PLOS NËMMEN: Down-Veruerdnung vun AP-4 bremst prolifération, Induces Zell Cycle Arrest a förderen Apoptosis zu Mënscherechter Gastric Cancer BTS

Wat VerfÜgung

Background VerfÜgung

AP-4 gehéiert zu der Basis Wendel-Glück-Wendel leucine-kridd Ënnergrupp; et Kontrollen Zil- Gentherapie Ausdrock, reguléieren Wuesstem, Entwécklung an Zell apoptosis an huet zu tumorigenesis agebonne ginn. Eis virdrun Studien uginn dass AP-4 dacks zu gastric Cancers overexpressed war a vläicht mat der aarmséileg hätt verbonne ginn. Den Zweck vun dëser Etude ass ze iwwerpréifen, ob silencing vun AP-4 biologescher Charakteristiken vun gastric Kriibs Zellen ofzeänneren kann. VerfÜgung

Method VerfÜgung

Zwee spezifesch siRNAs gezielt AP-4 waren entworf, Wierderbuch, an transfected an gastric Kriibs Zell Linnen a mënschlech normal mucosa Zellen. AP-4 Ausdrock war mat real-Zäit grouss Hinnen alleguer a Western blot gemooss. Zell Prolifératioun an Chimio-Empfindlechkeet sech duerch CCK-8 assay fonnt. Zell Zyklus assay an apoptosis assay sech cytometer duerch onkontrolléiert gesuergt, an relativ Ausdrock vun der Reglementatioun Zell Zyklus sech vun real-Zäit grouss Hinnen alleguer a Western blot, Ausdrock vun de Facteuren an der apoptosis Passerelle goufen iwwerpréift an mRNA an FAQ Équipe fonnt.

Resultater VerfÜgung

den Ausdrock vun AP-4 war vun der siRNAs transfection entsat an d'Auswierkunge vun AP-4 knockdown suguer 24 bis 96 Stonnen. D'siRNA-mediated silencing vun AP-4 Trupen dem bewosst Prolifératioun entschlof apoptosis an sensitized Kriibs Zellen Drogen ze anticancer. Ausserdeem huet den Ausdrock Niveau vun p21, p53 an Caspase-9 fräi wann AP-4 war knockdown, mä den Ausdrock vun cyclin D1, BCL-2 an BCL-x _{L inhibited war. Et huet net Zell Zyklus verhaft induce wann AP-4 war an p53 Mängel gastric Kriibs Zell Linn Kato-III knockdown. VerfÜgung}

Konklusiounen VerfÜgung

Des Resultater illustréiert dass Gentherapie silencing vun AP-4 kann effizient inhibited Zell Prolifératioun, ausgeléist apoptosis an sensitized Kriibs Zellen Drogen kënschtlech ze anticancer suggeréiert datt AP-4 siRNAs mediated silencing e Potential Wäert vun der Behandlung vun der Mënschheet gastric Kriibs huet VerfÜgung

Fro:. Liu X, Zhang B, Yinan Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) Down-Veruerdnung vun AP-4 bremst prolifération, Induces Zell Cycle Arrest a förderen Apoptosis zu Mënscherechter Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 7 (5): e37096. Doi: 10.1371 /journal.pone.0037096 VerfÜgung

Redakter: Vladislav V. Glinskii, Universitéit vun Missouri-Columbia, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: Juni 4, 2011; Akzeptéiert: 18. Abrëll 2012; Publizéiert: Mee 16, 2012 VerfÜgung

Copyright: © 2012 Liu et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht gouf vun der National Natural Science Foundation vu China ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Obwuel d'Heefegkeet an veruerteelt Tariffer mat gastric Kriibs verbonne lues an de leschte Joren an de meeschte Beräicher vun der Welt ofgeholl hunn [1], [2], bleift gastric Kriibs eng weltwäit Gesondheet Belaaschtung, a bleift déi gemeinsam Ursaach vum Kriibs Zesummenhang Doudesfäll mat klenge Verbesserung vun langfristeg Iwwerliewensfro. De stäerkste efficace Behandlung vun gastric Kriibs war komplett chirurgesch Entféierung vum neoplastic Otemschwieregkeeten mat D2 lymphadenectomy. Zousätzlech adjuvant Chimiotherapie an radiotherapy hunn assistéiert hätt ze verbesseren. Och also, de 5-Joer Iwwerliewe nach ganz aarm [1], [3]. Méi wéi eng Millioun nei Fäll goufen all Joer, virun allem am Osten an Asien, wéi Japan, Korea, an China diagnostizéiert. An deene Länner, bleift gastric Kriibs déi gemeinsam Ursaach vum Kriibs Zesummenhang Doudesfäll, an der preziser pathogenesis bleift onbekannt [3]. VerfÜgung

Transkriptioun Facteure si wichteg reglementaresche Komponente [4]. Si goung un d'Wendel-Glück-Wendel Famill an hunn eng wichteg Roll an der Zell Prolifératioun an dat, Zell antike Determinatioun, Ausdrock vun intracellular genetesch Informatiounen, an aner essentiel Prozesser [5]. Als Member vun der Basis Wendel-Glück-Wendel leucine-kridd (bHLH-Pacos) Ënnergrupp vun bHLH Proteinen [6], activating enhancer bindend FAQ 4 (AP-4) war am Ufank als bewosst FAQ Kloeren, datt zu der simian Virus gebonnen 40 (SV40) enhancer an ageschalt der Haren spéiden Gentherapie Transkriptiouns [7]. AP-4 ass enger ubiquitously Transkriptiouns Faktor ausgedréckt an transcriptional Netzwierker vun grënnen homodimers an obligatoresch fir d'Ru DNA Haaptrei, CAGCTG [7], während bewosst dat kontrolléieren kann [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 ass enger ligand fir immunoglobulin-Kappa Promoteur E-Këscht Elementer, déi zu immunodeficiency Krankheeten agebonne ginn [13], [14]. Zousätzlech, am Géigesaz zu anere HLH Proteinen, AP-4 enthält zwee zousätzlech FAQ dimerization motifs aus leucine widderhuelen Elementer LR1 an LR2. Dofir, AP-4 Klengegkeeten engem spezifeschen deelhuele dimerization Struktur, suggeréiert datt AP-4 mat enger grousser Villfalt vu Transkriptiouns Facteuren zesummekomm kann [8], [14]. AP-4 reguléieren den Ausdrock vun e puer Genen [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Zum Beispill, activéiert ass d'Reunioun vun hMTIIA Gentherapie an bedeelegt sech un der Regulatioun vun de Mënscherechter proenkephalin Ausdrock [22], an et kënnt eng Roll an der Expressioun vun der pancreatic exocrine Gentherapie Famill [23] spillen. Kuerzem, déi overexpression vun AP-4 war an der colorectal Kriibs, Broscht Kriibs an Aarbecht Kriibs gemellt [9], [18], [24]. VerfÜgung

RNS Amëschen (RNAi) ass e Prozess vun der Haaptrei spezifesch Post -transcriptional Gentherapie silencing vun double-gekëmmert RNS Ausgangspunkt [25], déi zu der silencing vun spezifesch bewosst Gentherapie an déi eng staark ëmgedréint Genetik Approche Gentherapie Funktiounen ze analyséieren souwuel eng kënschtlech an VIVO Féierung kann [26]. Am Moment am meeschten oft benotzt Nukleinsaier-baséiert Haaptrei-spezifesch Gentherapie silencing Molekülle ware kleng interfering RNAs [27], benannt siRNAs, déi vun Ru duplexes vun 19-21 huel Puer besteet [28]. D'siRNA Method konnt Zil- Gentherapie Ausdrock mat Spezifizitéit, Effizienz an Ausdauer [29] inhibit. VerfÜgung

Mir ginn virdrun dass AP-4 war zu gastric Kriibs overexpressed an datt et vläicht mat der aarmséileg hätt [30] verbonne ginn. Am Moment studéieren, iwwerpréift mir weider de AP-4 Funktioun mënschlechen Zell gastric Kriibs mat RNS agemëscht. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Spezifësch siRNA der AP-4 Ausdrock vun mënschlecher gastric Kriibs Zellen a mënschlech gezielt normal mucosa Zellen VerfÜgung

fir den Effet vun der siRNA-mediated Hammers vun der AP-4 Gentherapie Ausdrock, d'Kontroll siRNA an AP-4 spezifesch siRNAs an d'Zellen fir 24 h, 48 h transfected sech zéien, 72 h , an 96 h. D'Efficacitéit an Ugrëff-Regulatioun Ausdrock vun AP-4 Gentherapie war vun real-Zäit grouss Hinnen alleguer a westlech blot fonnt. Als zu Dorënner 1,-AP 4 effektiv der Gentherapie Transkriptiouns an Iwwersetzung inhibit konnt spezifesch siRNAs gewisen. D'mRNA an FAQ Niveau vun AP-4 huet mat AP-4 siRNA transfection Grupp ofgeholl mee net an der Kontroll siRNA (Dorënner 1). D'siRNAs entschlof Ennerdréckung vun AP-4 Ausdrock hätt zu 24 Stonnen an der transfection nogewise ginn. Allerdéngs, ofgeholl d'inhibition Verhältnis 72 Stonnen no transfection. De stäerkste efficace Zäit Punkt waren tëscht 48 h bis 72 h am oofgesinn Ausdrock vun AP-4. Der relativer Niveau vun mRNA gët vill vun bal 90% vun siRNA-1 Grupp ofgeholl, a 95% vun siRNA-2 Grupp. Et war statistesch Bedeitung tëscht siRNAs Grupp an d'Kontroll Grupp. VerfÜgung

Down-Regulatioun vun AP-4 Ausdrock inhibited der Zell Prolifératioun a mënschlech Zellen gastric Kriibs sensitized zu anticancer Drogen VerfÜgung

Fir d'Wierkung vun ënnersicht AP-4 spezifesch siRNAs op Zell Prolifératioun an Chimio-Empfindlechkeet vun de Kriibs Zellen, 20 nm vun AP-4 spezifesch siRNAs oder Kontroll siRNA sech transfected an der Zell Prolifératioun war vun CCK-8 assay 48 Stonnen no transfection alles. Mir hu fonnt, datt knockdown AP-4 kéint d'Prolifératioun vu gastric Kriibs Zell Linnen SGC7901 an AGS (Dorënner 2) inhibit, mä net zu normal mucosa Zell Linn GES-1, wou mat der Kontroll siRNA transfection zu 48 Stonnen (Dorënner 2) am Verglach. Dës Resultater uginn dass AP-4 siRNAs der Zell Prolifératioun vu gastric Kriibs Zellen kënschtlech attenuated. Ausserdeem, ze propagéieren mir d'Roll vun AP-4 an d'Regulatioun vun der Chimio-Empfindlechkeet vun mënschlech gastric Kriibs Zellen. Mir Verglach der Drogenofhängeger Empfindlechkeet vun AP-4 siRNAs mat deem vun Kontroll siRNA oder mierkt Zellen a fonnt, datt d'famill inhibition Tariffer vun AP-4 spezifesch siRNAs dass vill méi héich waren, wéi vu Kontroll siRNA oder mierkt Zellen (p &Si besteet; 0.0001) (Dorënner 2 ). Zousätzlech, verstäerkte siRNAs AP-4 bedeitend der Empfindlechkeet vun Zellen ze ADR, 5-FU oder Well-plantinum Behandlung bei zwee anescht Dosis (Dorënner 2), dës ugeholl datt verwandelt-Regulatioun vun AP-4 engem virdeelhaft Effekt am hutt vläicht Empfindlechkeet vun Chimiotherapie goen. VerfÜgung

Silencing vun der AP-4 Ausdrock Zell Zyklus verhaft entschlof an modulated den Ausdrock vun p53, p21 an cyclin D1 VerfÜgung

den Effet vun AP-4 op Werdegang Zell Zyklus propagéieren war . Mënsch gastric Kriibs Zellen sech mat 20 nm Kontroll siRNA transfected, an der AP-4 spezifesch siRNAs fir 48 h, respektiv, vun propidium Kaliumiodid staining duerno an Flux cytometry Analyse vun Zell Zyklus. Während der Kontroll siRNA transfected Zellen duerch verschiddene Phasen vum Zell Zyklus lues, mat AP-4 spezifesch siRNAs transfected Zellen ugewisen bedeitend méi héich Frequenz vun Zellen am G0 /G1 Phasen (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) an engem nidderegen Frequenz vun Zellen am S-Phase (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). De Prozentsaz vun Zellen am G0 /G1 Phasen an der Zell mat AP-4 siRNAs transfected war méi héich wéi déi vun der mierkt Zellen (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p &Si besteet; 0,05) oder siRNA (SGC7901 /Kontroll Kontroll siRNA: 52,18%; AGS /Kontroll siRNA: 50,38%) (Well 3). Dofir, transfection mat AP-4-spezifesch siRNAs entschlof Zell cyclin verhaft um G0 /G1 Phasen. VerfÜgung

Den AP-4 spezifesch siRNAs entschlof Zell Zyklus Spär gouf weider observéieren de Folge vun AP-4 spezifesch siRNAs Behandlung propagéieren op der famill Ausdrock vun Zell Zyklus Legislateuren: d'entholl suppressor p53, déi cyclin ofhängeg kinase inhibitor p21, an de G (1) -phase-spezifesch cyclin D1, déi kritesch Reglementatioun vun der Zell Zyklus a Prolifératioun goufen. Véierzeg-aacht Stonnen Post-transfection, goufen Mënsch gastric Kriibs Zellen fir real-Zäit Hinnen alleguer an immunoblotting Analyse gesammelt. Transfection mat AP-4 spezifesch siRNAs kéint weider-regléieren den Ausdrock vun p53 an p21 FAQ. D'modulatory Effet vun AP-4 siRNAs war méi grouss wéi déi vun Kontroll siRNA (Dorënner 4) (p &Si besteet; 0.01). Wéi erwaart, huet cyclin D1 verwandelt-reegelen Verglach zu siRNA Grupp an mierkt Grupp (Dorënner 4) (p &Si besteet; 0.01) Kontroll. Dës Donnéeë ënnerstëtzt weider d'Hypothes, datt den Ausdrock vun AP-4 silencing den Ausdrock vun anere Zell Vëlos Legislateuren verännert entschlof Zell Zyklus verhaft an inhibited d'Prolifératioun vu mënschlechen gastric Kriibs Zellen VerfÜgung

Detektioun vun apoptosis an der Équipe Facteuren an der apoptosis Passerelle VerfÜgung

fir d'Wierkung vun AP-4 spezifesch siRNAs op apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen, Annexin-V an PI staining assays sech a Verbindung mat Flow cytometry benotzt ofgedonkelt. Zellen sech mat Annexin V-FITC /PI an gated an niddreg Recht (LR) an uewen riets (Ur) quadrants Kierchefënster. Zellen am LR an Ur sech als fréi apoptotic (Annexin + /PI -) gin an spéiden apoptotic (Annexin + /PI +) bzw.. Zellen am LL (niddreg Lénk) an UL (Ieweschte Lénk) quadrants sech als bzw. lieweg a necrotic gin. Mooss vun apoptosis war wéi d'Zomm insgesamt vun der Prozentzuelen am LR an Ur quadrants ausgedréckt. D'apoptotic Taux sech an Dorënner zougedréckt 5. Traité Zellen mat AP-4 siRNAs zougedréckt méi apoptotic Zellen (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) wéi déi negativ (SGC7901 /Kontroll siRNA: 5.5%; AGS /Kontroll siRNA: 6,7%) (p &Si besteet; 0,05) an eidel (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p &Si besteet; 0,05) . Dës Resultater weisen, datt AP-4 spezifesch siRNAs konnt sech apoptosis vun deenen Zellen ze induce. VerfÜgung

ervirgestrach, mir iwwerpréift den Ausdrock vu Facteuren an apoptosis Passerelle mat real-Zäit Hinnen alleguer zu mRNA Niveau Équipe, wéi BCL-2 , BCL-x _{L, Caspase-9, Caspase-8 an Bax. Et huet datt knockdown AP-4 hätt den Ausdrock vun Baspase-9 zu Mënsch gastric Kriibs Zellen up-regléieren, an der modulatory Effet vun AP-4 siRNAs war méi grouss wéi déi vun Kontroll siRNA (Dorënner 6) (p &Si besteet; 0.01). Den Ausdrock vun der BCL-2 an BCL-x L huet op d'Kontroll ofgeholl Verglach siRNA oder mierkt Grupp (Dorënner 6) (p &Si besteet; 0.01). Dës Donnéeë ënnerstëtzt weider, datt d'silencing vun AP-4 Ausdrock Nerve apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen. Allerdéngs huet den Ausdrock vun Caspase-8 an Bax verschiddene zu verschiddene Zell Reien transfection. Véierzeg aacht Stonnen no transfection, Caspase-8 an Bax sech iwwer Ausdrock vun AGS Zellen. An SGC7901 Zellen, fräi Meenungsäusserung vun Bax, mä den Ausdrock vun Caspase-8 fräi nëmmen zu siRNA-1 Grupp. An siRNA-2 Grupp, war Caspase-8 Ausdrock net bedeitend beaflosst (Dorënner 6). VerfÜgung}

AP-4 silencing konnt Zell Zyklus a Zell apoptosis Souwuel p53-ofhängeg an onofhängeg-Manéieren VerfÜgung

fir z'iwwerpréiwen ob den weider-Regulatioun vun p53 zu AP-4 knockdown Zellen gastric Kriibs un der Roll vun Zell Zyklus verhaft kritesch war, Kato-III Zellen, eng Zort war gastric Kriibs Zell Linn p53 Mängel benotzt der Ofhängegkeet vun AP ze diskutéieren -4 knockdown Effekt op p53. Mir hu fonnt, datt knockdown vun AP-4 zu AGS mat Wëld-Typ p53 oder SGC7901 mat Mann- p53 konnt Zell Zyklus verhaft induce, mä dëst Phänomen war net vun Kato-III Zellen (Dorënner 7), de Prozentsaz vun Zellen am G0 /G1 observéiert Phasen huet 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (Kontroll siRNA) an 59,06% (mierkt). Déi uginn datt knockdown AP-4 vläicht Zell Zyklus vun heescht vun p53-p21 Passerelle regléieren. Apoptosis Bevëlkerung war och vun Kato-III Zellen mat Annexin V-FITC an PI staining fonnt. D'Resultater weisen, dass den apoptosis Taux vun Kato-III Zellen transfected mat AP-4 siRNAs (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) war méi héich wéi d'Kontroll siRNA (3,3%) (p &Si besteet; 0,05) an mierkt Zellen (3,5%) (p &si besteet; 0,05), mee op enger klenger Mooss wéi et op der AGS huet (p &si besteet; 0,05) an SGC7901 Zellen (p &si besteet; 0,05), wat beweist, datt silencing AP-4 duerch apoptosis zu gastric Kriibs Zellen induce kéint souwuel p53-ofhängeg an onofhängeg-Manéieren. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Gene Ausdrock ass eng fundamental a héich conserved Prozess. Transkriptioun, déi éischt Schrëtt an der Gentherapie Ausdrock, ass vun der Struktur conserved DNA ofhängeg RNS polymerases gesuergt, deen aus engem DNA Skelett vun der Synthes vun engem RNS Protein Resultater [31]. Transkriptioun Faktoren, Form Transkriptiouns Initiatioun Komplex mat RNS polymeras II, an de Prozess vun Transkriptiouns Initiatioun matmaachen Gentherapie Ausdrock ze regléieren. Si kënnt duerch Regulatioun Transkriptiouns an dofir Gentherapie Ausdrock eng wichteg Roll am Wandel, tumorigenesis, entholl Werdegang an Metastasen Leeschtung [32], [33], [34]. Transkriptioun Faktor AP-4, gehéiert zu dem Kontext Grupp vun HLH Proteinen [8] an dat a bewosst Prolifératioun Équipe ass [35], [36], [37], [38], [39], schellt Evenementer Zell Zyklus a apoptosis, reguléieren a Kontrollen puer Gentherapie Ausdrock [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Viru Kuerzem, huet et schonn erwähnt, datt AP-4 war bis-reglementéiert Colon carcinoma, Broscht Kriibs an Aarbecht Kriibs [9], [18], [24]. Zousätzlech, uginn AP-4 positiven Ausdrock aarmséileg hätt mat Bedeitung iwwer Schouljoer, Node Statut oder Gréisst am ËH + Broscht Kriibs, an eng méiglech Associatioun mat Chimio-Empfindlechkeet [40]. An eiser virdrun studéieren, hu mir dat den Ausdrock vun AP-4 fonnt overexpressed huet an et mat engem aarme hätt-Co Zesummenhang [30]. Et kann ee molekulare Bewaacher fir Diagnos an hätt vun gastric Kriibs ginn. Am Moment studéieren ,. Mir entworf zwee AP-4 spezifesch siRNAs den Ausdrock vun der AP-4 Gentherapie zu Mënsch gastric Kriibs Zellen ze inhibit. Si ware gutt etabléiert a transfected an Zellen an hummeren-Ugrëff vun AP-4 Gentherapie Ausdrock ze Resultat. Mir hunn erausfonnt, datt d'mächtegst Zäit Punkt vum AP-4 Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen zu suppressing goufen 48 h an 72 h der transfection. Sou, konnt mir de fréiere fir weider Zesummenhang Ënnersichung gräift. VerfÜgung

Virdrun, ass et dass Transkriptiouns Faktor AP-4, am Géigesaz zu anere HLH Proteinen gewise goufen, enthale zwou verschidde leucine widderhuelen Elementer déi och direkt dimerization an erlaben de selektiv komplex Équipe vun onbeléifte AP-4 FAQ [8], [41]. VerfÜgung

AP-4 hätt eng wichteg Roll an modulation vun bewosst Funktiounen via Regulatioun vun Genen Équipe an Haren Produktioun [7], [16 Leeschtung ], [22], [42], [43], Zell Wuesstem an Iwwerliewe [9], [17], [23], [44], immun Äntwert [14], [41], [45], an angiogenesis [21]. Peter Jung, et al fonnt dass AP-4 kéint ee c-MYC-inducible repressor gerannt zu p21 Ausdrock inhibit [9], an huet wuel eng wichteg Roll an der proliferative Aktivitéit vun c-MYC mediating [10]. Zousätzlech, AP-4 beaflosst der Empfindlechkeet op apoptosis vun den Ausdrock vun Caspase-9 Regulatioun [17]. An dëser Etude, hunn mir dat erof-Regulatioun vun AP-4 d'Prolifératioun vu mënschlechen gastric Kriibs Zellen kënschtlech inhibited. Der Prolifératioun inhibition Verhältnis vun AP-4 spezifesch siRNAs war wesentlech méi déif wéi déi vun der mat Kontroll siRNA oder mierkt Grupp transfected Zellen. VerfÜgung

Chimiotherapie ass eng wichteg Strategie vun der Behandlung vun gastric Kriibs, mä et klappt oft well vun der Resistenz ze anticancer Drogen. Et gouf gemellt, datt AP-4 positiven Ausdrock eventuell mat Chimio-Empfindlechkeet [40] verbonne war. Mir propagéieren nächst der Roll vun AP-4 an d'Regulatioun vun der Chimio-Empfindlechkeet vun mënschlech gastric Kriibs Zellen an fonnt dass inhibition vun AP-4 konnten der Empfindlechkeet vun deenen Zellen ze ADR, 5-FU oder Well-plantinum Behandlung däitlech verbesseren, proposéiert datt inhibition vun AP-4 vläicht eng positiv Wierkung vun Chimio-Empfindlechkeet hunn. VerfÜgung

Zousätzlech, silencing vun AP-4 entschlof verhaft Zell Zyklus um G0 /G1 Phasen, Analyse vun engem Potential Mechanismen Basisdaten d'Auswierkunge vun der AP-4 silencing op inhibition vun mënschlech Prolifératioun gastric Kriibs Zell sech duerch d'Expressioun vun Zell Zyklus-Zesummenhang mat der Reglementatioun charakteriséiert. Mir hu fonnt, datt verwandelt-Regulatioun vun AP-4 Ausdrock den Ausdrock vun cyclin D1 inhibited, mä den Ausdrock vun p53 an p21 up-reegelen. p53 an p21 eng negativ regulator vun der Zell Zyklus a Prolifératioun ze ginn [46], [47], op der aner Hand, cyclin D1 gefördert Werdegang duerch d'G _{1-S Phase vun der Zell Zyklus Hypothes ass [48 ]. Down-reegelen Ausdrock vun AP-4, p21 an p53 an der Tëschenzäit konnt d'Zell Zyklus verhaft maachen ëmmer knockdown vun AP-4 Ofbau. Des Resultater sinn am Accord mat e Modell an déi AP-4 vun Regulatioun den Ausdrock vun Zell Zyklus Reglementatioun, wéi p53, p21 an cyclin D1. VerfÜgung}

Apoptosis, oder programmed Zell Doud, Zell Zyklus verhaft induces ass bekannt zu verschiddene biologesche Prozesser déi zwee Haaptgrënn apoptotic Édouard de Kënschtlech (Ausriichtung) Passerelle an den Doud receptor (extrinsic) Passerelle [49] un. Mir hunn erausfonnt, datt d'AP-4 Ausdrock apoptosis an eiser Experimenter trigged Zell silencing, déi bewisen, dass AP-4 apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen opgeléist. VerfÜgung

An eiser Experimenter, waarden Niveau vun Caspase-9 an Ugrëff-Regulatioun vun BCL-2 an BCL-x _{L waren am mënschleche gastric Kriibs Zellen fonnt, souwuel déi knockdown vun AP-4 ageschalt Ausriichtung an extrinsic Weeër ze apoptosis zu Kriibs Zellen ugëtt. [49], [50] VerfÜgung}

Am Resumé, beweisen d'Daten déi RNAi-mediated verwandelt-Regulatioun vun Transkriptiouns Faktor AP-4 effektiv der Zell Prolifératioun inhibited, uginn verhaft Zell Zyklus, ausgeléist apoptosis an verstäerkte Chimio-Empfindlechkeet vum Mënsch gastric Kriibs Zellen mat der ofgeholl Ausdrock vun cyclin D1, BCL-2 an BCL-x _{L an ageschalt p21, p53 an Caspase-9 Ausdrock, déi proposéiert AP-4 vläicht e oncogene ginn eng wichteg Roll an tumorigenesis spillen . Obwuel déi genee Mechanismus vun dëser Roll weider propagéieren gin brauch, kann den AP-4specific-siRNAs fir Mënscherechter gastric Kriibs als Roman therapeutesch Agenten vun Potential Wäerter ginn. VerfÜgung}

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Linn an Zell Kultur VerfÜgung

Mënscherechter gastric Kriibs Zell Linnen AGS mat Wëld-Typ p53, SGC7901 mat Mann- p53 (kritt vu Wuhan University) a Kato-III mat p53 Nepgen Läschen (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) waren cultured zu DMEM mëttel- oder RPMI1640 mëttelfristeg (Invitrogen) mat 10% an et Bovine serum (Invitrogen) wouvun, penicillin (100 U /ml) an streptomycin (100 μg /ml). Zellen sech op 37 ° C an enger humidified Atmosphär vu 5% CO _{2 haten. VerfÜgung}

Spezifësch siRNA an transfection VerfÜgung

D'cDNA Haaptrei vun der AP-4 Gentherapie aus Genbank kritt huet ( NM_003223) an de Reklamme Message vun zwou 21-Nukleotid verschiddene siRNAs sech entwéckelt a chemesch Wierderbuch (QIAGEN Däitschland). D'Nukleotid Message sech wéi follegt zesummen: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 "(Sënn), an 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3" (antisense). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 "(Sënn), an 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3" (antisense). Allstars negativ Kontroll siRNA (QIAGEN Däitschland) huet als eng Jacquerie siRNA Kontroll benotzt. Zellen sech zu 6-gutt Placke plated an der siRNAs sech an der Kultur Zellen mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfected no der Taktik vum Produzent. VerfÜgung

Real-Zäit grouss Hinnen alleguer VerfÜgung

Total RNS Extraktioun Leeschtung war Hëllef RNAiso Plus (Takara, Japan) no de Protokoll d'Hiersteller. D'cDNAs aus total RNS sech Wierderbuch benotzt PrimeScript® RT reagent Kit (Takara, Japan). D'mRNA Ausdrock war vun real-Zäit Hinnen alleguer op en Abi StepOne Plus (Obwuel Biosystems, Singapur) mat Fast SYBR Green Hinnen alleguer reagents bewäert. GAPDH war wéi d'intern Kontroll applizéiert. D'Konzentratioun vun der reagents sech eng final Volume vun 20 μL, wouvun 2 μL ëmgedréint-ausserdeem Produit, 10 μl vun Fast SYBR® Green Master Mix (Obwuel Biosystems, Foster City, CA), an 0,5 μl vun 10 μM vir ze erreechen ugepasst an ëmgedréint primers. D'Reaktioun war fir 3 s vun 45 amplification Zykle vun 95 ° C duerchgefouert an 60 ° C fir 30 ass. Déi folgend primers goufen ugeluecht (Table.1). Hinnen alleguer primers sech duerch Primer 5.0 an Blast Sich entworf Spezifizitéit ze kontrolléieren. Primer Message benotzt ginn zu Bedeitung opgezielt 1. D'Resultater vun benotzt 2 berechent huet -ΔΔCt Method. VerfÜgung

Western blot VerfÜgung

Protein war mat FAQ Extraktioun Kit Quecksëlwer (Beyotime, China) no zu der Direktioun. D'FAQ war bis 3 μg /μl verdënntem a gouf vun 10% SDS-PAGE, transferéiert ze polyvinylidene difluoride (PVDF) Schläimhait (Millipore, USA) getrennt, an dann an 5% Nët-Fett powdered Mëllech an TBST fir 1 Stonn gespaart gouf bei Raumtemperatur. Immunoblotting war mat Anti-AP-4 antibody (Fläch-Aldrich, Shanghai, dilution 1:1000) gesuergt, anti-p21 antibody (Fläch-Aldrich, Shanghai, dilution 1:1000), anti-p53 antibody (Abcam, UK, dilution 1:500) an Anti-cyclin D1 antibody (Abcam, UK, dilution 1:500) Iwwernuechtung bei 4 ° C. No dräi Mol mat TBST rinsed, war d'Membran mat horseradish peroxidase-conjugated Secondaire antibodies (dilution 1:2000, Boster, China) fir 1 Stonn bei Raumtemperatur incubated. D'Resultat war vun der ECL Plus Western blotting erkennen System visualized no den Instruktioune vum Produzent. Anti-β-actin (dilution 1:1000, Boster, China) antibody Verdeedegung intern Kontroll. VerfÜgung

Kilometréierung vun Zell Prolifératioun VerfÜgung

Den Impakt vun silencing AP-4 op der gastric Kriibs Zell Prolifératioun no 48 Stonnen vun transfection war vun Zell Counting Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, China) gemooss ginn, laut der Uweisunge d'Hiersteller. Kuerz, goufen gastric Kriibs Zellen cultured zu 96-gutt Placken a mat 20 nm vun Kontroll siRNA, AP-4 spezifesch siRNAs transfected. No 48 Stonnen, war 10 μl vun CCK-8 reagent fir all gutt notéiert, no 1 Stonn vun incubation bei 37 ° C, de absorbance bei 450 nm gemooss. Der relativer Niveau vun Zell Prolifératioun vun all Grupp vun Zellen no folgend Formule berechent war: R = (A2-A1) /A2 × 100% an P = A1 /A2 × 100% vun deem R war relativ inhibitory Taux an P war relativ Prolifératioun Verhältnis vun Zell Wuesstem; A1was mengen absorbance Wäert vun transfected Zellen; an A2 war mengen absorbance Wäert vun untransfected Kontroll Zellen ouni Drogenofhängeger Behandlung. All Experiment mat 5 Wells pro Experimenter gemaach an widderholl mannst dräi Mol. VerfÜgung

Zell Zyklus Assay VerfÜgung

BTS 48 Stonnen no transfection gesammelt goufen an Iwwernuechtung zu 70% Äis-kal Ethanol fix, Katakombe mat 1 × PBS, a fir 30 Minutten mat propidium Kaliumiodid (PI) (50 μg /ml) an 1 × PBS ergänzt mat RNase (50 μg /ml) geschriwwen. Tester goufen fir all Prouf an triplicate gesuergt, an Analysë vun Flux cytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) am Aklang mat den Hiersteller d'Richtlinne gesuergt huet. VerfÜgung

Chimio-Empfindlechkeet Test kënschtlech VerfÜgung

wéi virdru beschriwwen, war CCK-8 assay ze bewäerten Effet vun der Chimio-Empfindlechkeet vun gastric Kriibs Zellen benotzt Drogen ze anticancer. An dowéinst, sechs Stonnen nom transfection, war déi mëttel- ofgegruewen an ersaat duerch frësch mëttelfristeg verännerlech Konzentratioune vun Anti-entholl Drogenofhängeger (ADR, 5-FU oder Well-Platin) an incubated fir 48 Stonnen mat. Relativ inhibitory Taux vun Zell Wuesstem berechent gouf no der Formel uewen opgezielt. VerfÜgung

Apoptosis assay vun Annexin V-FITC an propidium Kaliumiodid (PI) staining VerfÜgung

den Taux vun Zell apoptosis ze bewäerten, apoptosis war vun annexin-V-FITC an propidium Kaliumiodid duebel staining mat engem Annexin-V /FITC Kit (Antgene, China) laachen. Zellen sech no der Taktik vum Fabrikant gesammelt 48 Stonnen no transfection, mat kal PBS gewäsch, an zu verbindlechen gefiermt Sursis, an dann huet den Zellen 30 Minutten an der donkel bei 4 ° C mat Annexin V-FITC an PI zu phosphate gefiermt incubated an analyséieren op de Flux cytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) bannent 1 h der staining. VerfÜgung

statistique Analys VerfÜgung

sech als mengen All Donnéeën dës ± Fils. Ënnerscheed tëschent Gruppe war duerch ee-Manéier ANOVA a Student-Newman-Keuls (SNK) -q Test mat engem SPSS 12,0 fir Windows Software analyséiert. Statistique Bedeitung huet den * p &Si besteet definéiert; 0,05 an ** p &Si besteet;. 0,01 VerfÜgung

Arbeschterlidder VerfÜgung

Mir Merci Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Waart an Li Wei fir hir Expert technesch Assistenz . VerfÜgung

• PLOS NËMMEN: langfristeg Resultater an Prognostic duerstellt Gastric Cancer kennen mat Microscopic Peritoneal Carcinomatosis
• PLOS NËMMEN: Risk Assessment vun Gastric Cancer déitlech Helicobacter pylori Ausschöpfung CagA liichtkraaftarm Markers