejši vzrok smrti zaradi raka povezanih in natančna patogeneza ostaja neznana [3].

Transcription dejavniki so pomembne regulativne komponente [4]. Bi pripadali družini helix-loop-helix in igral pomembno vlogo v celično proliferacijo in diferenciacijo, določanje celic rodu, izražanja znotrajcelične genetskih informacij, in drugih osnovnih procesov [5]. Kot član osnovno helix-loop-helix levcin-zadrgo (bHLH-LZ) podskupini bHLH proteinov [6], ki aktivira ojačevalec vezavnega proteina 4 (AP-4) je bila prvotno opredeljena kot celični protein, ki veže na opičjega virusa 40 (SV40) ojačevalec in aktivirali virusno pozno gensko transkripcijo [7]. AP-4 je povsod izražen transkripcijski faktor in lahko nadzoruje transkripcijske mrež med celične diferenciacije s tvorbo homodimers in vezave na sekvenco simetrično DNA, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 je ligand za imunoglobulin-kapa promotorja E-box elementov, ki se lahko vpleten za imunske bolezni [13], [14]. Poleg tega, za razliko od drugih hLH proteinov, AP-4 vsebuje dve dodatni protein dimerizacijo motivi so sestavljeni iz levcina ponovite elementov LR1 in LR2. Zato AP-4 predstavlja posebno tristransko dimerizacijo strukturo, kar kaže, da se AP-4 interakcijo z različnih dejavnikov prepisu [8], [14]. AP-4 uravnava izražanje nekaterih genov [9], [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21]. Na primer, da aktivira transkripcijo hMTIIA gena in sodeluje pri urejanju proenkephalin izražanja človeškega [22], in da lahko igrajo vlogo pri izražanju trebušne eksokrini genske družine [23]. Pred kratkim so poročali prevelike količine AP-4, raka debelega črevesa in raka, raka dojk in prostate [9], [18], [24].

RNA interference (RNAi) je postopek sekvence določeno delovno mesto -transcriptional gen za dušenje zvoka z dvojnim RNA [25] začela kar lahko privede do utišanje specifično celično gena in zagotavljajo močan povratne genetike pristop za analizo genskih funkcij tako in vitro in in vivo [26]. Trenutno najbolj razširjeni nukleinske temelji na kisline zaporedja specifičnih genskih utišanje molekule so bile majhne moteče RNA [27], poimenovani siRNAs, ki je sestavljen iz simetričnih dupleksov za 19-21 baznih parov [28]. Metoda siRNA lahko zavira ciljno izražanje genov s specifičnostjo, učinkovitosti in vzdržljivosti [29].

smo poročali že prej, da je bil AP-4 izraženi pri raku želodca in da se je lahko povezan s slabo prognozo [30]. V tej raziskavi smo podrobneje proučiti funkcijo AP-4 v človeške želodčne celice raka z RNA interference.

Rezultati

Posebni siRNA ciljanje izraz AP-4 v človekovih želodčne rakavih celic in človeškega normalne sluznice celice

Da bi ocenila učinek-siRNA posredovana tišini genske ekspresije AP-4, nadzor siRNA in AP-4 posebne siRNAs transfektirali v celice 24 h, 48 h, 72 h in 96 h. Učinkovitost v navzdol regulacijo izražanja AP-4 gena bila odkrita v realnem času kvantitativno PCR in zahodni blot. Kot je prikazano na sliki 1, se lahko AP-4 specifične siRNAs učinkovito inhibira genov transkripcijo in translacijo. Nivoji mRNA in proteinske AP-4 smo zmanjšali z AP-4 siRNA transfekciji skupine, ne pa tudi pri nadzoru siRNA (slika 1). SiRNAs inducirane zatiranje AP-4 izražanja bilo mogoče odkriti v 24 urah po transfekciji. Vendar pa je razmerje inhibicije zmanjšal 72 ur po transfekciji. Najbolj učinkovita časovna točka je bila od 48 h do 72 h, v wrap izražanju AP-4. Relativne ravni mRNA transkriptov v siRNA-1 skupine močno zmanjšala za skoraj 90% in 95% v siRNA-2 skupini. Ni bilo statistično značilnih razlik med siRNAs skupino in kontrolno skupino.

Dol-ureditev AP-4 izražanja inhibira proliferacijo celic in občutljivi na človeške želodčne rakave celice proti raku drog

Da bi preučili vpliv AP-4 posebne siRNAs na celično proliferacijo in kemo-občutljivost rakavih celic, 20 nm AP-4 posebne siRNAs ali nadzora siRNA transfektirali in proliferacije celic je bila določena z CCK-8 test 48 ur po transfekciji. Ugotovili smo, da lahko razgradljiv AP-4 inhibira proliferacijo želodčni rak celičnih linij SGC7901 in AGS (slika 2), vendar ne v normalnem sluznica celične linije ges-1 v primerjavi s kontrolnim siRNA transfekciji v 48 urah (slika 2). Ti rezultati so pokazali, da AP-4 siRNAs oslabljene celične proliferacije želodčnih rakavih celic in vitro. Poleg tega smo raziskovali vlogo AP-4 pri urejanju kemo-občutljivosti človeških želodca rakavih celic. Smo primerjali občutljivost drog AP-4 siRNAs z da kontrolnega siRNA ali modelnih celic in ugotovila, da so bile relativne stopnje inhibicije AP-4 posebne siRNAs bistveno višja kot pri kontrolni siRNA ali modelnih celic (p < 0,0001) (slika 2 ). Poleg tega AP-4 siRNAs bistveno izboljšano občutljivost celic ADR, 5-FU ali zdravljenje cis-plantinum na dveh različno odmerkih (slika 2), to je predlagal, da imajo navzdol ureditev lahko AP-4 ugoden učinek v občutljivost kemoterapijo.

dušenje zvoka v AP-4 izraz povzroča ustavitev celičnega cikla in moduliramo izražanje p53, p21 in ciklin D1

učinek AP-4 o napredovanju celičnega ciklusa je bila raziskana . Človeške želodčne rakave celice smo transfektirali z 20 nM kontrolno siRNA ter AP-4 specifične siRNAs za 48 ur, v tem zaporedju, ki mu sledi propidijevim jodidom barvanjem in pretočna citometrija analize celičnega cikla. Medtem ko se celice transficirane s kontrolnimi siRNA napredovala skozi različne faze celičnega cikla, celic transfekciji z AP-4 posebne siRNAs prikaže bistveno večjo pogostnost celic v fazi G0 /G1 (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) in spodnji pogostnost celic v s-fazi (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Odstotek celic pri G0 /G1 fazi v celici transfektirana z AP-4 siRNAs bila bistveno višja od demonstracijskimi celic (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p 0.05) ali nadzora siRNA (SGC7901 /nadzor siRNA: 52,18%; AGS /kontrola siRNA: 50,38%) (slika 3). Zato transfekciji z AP-4-specifičnih siRNAs povzroča celično ciklin aretacije na G0 /G1 fazi.

AP-4 posebne siRNAs povzroča blok celični cikel je nadalje raziskovali z opazovanjem učinkov zdravljenja AP-4 posebne siRNAs o relativni izražanje regulatorjev celičnega cikla: tumorski supresor p53, ciklin odvisne kinaze p21 je, in G (1) -phase specifične ciklin D1, ki so bili kritični regulatorji celičnega cikla in proliferacijo. Oseminštirideset ur po transfekciji smo človeške želodčne rakave celice zbrali za PCR v realnem času in analizo imuno. Transfekciji z AP-4 posebne siRNAs lahko up-regulira izražanje p53 in p21 beljakovin. Modulatory učinek AP-4 siRNAs je večja od kontrolnega siRNA (slika 4) (p < 0,01). Kot je bilo pričakovati, ciklina D1 je navzdol regulirano v primerjavi s kontrolno skupino siRNA in modelno skupino (slika 4) (p < 0,01). Ti podatki dodatno podpirajo hipotezo, da utišati izražanje AP-4 spremeni izražanje drugih celic kolesarskih regulatorji, povzroča celični cikel prijetje in inhibira proliferacijo človeških želodčnih rakavih celic

Odkrivanje apoptoze in dejavnikov, vključenih v apoptozo pot

Za določitev vpliva AP-4 posebne siRNAs na apoptozo v človeških želodca rakavih celic, so aneksin-v in PI barvanje teste uporablja v povezavi s pretočno citometrijo. Celice smo obarvali z aneksin-FITC /PI in odvisnih v spodnjem desnem kotu (LR) in Zgornja desno (UR) kvadrantih. Celice v LR in UR naj bi bile v začetku apoptotske (aneksin ^{+ /PI -) in pozno apoptotske (aneksin + /PI +) oz. Celice v LL (spodaj levo) in UL (zgornji levi) kvadrantih so menili, da je živ in nekrotične oz. Obseg apoptoze je bila izražena kot seštevek odstotki v LR in UR kvadrante. Apoptoze mere so bile podane v sliki 5. obdelanih celic z AP-4 siRNAs pokazala več apoptotske celice (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) kot negativna (SGC7901 /kontrolnega siRNA je: 5,5%; AGS /kontrola siRNA: 6,7%) (p 0.05) in prazno (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p 0.05) . Ti rezultati so pokazali, da so AP-4 specifične siRNAs lahko povzroči apoptozo v teh celicah.}

Poleg tega smo opisali izražanje faktorjev, vključenih v apoptozo poti s PCR v realnem času na stopnji mRNA, kot Bcl-2 Bcl-x _{L, kaspazne-9, kaspazne-8 in Bax. Je pokazala, da lahko razgradljiv AP-4 navzgor regulira ekspresijo Baspase-9 v človeške želodčne rakavih celicah, in modulatory učinek AP-4 siRNAs je večja od kontrolnega siRNA (slika 6) (p < 0,01). Izražanje Bcl-2 in Bcl-x L so bile v primerjavi s kontrolno siRNA ali modelno skupino (slika 6) (0,01 p <) so se zmanjšale. Ti podatki dodatno podpirajo, da je utišanje AP-4 izražanja je privedla do apoptoze v človeških želodca rakavih celic. Vendar pa je bila izraz kaspaze-8 in Bax razlikujejo v različnih celičnih linij po transfekciji. Štirideset osem ur po transfekciji kaspazne-8 in Bax bilo več izražanja v AGS celicah. V SGC7901 celicah, izraz Bax povečala, vendar izražanje kaspaze-8 povečala le v siRNA-1 skupini. V siRNA-2 skupini, kaspazne-8 izraz ni bila pomembna prizadeta (slika 6).}

AP-4 za dušenje zvoka lahko uravnavajo celično cikla in apoptozo celic tako p53 odvisni in neodvisni-manir

da bi preverili, ali je bil up-regulacija p53 v AP-4 rasklapanje želodčnih rakavih celic kritični vlogi ustavitev celičnega cikla, celic Kato-III, neke vrste p53 napak želodčnega raka celične linije je bila uporabljena za oceno odvisnosti AP -4 rasklapanje učinek na p53. Ugotovili smo, da rasklapanje AP-4 v AGS z divjim tipom p53 ali SGC7901 z mutiranim p53, lahko pride do prijetja celičnega ciklusa, vendar je ta pojav ni bilo opaziti v celicah Kato-III (slika 7), odstotek celic v G0 /G1 faze je bilo 57.82% (siRNA-1) 59,05% (siRNA-2), 59.59% (kontrola siRNA) in 59,06% (mock). Tisti, ki so pokazali, da rasklapanje AP-4 mogoče urediti celic ciklus s p53-p21 poti. Apoptoza populacija je bila odkrita tudi v celicah Kato-III z aneksin V-FITC in PI barvanjem. Rezultati so pokazali, da je stopnja apoptoza celic Kato-III transfekciji s AP-4 siRNAs (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) je bila višja od nadzora siRNA (3,3%) (p 0.05) in modelno celic (3,5%) (p < 0,05), vendar v manjši meri, kot je to storila na AGS (p < 0,05) in SGC7901 celic (p < 0,05), kar kaže, da utišanje AP-4 lahko povzroči apoptozo v želodcu rakavih celic skozi tako p53 odvisni in neodvisni-manire.

Pogovor

izražanje genov je temeljna in zelo ohranjena proces. Transkripcije, je prvi korak v izražanju genov, ki se izvede s strukturno ohranjali DNA odvisne RNA polimerazo, kar ima za posledico sintezo molekule RNA iz predloge DNA [31]. Transkripcijski faktorji, obliko prepis začetek kompleks z RNA polymeras II, sodelujejo v procesu prepisu začetku, da regulira gensko ekspresijo. Lahko igrajo pomembno vlogo pri preoblikovanju, tumorigeneze, napredovanja tumorja in metastaz z regulacijo transkripcije in s tem izražanje genov [32] [33] [34]. Transkripcijski faktor AP-4, ki spada v hitro rastoče skupine proteinov HLH [8], ki je vključena v diferenciacijo in celično proliferacijo [35] [36] [37] [38] [39], vpliva na dogodke, celica cikla in apoptoza, regulira in nadzoruje nekaj izražanje genov [9], [10], [15] [16], [17] [18] [19], [20], [21]. Nedavno je bilo poročali, da je bil AP-4 navzgor regulirano v karcinom kolona, ​​raka dojk in raka prostate [9], [18], [24]. Poleg tega AP-4 pozitiven izraz kaže na slabo prognozo s pomenom nad razred, status vozlišča ali velikosti v ER + rakom dojk, in morebitne povezave z kemo-občutljivost [40]. V naši prej študijah smo ugotovili, da je bila ekspresija AP-4 prekomerno in je povezana s sočasno s slabo prognozo [30]. To je lahko molekularni marker za diagnosticiranje in prognozo raka želodca. V tej študiji ,. Smo oblikovali dva AP-4 specifične siRNAs da inhibira ekspresijo AP-4 gena v človeške želodčne rakavih celic. Bili so dobro uveljavljena in transfektirali v celice, da pride do knock-down od AP-4 genske ekspresije. Ugotovili smo, da je bilo najmočnejše časovni točki pri zatiranju ekspresije AP-4 v želodčnih rakavih celic 48 ur in 72 ur po transfekciji. Tako smo se odločili, nekdanji še naprej izvajati s tem povezane pregled.

Pred tem se je pokazalo, da je transkripcijski faktor AP-4, za razliko od drugih hLH proteinov, vsebuje dve različni levcin ponavljajočih se elementov, ki tudi neposredno dimerizacijo in omogočajo selektivno zapletena tvorba povsod AP-4 beljakovin [8] [41].

AP-4 lahko igrajo pomembno vlogo pri modulaciji celičnih funkcij preko regulacije genov, ki sodelujejo pri virusnem proizvodnje [7], [16, ], [22], [42], [43], celično rast in preživetje [9], [17], [23], [44], imunski odziv [14], [41], [45] in angiogeneza [21]. Peter Jung, et al ugotovila, da bi lahko AP-4 kodiranje c-myc-inducibilne represorju da zavira p21 izražanje [9], in verjetno igral pomembno vlogo pri posredovanju proliferativni aktivnost c-myc [10]. Poleg tega AP-4 vplivala na občutljivost na apoptozo z regulacijo ekspresije kaspaza-9 [17]. V tej študiji smo ugotovili, da navzdol ureditev AP-4 inhibira proliferacijo človeških želodčnih rakavih celic in vitro. razmerje inhibicija širjenje AP-4 posebne siRNAs je bila bistveno nižja od celic, transfektiranih s kontrolno siRNA ali navidezno skupino.

Kemoterapija je ena pomembna strategija pri zdravljenju raka želodca, vendar pogosto ne zaradi odpornosti na zdravila proti raku. Navedeno je bilo, da je AP-4 pozitiven izraz morda povezani s kemo-občutljivost [40]. Bomo naslednjič raziskovali vlogo AP-4 pri urejanju kemo-občutljivosti človeškega raka želodca celice in ugotovil, da je zaviranje AP-4 bi lahko znatno povečalo občutljivost teh celic ADR, 5-FU ali zdravljenje cis-plantinum, kar kaže, da zaviranje AP-4 ima lahko pozitivno vpliva na kemo-občutljivosti.

Poleg tega, utišanje AP-4, povzroča zastoj celičnega ciklusa po G0 /G1 faze, analiza možnih mehanizmov, povezanih z učinki AP-4 dušenje zvoka na inhibicijo proliferacije človeške želodčne rakavih celic bilo značilno izražanje celičnih regulatorjev, povezanih cikla. Ugotovili smo, da navzdol regulacijo AP-4 izražanja inhibira izražanje ciklina D1, vendar navzgor regulirano ekspresijo p53 in p21. p53 in p21 je hipotezo, da je negativna regulator cikla celic in proliferacijo [46], [47], na drugi strani, ciklin D1 spodbuja napredovanje skozi G _{1-S fazi celičnega cikla [48 ]. Navzdol regulirano ekspresijo AP-4, p21 in p53 v tem času lahko omogoči aretacijo mobilni cikla povzročila rasklapanje za AP-4 izginotje. Ti rezultati so v dogovoru z modelom, v katerem AP-4 inducira aretaciji celičnega ciklusa, ki ga ureja izražanje regulatorjev celičnega ciklusa, kot p53, p21 in ciklin D1.}

Apoptoza ali programirana celična smrt, je znana da sodelujejo v različnih bioloških procesih dva glavna apoptotskih poti, mitohondrijske (notranje) poti in smrtne receptor (zunajbesedilno) poti, v [49]. Ugotovili smo, da utišanje izražanja AP-4 sprožil apoptozo celic v našem poskusu, ki je pokazala, da AP-4 zatreti apoptozo v človeške želodčne rakavih celic.

V našem poskusu, da poviša raven kaspaze-9 in dol regulacija od Bcl-2 in Bcl-x _{L bili odkriti v človeške želodčne rakavih celic, kar kaže, da rasklapanje za AP-4 aktiviranih tako notranjo in zunanjo poti do apoptozo rakavih celic. [49] [50]}

Če povzamemo, podatki kažejo, da RNAi posredovano down-regulaciji transkripcije faktor AP-4 učinkovito inhibira proliferacijo celic, navedeno aretacijo celičnega ciklusa, sproži apoptozo in okrepljeno kemoterapijo občutljivost človeških želodčnih rakavih celic z zmanjšano ekspresijo ciklin D1, Bcl-2 in Bcl-x _{L in aktivira p21, p53 in kaspazne-9 izražanja, ki nakazujejo AP-4 lahko onkogena igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze . Čeprav je treba natančen mehanizem te vloge, ki jih je treba dodatno raziskati, lahko AP-4specific-siRNAs biti možnih vrednosti, kot novih terapevtskih sredstev za rakom človeške želodčne.}

Materiali in metode

Cell vrstica in celične kulture

človekove želodca rakave celične linije AGS z divjim sevom p53, SGC7901 z mutiranim p53 (pridobljenih iz Wuhan University) in Kato-III z p53 genoma izbrisom (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) smo gojili v DMEM medij ali RPMI1640 medij (Invitrogen), ki vsebuje z 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen), penicilin (100 U /ml) in streptomicin (100 ug /ml). Celice smo vzdrževali pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO _2.

Posebno siRNA in transfekciji

cDNA sekvenca gena AP-4 je bil pridobljen iz GenBank ( NM_003223) in ciljajo zaporedja dveh 21-nukleotidnih različnih siRNAs so bili zasnovani in kemično sintetizirane (Qiagen Nemčija). Nukleotidna zaporedja so bili naslednji: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(smisel), in 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisense). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(smisel), in 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisense). Allstars negativna kontrola siRNA (Qiagen Nemčija), so bili uporabljeni kot umešana nadzor siRNA. Celice smo nanesli v 6 vdolbinami in siRNAs smo transfektirali v celicah kulture z Lipofectamine 2000 (Invitrogen) po navodilih proizvajalca.

realnem času kvantitativne PCR

Skupna ekstrakcijo RNA smo izvedli uporabo RNAiso Plus (Takara, Japonska) v skladu s protokolom proizvajalca. CDNA iz celotne RNA smo sintetizirali s pomočjo PrimeScript® RT reagenta Kit (Takara, Japonska). Izraz mRNA je bila ocenjena s PCR v realnem času za ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapur) z Fast SYBR Green PCR reagentov. GAPDH bila uporabljena kot notranji nadzor. Koncentracije reagenti so bili prilagojeni, da bi dosegli končni volumen 20 ul, ki vsebuje 2 ul povratne-prepisal izdelek, 10 ml za hitro SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster mesta, CA), in 0,5 xl 10 iM naprej in nazaj začetnih oligonukleotidov. Reakcijo smo izvedli s 45 pomnoževalnih ciklov 95 ° C za 3 s in 60 ° C za 30 sekund. Naslednji primerji so bili zasnovani (Table.1). PCR je oblikoval Primer 5.0 in iskanju Blast preveriti posebnosti. Primer zaporedja, so navedeni v tabelah 1. Rezultati so izračunani s pomočjo 2 ^{-ΔΔCt način.}

Western blot

Protein smo ekstrahirali z ekstrakcijo protein kit (Beyotime, Kitajska), v skladu na smer. Protein smo razredčili do 3 ug /ul in ločimo z 10% SDS-PAGE, prenese na poliviniliden difluorida (PVDF) membrane (Millipore, ZDA), nato pa je bil blokiran v 5% nemastnega mleka v prahu v TBST 1 uro pri sobni temperaturi. Imunoblot je bila izvedena s pomočjo anti-AP-4 protitelesa (Sigma-Aldrich, Shanghai, redčenje 1:1000), anti-p21 protitelesa (Sigma-Aldrich, Shanghai, redčenje 1:1000), anti-p53 protitelesa (Abcam, UK, redčenje 1:500) in anti-ciklin D1 protitelesa (Abcam, UK, redčenje 1:500) čez noč pri 4 ° C. Po trikrat spere s TBST smo membrano inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnih protiteles (razredčenju 1:2000, Boster, Kitajska) 1 uro pri sobni temperaturi. Rezultat smo vizualizirali s sistemom za zaznavanje blotting ECL Plus Western skladu z navodili proizvajalca. Anti-β-aktin (redčenje 1:1000, Boster, Kitajska) protitelesa delovala kot notranji nadzor.

Merjenje celične proliferacije

Vpliv utišanje AP-4 o širjenju želodčnega raka celic po tem, ko je bil 48 ur transfekciji merjena s Cell štetja Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, sta želodčni rakave celice kultiviramo pri 96 vdolbinami in transfektirali z 20 nM kontrolnega siRNA, AP-4 specifičnih siRNAs. Po 48 urah je bil 10 ul s CCK-8 reagenta dodamo v vsako vdolbino, po 1 uri inkubacije pri 37 ° C, absorbanca pa se meri pri 450 nm. Relativne stopnje proliferacije celic iz vsake skupine celic smo izračunali po naslednji formuli: R = (A2-A1) /A2 × 100% in P = A1 /A2 × 100%, v katerem je R relativno zaviralni hitrost in P je relativno razmerje proliferacijo celične rasti; A1was srednja vrednost absorbance transfekciji celic; in A2 je bila srednja vrednost absorbance netransficirane kontrolnih celic brez zdravljenja odvisnosti od drog. Vsi poskusi so se končali s 5 vrtin na poskus in ponovi vsaj trikrat.

Celični ciklus Vsebnost

Celice smo zbrali 48 ur po transfekciji in je določeno v 70% ledeno mrzlo etanola čez noč, opran z 1 x PBS in obarvali s propidijevim jodidom (PI) (50 mg /ml) v 1 x PBS dopolni z RNaze (50 mg /ml) 30 minut. Testi so bili izvedeni v treh izvodih za vsak vzorec, in analize so bile v skladu s smernicami proizvajalca izvaja pretočnim citometrom (FACS CantoII, BD biološke znanosti, ZDA).

Test Chemo-občutljivosti in vitro

kot smo že prej opisali, je CCK-8 test uporabili za oceno učinka kemo-občutljivosti želodčnega raka celic proti raku drog. Na kratko, šest ur po transfekciji smo medij odstranili in nadomestili z sveži medij, ki vsebuje različne koncentracije protitumorsko zdravilo (ADR, 5-FU ali cis-platina) ter inkubiramo 48 ur. Relativno zaviralni stopnja rasti celic smo izračunali po formuli zgoraj naštetih.

Apoptoza test, ki ga aneksin V-FITC in propidijevim jodidom (PI) obarvanje

Za oceno stopnje celične apoptoze, apoptoza je količinsko s aneksin-V-FITC in propidijevim jodidom dvojno barvanjem z uporabo aneksin-V /FITC komplet (Antgene, Kitajska). Celice zberemo v skladu z navodili proizvajalca 48 ur po transfekciji, speremo z mrzlo PBS in suspendiramo v vezavnem pufru in nato smo celice inkubirali 30 minut v temi pri 4 ° C z aneksinom V-FITC in PI v fosfatnem pufru in analizirati na pretočnim citometrom (FACS CantoII, BD biološke znanosti, ZDA) v 1 uri po barvanjem.

Statistična analiza

Vsi podatki so prikazani kot povprečje ± SD. Razlika med skupinami smo analizirali z enosmerno ANOVA in Student-Newman-Keuls (SNK) Q preskusa z SPSS 12.0 za programsko opremo Windows. Statistična značilnost je bila opredeljena kot * p < 0,05 in ** p <. 0.01

Priznanja

Zahvaljujemo Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Hang in Li Wei za njihovo strokovno tehnično pomoč .

• Plos ONE: Long-Term rezultatov in napovedni dejavniki želodčnega raka bolnikov z mikroskopskimi peritonealno karcinomatozo
• Plos ONE: Ocena tveganja želodčnega raka zamudo je povzročil Helicobacter pylori Uporaba CagA zaporedje Markers